王福貴 王小蝶 余維麗 孫昀
摘要 目的 研究小的非編碼RNA(miRNAs)miR-15b-5p對在雨蛙素處理下的大鼠胰腺外分泌細(xì)胞AR42J細(xì)胞凋亡的影響。方法? 在體外利用雨蛙素誘導(dǎo)AR42J細(xì)胞創(chuàng)建胰腺炎模型 ,并利用qRT-PCR和Western blot測定使用miR-15b-5p inhibitor和mimics后細(xì)胞內(nèi)Caspase-3及Caspase-9的mRNA和蛋白質(zhì)相對表達(dá)水平;采用流式細(xì)胞術(shù)來測定各組細(xì)胞的凋亡狀況。結(jié)果? 在使用miR-15b-5p inhibitor后,細(xì)胞凋亡有關(guān)基因組中Caspase-3及Caspase-9的mRNA相對表達(dá)水平和蛋白質(zhì)相對表達(dá)量減少,而細(xì)胞凋亡率相對降低(P<0.05);而使用miR-15b-5p mimics后,Caspase-3及Caspase-9的mRNA相對表達(dá)水平和蛋白質(zhì)相對表達(dá)量上升,細(xì)胞的凋亡率升高(P<0.05)。結(jié)論? miR-15b-5p inhibitor能夠減少由雨蛙素所誘發(fā)的胰腺外分泌細(xì)胞凋亡,表明它可能是防治急性胰腺炎有效的潛在靶點(diǎn)。
關(guān)鍵詞:miR-15b-5p;AR42J細(xì)胞;急性胰腺炎;細(xì)胞凋亡。
中圖分類號 R 34
急性胰腺炎(Acute pancreatitis, AP)是一種典型的胃腸疾病,以胰腺外分泌細(xì)胞中胰蛋白酶原的特異活化以及隨后胰臟的自我消化過程為特征,引起胰臟腺泡損傷、強(qiáng)烈的全身性炎癥反應(yīng)和多器官衰竭。胰臟炎癥及腺泡細(xì)胞的壞死和凋亡是AP主要的病變特征。雖然AP檢查和處理技術(shù)目前已經(jīng)有所提高,但大約20%的胰腺炎病人仍可發(fā)展為中度至重癥急性胰腺炎(Severe acute pancreatitis,SAP),SAP發(fā)病迅速,其病人死亡比例可高達(dá)30%。所以對AP發(fā)病機(jī)制有更準(zhǔn)確的認(rèn)識,對開發(fā)更好的治療措施至關(guān)重要。
MicroRNA(miRNA)是一類內(nèi)源性、高度保守、單鏈非編碼RNA,可以通過識別并于靶基因的非轉(zhuǎn)錄3'-非轉(zhuǎn)錄區(qū)域(3' UTR)互補(bǔ)和配對,進(jìn)而導(dǎo)致靶基因分解或翻譯過程的調(diào)控。大量的科學(xué)研究也已證明,miRNA在細(xì)胞發(fā)育、分化、增殖、凋亡等多種生物活動中發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用。miR-15b-5p是一個(gè)成熟的miRNA,剪切于pro-mir-15b的5'端,位于3號染色體長臂。已知mir-15b-5p在帕金森、直腸癌等中上調(diào),而在甲狀腺瘤和糖尿病腎病中低表達(dá)。然而,mir-15b-5p在AP中的生物學(xué)功能及其機(jī)制尚不清楚。
研究擬探討miR-15b-5p在大鼠胰腺外分泌細(xì)胞AR42J細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制,以期為研究AP發(fā)病機(jī)制和臨床診斷提供新的理論研究和思路。
1材料與方法
1.1主要試劑與材料
大鼠腺胰腺外分泌細(xì)胞AR42J購于上海富衡細(xì)胞庫。miR-15b-5p的inhibitor和mimics及陰性對照均購于新貝(上海)生物科技有限公司。Lipofectamine 2000購于美國Life Technology公司。Opti-MEM(x1)培養(yǎng)基購買于美國Gibco公司。雨蛙素干粉購買于北京索萊寶科技有限公司;qRT-PCR試劑盒購買于日本Takara公司。Caspase-3、Caspase-9及 β-Actin抗體均購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。Annexin-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒購于上海七海復(fù)泰生物科技有限公司。
1.2 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
預(yù)熱含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基,從液氮罐中拿出凍存有AR42J細(xì)胞的凍存管,于水浴鍋內(nèi)完全溶解,在無菌操作臺內(nèi),用1ml含10%胎牛血清的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,將細(xì)胞種于培養(yǎng)瓶內(nèi),放置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2-3天進(jìn)行一次細(xì)胞傳代。待其生長至對數(shù)生長期時(shí),將用胰酶消化液(0.25%胰酶)消化重懸好的細(xì)胞直接接種于六孔板中,使細(xì)胞生長至60%-80%匯合度后,于避光條件下使用Lipofectamine 2000試劑進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染24小時(shí)。分別記為:A: 空白對照組(不做任何處理的AR42J細(xì)胞)、B: miR-15b-5p mimics NC組 、 C: miR-15b-5p mimics組、D: miR-15b-5p inhibitor組、F: miR-15b-5p inhibitor NC組。
1.3 qRT-PCR測定各組細(xì)胞中miR-15b-5p miRNA相對表達(dá)水平
取出轉(zhuǎn)染好的所有組細(xì)胞,用TRIzol試劑提取出細(xì)胞中的全部RNA。用紫外線分光光度計(jì)檢測miRNA濃度和純度,合格后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:25℃、5min,50℃、15min,85℃、5s。合成cDNA以預(yù)備使用。按照表1中所示引物序列,采用熒光定量PCR擴(kuò)增儀,根據(jù)以下要求完成熒光定量PCR反應(yīng),即95℃、30s預(yù)變性;95℃、5s,60℃、20s,共四十個(gè)循環(huán);95℃、1s,60℃、15s,95℃、5s,在反應(yīng)結(jié)束后,以 U6基因?yàn)閮?nèi)參照,計(jì)算miR-15b-5p相對表達(dá)含量,見圖1。
1.4雨蛙素造模
轉(zhuǎn)染成功后,用雨蛙素(100 nmol/L)刺激24 h,誘導(dǎo)好的細(xì)胞可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為6組,分別記為:空白對照組(不做任何處理的AR42J細(xì)胞)、雨蛙素組、 雨蛙素+miR-15b-5p mimics NC組 、 雨蛙素+miR-15b-5p mimics組、雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor NC組、雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor組。再次測定各組細(xì)胞中miR-15b-5p miRNA相對表達(dá)水平,計(jì)算miR-15b-5p相對表達(dá)含量,見圖2。
1.5 qRT-PCR測定各組細(xì)胞中細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Caspase-3和Caspase-9 相對mRNA相對表達(dá)水平
取出轉(zhuǎn)染并造模后的各組細(xì)胞,使用TRIzol試劑提取出細(xì)胞中的全部RNA。用紫外線分光光度計(jì)檢測RNA濃度和純度,合格后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,合成cDNA以預(yù)備使用。按照表2中所示引物序列,采用熒光定量PCR擴(kuò)增儀根據(jù)以下要求完成熒光定量PCR反應(yīng),即95℃、30s預(yù)變性;95℃、5s,60℃、20s,共四十個(gè)循環(huán);95℃、1s,60℃、15s,95℃、5s,在反應(yīng)結(jié)束后,以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參照,計(jì)算Caspase-3及Caspase-9的mRNA相對表達(dá)含量。見圖3。
1.6Western blot法測定細(xì)胞中細(xì)胞凋亡關(guān)鍵蛋白Caspase-3和Caspase-9的相對表達(dá)水平
取出之前處理好的各組細(xì)胞,使用RIPA裂解液裂解細(xì)胞,同時(shí)予以蛋白酶抑制劑抑制蛋白降解,獲得總蛋白質(zhì)后,用BCA檢測試劑盒完成蛋白定量分析。之后進(jìn)行凝膠電泳及對應(yīng)蛋白分子的轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后,在含5%脫脂奶粉的TBST溶液中,慢搖并于室內(nèi)溫度下封閉PVDF膜約2 h,再用TBST溶液洗滌浸泡3x10 min。在相對應(yīng)的一抗抗體中4℃孵育過夜。第二天再用TBST沖洗3x10 min,然后在相對應(yīng)的二抗中孵育條帶1 h左右,最后再用TBST沖洗3x10 min。然后用ECL化學(xué)發(fā)光底物顯影檢測對應(yīng)的蛋白質(zhì),最后用Image-J處理圖像,以β-Actin為內(nèi)參計(jì)算其蛋白質(zhì)相對表達(dá)量。
1.7流式細(xì)胞儀測定各組細(xì)胞的凋亡狀況
取已處理好的所有組細(xì)胞,加入胰酶(不含EDTA)適度消化,吹離細(xì)胞后,予以500 g離心力離心5 min,將細(xì)胞收集,并吸去上清,加入1 ml PBS溶液再次洗滌細(xì)胞,然后將加入PBS溶液的細(xì)胞于500 g離心力下離心5 min,再次吸去上清,再加入400 μl Binding Buffer吹勻細(xì)胞,每組加入5 μl 的Annexin V-FITC試劑,在室溫下靜置約15 min,再加入10 μl的PI試劑,避光冰浴靜置5 min。在30 min內(nèi),使用CytoFLEX流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡狀況測定,并用CytEepert軟件進(jìn)行解析。
1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
采用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)以±s表示,兩組均數(shù)采用t檢驗(yàn)比較,多組數(shù)據(jù)之間采用方差分析比較。所有數(shù)據(jù)至少進(jìn)行三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。P值< 0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1轉(zhuǎn)染后miR-15b-5p miRNA相對表達(dá)水平
與空白對照組相比較,miR-15b-5p mimics NC組 、miR-15b-5p inhibitor NC組中的miR-15b-5p miRNA相對表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與miR-15b-5p mimics NC組相比,miR-15b-5p mimics組中的miR-15b-5p miRNA相對表達(dá)水平增高(F=24.65,P<0.05);反之,miR-15b-5p inhibitor NC組相比,miR-15b-5p inhibitor組中的miR-15b-5p miRNA相對表達(dá)水平降低(F=83.86,P<0.05),見圖1。說明轉(zhuǎn)染成功。
2.2使用雨蛙素造模后各組中miR-15b-5p miRNA相對表達(dá)水平
與空白對照組相比較,雨蛙素組中的miR-15b-5p miRNA表達(dá)水平增高(F=21.32,P<0.05);雨蛙素組、雨蛙素+miR-15b-5p mimics NC組 、雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor NC組中的miR-15b-5p miRNA相對表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與雨蛙素+miR-15b-5p mimics NC組相比,雨蛙素+miR-15b-5p mimics組中的miR-15b-5p miRNA相對表達(dá)水平增高(F=64.24,P<0.05);反之,與雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor NC組相比,雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor組中的miR-15b-5p miRNA相對表達(dá)水平降低(F=65.73,P<0.05),見圖2。說明使用雨蛙素胰腺炎造模后,miR-15b-5p在胰腺炎細(xì)胞中高表達(dá)。
2.3使用雨蛙素造模后各組中Caspase-3和Caspase-9的mRNA相對表達(dá)水平
與空白對照組相比較,雨蛙素組中的Caspase-3和Caspase-9的mRNA表達(dá)水平增高(F=82.96、41.85,P<0.05);雨蛙素組、雨蛙素+miR-15b-5p mimics NC組 、雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor NC組中的Caspase-3和Caspase-9的mRNA相對表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與雨蛙素+miR-15b-5p mimics NC組相比,雨蛙素+miR-15b-5p mimics組中的Caspase-3和Caspase-9的mRNA相對表達(dá)水平增高(F=66.10、18.24,P<0.05);反之,與雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor NC組相比,雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor組中的Caspase-3和Caspase-9的mRNA相對表達(dá)水平降低(F=91.14、6.36,P<0.05),見圖3。說明使用miR-15b-5p inhibitor后,細(xì)胞凋亡有關(guān)基因Caspase-3和Caspase-9的mRNA相對表達(dá)水平下降,而在使用mimics之后,細(xì)胞凋亡有關(guān)基因Caspase-3和Caspase-9的mRNA相對表達(dá)水平提高。
2.4使用雨蛙素造模后各組中Caspase-3和Caspase-9的蛋白表達(dá)水平
與空白對照組相比較,雨蛙素組中的Caspase-3和Caspase-9的蛋白質(zhì)相對表達(dá)水平增高(F=29.70、31.82,P<0.05);與雨蛙素組、雨蛙素+miR-15b-5p mimics NC組 、雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor NC組中的Caspase-3和Caspase-9的蛋白質(zhì)相對表達(dá)無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與雨蛙素+miR-15b-5p mimics NC組相比,雨蛙素+miR-15b-5p mimics組中的Caspase-3和Caspase-9的蛋白質(zhì)相對表達(dá)水平增高(F=20.14、76.98,P<0.05);反之,與雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor NC組相比,雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor組中的Caspase-3和Caspase-9的蛋白質(zhì)的相對表達(dá)水平降低(F=54.01、48.73,P<0.05),見圖4。說明使用miR-15b-5p inhibitor后,細(xì)胞凋亡有關(guān)基因Caspase-3和Caspase-9的蛋白質(zhì)相對表達(dá)水平下降,而在使用mimics以后,細(xì)胞凋亡有關(guān)基因Caspase-3和Caspase-9的蛋白質(zhì)的相對表達(dá)水平上升。
2.5使用miR-15b-5p inhibitor和mimics后各組細(xì)胞的凋亡發(fā)生率
與空白對照組相較,雨蛙素組中的細(xì)胞凋亡發(fā)生率增高(F=26.41,P<0.05);雨蛙素組、雨蛙素+miR-15b-5p mimics NC組 、雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor NC組中的細(xì)胞凋亡發(fā)生率差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與雨蛙素+miR-15b-5p mimics NC組相比較,miR-15b-5p mimics + 雨蛙素組中的細(xì)胞凋亡發(fā)生率升高(F=34.27,P<0.05);反之,與雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor NC組相比,雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor組中的細(xì)胞凋亡發(fā)生率下降(F=76.92,P<0.05),見圖5。說明使用miR-15b-5p inhibitor后,細(xì)胞凋亡率發(fā)生下降,而在使用mimics以后,細(xì)胞凋亡發(fā)生率上升。
3討論
在本研究中,我們證明了miR-15b-5p在雨蛙素誘導(dǎo)的胰腺外分泌細(xì)胞中高表達(dá),miR-15b-5p inhibitor可以通過抑制Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)水平,減輕雨蛙素誘導(dǎo)的胰腺外分泌細(xì)胞的凋亡。我們的結(jié)果為研究雨蛙素誘導(dǎo)的AP凋亡提供了理論依據(jù)。
雨蛙素誘導(dǎo)AP是一種成熟的AR42J細(xì)胞造模實(shí)驗(yàn)?zāi)P汀S醒芯勘砻?,miRNAs可參與調(diào)節(jié)胰腺外分泌細(xì)胞的增殖、活化、凋亡等過程,從而影響AP進(jìn)展。Shen Yang等證實(shí)miR-9 mimics降低AP的炎癥反應(yīng)和凋亡。Zhang Yongpeng等證明miR-551b-5p參與AP炎癥反應(yīng)的調(diào)控。結(jié)合miR-15b-5p在乳腺癌、糖尿病腎病等疾病中發(fā)揮著抑制細(xì)胞凋亡的作用,我們推測miR-15b-5p在AP中起著調(diào)控凋亡的作用。在我們的研究中,我們發(fā)現(xiàn)miR-15b-5p的mimics與胰腺外分泌細(xì)胞的功能障礙之間具有相關(guān)性。雨蛙素處理后的大鼠胰腺外分泌細(xì)胞中miR-15b-5p表達(dá)上調(diào),結(jié)果和早期大鼠動物實(shí)驗(yàn)一致。
另外,越來越多的證據(jù)表明胰腺外分泌細(xì)胞的死亡可能是AP發(fā)病的主要機(jī)制。而半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3(Caspase-3)則作為一種主要的凋亡蛋白酶,處于細(xì)胞凋亡通路的下游,Caspase-3在細(xì)胞胞質(zhì)中以無活性的酶原形態(tài)呈現(xiàn),在細(xì)胞產(chǎn)生凋亡信號時(shí),發(fā)生裂解并被激活,使細(xì)胞走向死亡。在我們的實(shí)驗(yàn)中,通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染,成功得到miR-15b-5p inhibitor和miR-15b-5p激活的AR42J細(xì)胞株,使用miR-15b-5p inhibitor后,Caspase-3表達(dá)水平下降,AR42J細(xì)胞凋亡水平下降,使用miR-15b-5p mimics后,Caspase-3表達(dá)水平上升,AR42J細(xì)胞凋亡水平上升。miR-15b-5p對Caspase-3表達(dá)水平的影響和早期的報(bào)道一致。這些結(jié)果表明miR-15b-5p可能參與并調(diào)控胰腺外分泌細(xì)胞的凋亡。
Caspase-3主要通過三個(gè)途徑參與細(xì)胞凋亡過程,一是線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑,二是死亡受體介導(dǎo)途徑,三是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞所介導(dǎo)的顆粒酶B途徑。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9( Caspase-9) 位于凋亡級聯(lián)反應(yīng)上游,并活化下游效應(yīng)Caspase。在本研究中,我們觀察到,使用miR-15b-5p inhibitor后,Caspase-9的表達(dá)水平下降,使用miR-15b-5p mimics后,Caspase-9的表達(dá)水平上升。說明miR-15b-5p可能通過活化Caspase-9激活下游Caspase-3,經(jīng)由線粒體途徑誘發(fā)細(xì)胞凋亡。
本研究初步論述了miR-15b-5p在調(diào)節(jié)胰腺外分泌細(xì)胞凋亡方面的分子機(jī)制,未來還可繼續(xù)研究miR-15b-5p上游及下游靶基因,從而進(jìn)一步探討miR-15b-5p參與胰腺細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制,以期為AP的疾病診斷和預(yù)防提出新的依據(jù)。
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作者簡介:王福貴,男,碩士研究生, E-mail:wfg1994@126.com 電話:18326661901
孫昀:男,主任醫(yī)師,碩士生導(dǎo)師,責(zé)任作者,E-mail:sunyun15@163.com
基金項(xiàng)目:安徽省高校自然科學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目基金(編號:KJ2017A183);安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院臨床研究培育計(jì)劃項(xiàng)目(編號:2020LCZD08)