唐雪梅，魏琪，陳璐，國錦琳

(成都中醫(yī)藥大學藥學院，中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137)

“逢子必炒”是古今中藥炮制界流傳的一句口訣，即諸子類藥材皆要炒后才能入煎。這里的“子”類藥材，主體泛指帶“子”字的種子類藥材和部分果實類藥材[1]。考證歷代本草，關(guān)于“逢子必炒”的記載最早見于明代羅周彥所著《醫(yī)宗粹言》。該書諸藥制法項下言 ：“決明子、蘿卜子、芥子、蘇子、韭子、青葙子，凡藥中用子者，俱要炒過研碎入煎，方得味出，若不碎，如米之在(谷)，雖煮之終日，米豈能出哉！”[2]傳統(tǒng)中藥炮制理論認為種子類中藥炒制主要有以下幾個目的：①利于有效成分的溶出，提高藥效；②高溫條件下，能夠破壞或轉(zhuǎn)化毒性成分，降低藥物毒性；③改變或緩和子類中藥的性能，減少副作用；④殺酶保苷，通過滅活酶類，保存苷類有效成分；⑤除去非藥用部位，保證藥材凈度[3-5]。上述理論得到中藥炮制界的普遍認可。子類藥材在炮制過程化學成分具體發(fā)生了哪些變化？目前已有學者對部分子類藥材炒制過程中酚酸類[6-7]、苷類[8-10]、生物堿類[11-13]、醌類[14-16]、脂肪油類[17]成分的變化進行了研究，發(fā)現(xiàn)子類藥材在炒制過程中，化學成分發(fā)生了復雜的變化，既有量變也有質(zhì)變，且成分變化有一定的共性規(guī)律。

蛋白質(zhì)是子類藥材中普遍存在且含量較高的一類化學成分。蛋白質(zhì)作為植物最重要的初生代謝產(chǎn)物之一，不但在植物生長、發(fā)育、代謝、能量轉(zhuǎn)換、信號傳導等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，多種種子蛋白已被證實具有重要的藥理活性，如桃仁蛋白、決明子蛋白、蓖麻毒蛋白等。但由于蛋白質(zhì)類成分構(gòu)象復雜，加工貯藏過程中易降解變性，研究難度大、成本高等原因，現(xiàn)階段子類藥材的蛋白質(zhì)類組分研究在中藥化學領(lǐng)域長期處于落后狀態(tài)。目前尚未見有關(guān)子類藥材炒制前后蛋白質(zhì)類成分變化的相關(guān)研究報道。

基于上述情況，本課題選取了酸棗仁、牛蒡子、王不留行、牽牛子、決明子等五種藥材，采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium Dodecyl Sulphate-polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE)技術(shù)，分析上述五種藥材在炒制前后蛋白質(zhì)成分的變化，為后期深入研究子類中藥炮制機理奠定基礎(chǔ)。

1 實驗材料與設(shè)備

1.1 藥材

酸棗仁、牛蒡子、王不留行、決明子、牽牛子等藥材生品均購自成都荷花池中藥材市場，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學中藥資源與鑒定系龍飛副教授鑒定確認，分別為鼠李科植物酸棗ZizyphusjujubaMill. var.spinosa(Bunge)Hu ex H. F. Chou的干燥成熟種子，菊科植物牛蒡ArctiumlappaL.的干燥成熟果實，石竹科植物麥藍菜Vaccarrasegetalis(Neck.)Carcke的干燥種子，豆科植物決明CassiaobtusifoliaL.的干燥成熟種子，旋花科植物圓葉牽牛Pharbitispurpurea(L.)Voigt的干燥成熟種子。取上述五種藥材生品，參照《中國藥典》2015年版[18]對上述五種藥材的炮制方法進行炒制，備用。

1.2 主要試劑

Acrylamide(Merck公司，批號：502B0310)；SDS(Biosharp公司，批號：L-5750)；低分子量蛋白Marker(Thermo scientific公司，批號：00536738)；牛血清白蛋白BSA(純度≥98%，Bio-rad公司，批號：970825B)；Chaps(Solarbio，批號：321B043)；DTT(Solarbio，批號：D8220)；TEMED(北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司，批號：73000113)；考馬斯亮藍R-250、溴酚藍均購自鵬程生物。

1.3 儀器

Powerpac 200電泳儀(Bio-rad公司)；Mini-PROTEAN 3小型垂直電泳槽(Bio-rad公司)；高速低溫冷凍離心機Sorvall Legend Micro 21(Thermo Scientific公司)；高速離心機(Thermo Scientific公司)；BSA124S電子天平(Sartorius公司)；全波長多功能酶標儀(Thermo Scientific公司)；ImageScanner III凝膠掃描成像系統(tǒng)(GE公司)。

2 方法

2.1 蛋白質(zhì)的提取

采用水煎煮和裂解液提取兩種方法提取樣品蛋白質(zhì)。

2.1.1 水煎煮法

炒制前后兩種樣品分別打粉，過四號篩。取粉末10 g，加10倍量的水，煎煮30 min；過濾收集提取液，繼續(xù)加10倍量的水煎煮30 min，同樣過濾收集提取液，合并提取液。

2.1.2 裂解液提取法

樣品各0.4 g，液氮研磨成細粉，加入裂解液2 mL，研磨浸提后轉(zhuǎn)入離心管，低溫離心30 min(16 000×g，4℃)；取上清液，再次離心30 min，取上清液，得粗蛋白液。取粗蛋白液，加10倍體積TCA-丙酮(10%TCA、0.07%DTT，-20℃預冷)，-20℃靜置1 h后離心10 min(16 000 g，4 ℃)，沉淀用預冷丙酮反復洗滌、離心4次，置通風干燥處晾干后，加裂解液溶解，即為各樣品蛋白質(zhì)提取液。

2.2 蛋白質(zhì)的含量測定

取各蛋白提取液，采用Bradford法檢測蛋白質(zhì)含量。

2.3 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳[19]

采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析樣品蛋白組成。

2.3.1 工作液的配制

蛋白質(zhì)裂解液：4.2 g尿素，1.52 g硫脲，0.4 g Chaps，0.4 g DTT(現(xiàn)加)，加水定容至10 mL，分裝，-20 ℃保存；TCA-丙酮：20 g三氯乙酸，0.14 g二硫蘇糖醇，加丙酮定容至200 mL，-20℃預冷；電泳緩沖液：3.0 g Tris堿，14.4 g甘氨酸，1.0 g SDS，加水定容至1 000 mL；5×Loading Buffer：1 mol/L Tris-HCL(pH6.8)0.6 mL，50%甘油2.5 mL，10% SDS 2 mL，β-巰基乙醇0.5 mL，1%溴酚藍1 mL，加水定容至10 mL；脫色液：95%乙醇250 mL，冰乙酸80 mL，加水定容至1 000 mL；染色液：0.29 g考馬斯亮藍R-250，加脫色液定容至250 mL。

2.3.2 膠的制備與電泳

按表1數(shù)據(jù)配制濃縮膠和分離膠，取各樣品蛋白質(zhì)提取液制樣、上樣，電泳后染色、脫色。

表1 凝膠配方 mL

3 結(jié)果

3.1 蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果

采用兩種方法分別提取樣品蛋白質(zhì)后，含量測定結(jié)果可見，裂解液研磨提取法提取效率遠高于水煎煮法，后期蛋白質(zhì)電泳研究所用樣品液均采用裂解液研磨法進行提??；炒制品蛋白質(zhì)提取效率高于生品，炒制可提高蛋白質(zhì)提取率(見表2、表3)。

表2 各樣品蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果(裂解液提取) mg/g

表3 各樣品蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果(水煎煮提取) mg/g

3.2 標準蛋白分子量標準曲線的繪制

取蛋白質(zhì)Marker進行SDS-PAGE，染色、脫色后，以標準蛋白分子量對數(shù)(lgM)對其在分離膠中的遷移率進行線性回歸，得到回歸方程：Y=-1.210 8X+2.155 2(r=0.990 1)。如圖1所示。

3.3 各樣品電泳結(jié)果

五種藥材生品與炒制品SDS-PAGE圖譜均差異明顯，生品蛋白質(zhì)圖譜均條帶豐富，炒制后電泳條帶數(shù)量明顯減少或消失，且背景深、彌散。酸棗仁生品在分子量25 kDa、20 kDa、17 kDa附近均有清晰條帶，炒制品25 kDa、20 kDa條帶消失；牛蒡子在分子量33 kDa、20 kDa附近有清晰條帶，炒制品這些條帶消失；王不留行生品在分子量50 kDa、36 kDa、28 kDa、18 kDa、14 kDa、12 kDa附近均有清晰條帶，炒制品這些條帶均消失，且背景彌散、拖尾；決明子生品蛋白質(zhì)條帶豐富，在分子量110 kDa、80 kDa、60 kDa、50 kDa、42 kDa、30 kDa、25 kDa、23 kDa、20 kDa、18 kDa、12 kDa附近均有清晰條帶，炒制后無明顯條帶，呈彌散狀；牽牛子生品蛋白質(zhì)條帶分布在10～95kDa，在分子量72 kDa、55 kDa、43 kDa、30 kDa、19 kDa附近均有清晰條帶，炒制品在72 kDa、55 kDa、43 kDa、19 kDa附件條帶均消失。各樣品SDS-PAGE電泳圖譜見圖2。

圖1 標準蛋白質(zhì)Marker電泳圖及標準曲線

注：電泳圖從左至右分別為Marker、1～2列為生品、3～4列為炒制品

4 討論

本課題以酸棗仁、牛蒡子、王不留行、決明子、牽牛子五種子類藥材為研究對象，分析炒制前后蛋白質(zhì)的變化，結(jié)果表明：(1)炒制能提高蛋白質(zhì)提取率，這從一定程度上驗證了古人通過炒制提高藥效物質(zhì)煎出的思路；(2)炒制能顯著改變子類藥材蛋白質(zhì)的組成，5種藥材炒制后低分子量蛋白質(zhì)條帶(10～180kDa)多樣性均明顯減低，多個在生品中清晰可見條帶消失。這可能是由于炒制過程中高溫導致蛋白質(zhì)的二級機構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)改變或破壞，溶解度降低，不能被裂解液所提??；或者是高溫導致蛋白質(zhì)變性分子結(jié)構(gòu)松散，被體內(nèi)蛋白酶快速水解所致。

目前，對“逢子必炒”炮制機理的研究多集中在炒制前后化學成分的變化和藥理活性、功效的變化方面，究竟是哪些成分的變化導致了藥理活性及功效的變化？這些化學成分和藥理活性、藥效之間的關(guān)聯(lián)性如何？如何利用現(xiàn)有的機理研究結(jié)果指導中藥炮制過程？目前的研究進展還遠遠不夠。因此，后期應(yīng)繼續(xù)加強基礎(chǔ)研究，揭示炒制前后化學成分和功效的變化規(guī)律及其相關(guān)性，為更好的指導、控制中藥炮制過程奠定基礎(chǔ)。