王福貴　王小蝶　余維麗　孫昀

摘要 目的 研究小的非編碼RNA（miRNAs）miR-15b-5p對在雨蛙素處理下的大鼠胰腺外分泌細(xì)胞AR42J細(xì)胞凋亡的影響。方法? 在體外利用雨蛙素誘導(dǎo)AR42J細(xì)胞創(chuàng)建胰腺炎模型 ，并利用qRT-PCR和Western blot測定使用miR-15b-5p inhibitor和mimics后細(xì)胞內(nèi)Caspase-3及Caspase-9的mRNA和蛋白質(zhì)相對表達(dá)水平;采用流式細(xì)胞術(shù)來測定各組細(xì)胞的凋亡狀況。結(jié)果? 在使用miR-15b-5p inhibitor后，細(xì)胞凋亡有關(guān)基因組中Caspase-3及Caspase-9的mRNA相對表達(dá)水平和蛋白質(zhì)相對表達(dá)量減少，而細(xì)胞凋亡率相對降低（P<0.05）;而使用miR-15b-5p mimics后，Caspase-3及Caspase-9的mRNA相對表達(dá)水平和蛋白質(zhì)相對表達(dá)量上升，細(xì)胞的凋亡率升高（P<0.05）。結(jié)論? miR-15b-5p inhibitor能夠減少由雨蛙素所誘發(fā)的胰腺外分泌細(xì)胞凋亡，表明它可能是防治急性胰腺炎有效的潛在靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：miR-15b-5p;AR42J細(xì)胞;急性胰腺炎;細(xì)胞凋亡。

中圖分類號(hào) R 34

急性胰腺炎（Acute pancreatitis， AP）是一種典型的胃腸疾病，以胰腺外分泌細(xì)胞中胰蛋白酶原的特異活化以及隨后胰臟的自我消化過程為特征，引起胰臟腺泡損傷、強(qiáng)烈的全身性炎癥反應(yīng)和多器官衰竭。胰臟炎癥及腺泡細(xì)胞的壞死和凋亡是AP主要的病變特征。雖然AP檢查和處理技術(shù)目前已經(jīng)有所提高，但大約20%的胰腺炎病人仍可發(fā)展為中度至重癥急性胰腺炎（Severe acute pancreatitis，SAP），SAP發(fā)病迅速，其病人死亡比例可高達(dá)30%。所以對AP發(fā)病機(jī)制有更準(zhǔn)確的認(rèn)識(shí)，對開發(fā)更好的治療措施至關(guān)重要。

MicroRNA（miRNA）是一類內(nèi)源性、高度保守、單鏈非編碼RNA，可以通過識(shí)別并于靶基因的非轉(zhuǎn)錄3'-非轉(zhuǎn)錄區(qū)域（3' UTR）互補(bǔ)和配對，進(jìn)而導(dǎo)致靶基因分解或翻譯過程的調(diào)控。大量的科學(xué)研究也已證明，miRNA在細(xì)胞發(fā)育、分化、增殖、凋亡等多種生物活動(dòng)中發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用。miR-15b-5p是一個(gè)成熟的miRNA，剪切于pro-mir-15b的5'端，位于3號(hào)染色體長臂。已知mir-15b-5p在帕金森、直腸癌等中上調(diào)，而在甲狀腺瘤和糖尿病腎病中低表達(dá)。然而，mir-15b-5p在AP中的生物學(xué)功能及其機(jī)制尚不清楚。

研究擬探討miR-15b-5p在大鼠胰腺外分泌細(xì)胞AR42J細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制，以期為研究AP發(fā)病機(jī)制和臨床診斷提供新的理論研究和思路。

1材料與方法

1.1主要試劑與材料

大鼠腺胰腺外分泌細(xì)胞AR42J購于上海富衡細(xì)胞庫。miR-15b-5p的inhibitor和mimics及陰性對照均購于新貝（上海）生物科技有限公司。Lipofectamine 2000購于美國Life Technology公司。Opti-MEM（x1）培養(yǎng)基購買于美國Gibco公司。雨蛙素干粉購買于北京索萊寶科技有限公司;qRT-PCR試劑盒購買于日本Takara公司。Caspase-3、Caspase-9及 β-Actin抗體均購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。Annexin-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒購于上海七海復(fù)泰生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

預(yù)熱含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，從液氮罐中拿出凍存有AR42J細(xì)胞的凍存管，于水浴鍋內(nèi)完全溶解，在無菌操作臺(tái)內(nèi)，用1ml含10%胎牛血清的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，放置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2-3天進(jìn)行一次細(xì)胞傳代。待其生長至對數(shù)生長期時(shí)，將用胰酶消化液（0.25%胰酶）消化重懸好的細(xì)胞直接接種于六孔板中，使細(xì)胞生長至60%-80%匯合度后，于避光條件下使用Lipofectamine 2000試劑進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染24小時(shí)。分別記為：A： 空白對照組（不做任何處理的AR42J細(xì)胞）、B： miR-15b-5p mimics NC組 、 C： miR-15b-5p mimics組、D： miR-15b-5p inhibitor組、F： miR-15b-5p inhibitor NC組。

1.3 qRT-PCR測定各組細(xì)胞中miR-15b-5p miRNA相對表達(dá)水平

取出轉(zhuǎn)染好的所有組細(xì)胞，用TRIzol試劑提取出細(xì)胞中的全部RNA。用紫外線分光光度計(jì)檢測miRNA濃度和純度，合格后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：25℃、5min，50℃、15min，85℃、5s。合成cDNA以預(yù)備使用。按照表1中所示引物序列，采用熒光定量PCR擴(kuò)增儀，根據(jù)以下要求完成熒光定量PCR反應(yīng)，即95℃、30s預(yù)變性;95℃、5s，60℃、20s，共四十個(gè)循環(huán);95℃、1s，60℃、15s，95℃、5s，在反應(yīng)結(jié)束后，以 U6基因?yàn)閮?nèi)參照，計(jì)算miR-15b-5p相對表達(dá)含量，見圖1。

1.4雨蛙素造模

轉(zhuǎn)染成功后，用雨蛙素（100 nmol/L）刺激24 h，誘導(dǎo)好的細(xì)胞可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為6組，分別記為：空白對照組（不做任何處理的AR42J細(xì)胞）、雨蛙素組、 雨蛙素+miR-15b-5p mimics NC組 、 雨蛙素+miR-15b-5p mimics組、雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor NC組、雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor組。再次測定各組細(xì)胞中miR-15b-5p miRNA相對表達(dá)水平，計(jì)算miR-15b-5p相對表達(dá)含量，見圖2。

1.5 qRT-PCR測定各組細(xì)胞中細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Caspase-3和Caspase-9 相對mRNA相對表達(dá)水平

取出轉(zhuǎn)染并造模后的各組細(xì)胞，使用TRIzol試劑提取出細(xì)胞中的全部RNA。用紫外線分光光度計(jì)檢測RNA濃度和純度，合格后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA以預(yù)備使用。按照表2中所示引物序列，采用熒光定量PCR擴(kuò)增儀根據(jù)以下要求完成熒光定量PCR反應(yīng)，即95℃、30s預(yù)變性;95℃、5s，60℃、20s，共四十個(gè)循環(huán);95℃、1s，60℃、15s，95℃、5s，在反應(yīng)結(jié)束后，以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參照，計(jì)算Caspase-3及Caspase-9的mRNA相對表達(dá)含量。見圖3。

1.6Western blot法測定細(xì)胞中細(xì)胞凋亡關(guān)鍵蛋白Caspase-3和Caspase-9的相對表達(dá)水平

取出之前處理好的各組細(xì)胞，使用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，同時(shí)予以蛋白酶抑制劑抑制蛋白降解，獲得總蛋白質(zhì)后，用BCA檢測試劑盒完成蛋白定量分析。之后進(jìn)行凝膠電泳及對應(yīng)蛋白分子的轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后，在含5%脫脂奶粉的TBST溶液中，慢搖并于室內(nèi)溫度下封閉PVDF膜約2 h，再用TBST溶液洗滌浸泡3x10 min。在相對應(yīng)的一抗抗體中4℃孵育過夜。第二天再用TBST沖洗3x10 min，然后在相對應(yīng)的二抗中孵育條帶1 h左右，最后再用TBST沖洗3x10 min。然后用ECL化學(xué)發(fā)光底物顯影檢測對應(yīng)的蛋白質(zhì)，最后用Image-J處理圖像，以β-Actin為內(nèi)參計(jì)算其蛋白質(zhì)相對表達(dá)量。

1.7流式細(xì)胞儀測定各組細(xì)胞的凋亡狀況

取已處理好的所有組細(xì)胞，加入胰酶（不含EDTA）適度消化，吹離細(xì)胞后，予以500 g離心力離心5 min，將細(xì)胞收集，并吸去上清，加入1 ml PBS溶液再次洗滌細(xì)胞，然后將加入PBS溶液的細(xì)胞于500 g離心力下離心5 min，再次吸去上清，再加入400 μl Binding Buffer吹勻細(xì)胞，每組加入5 μl 的Annexin V-FITC試劑，在室溫下靜置約15 min，再加入10 μl的PI試劑，避光冰浴靜置5 min。在30 min內(nèi)，使用CytoFLEX流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡狀況測定，并用CytEepert軟件進(jìn)行解析。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，兩組均數(shù)采用t檢驗(yàn)比較，多組數(shù)據(jù)之間采用方差分析比較。所有數(shù)據(jù)至少進(jìn)行三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。P值< 0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.1轉(zhuǎn)染后miR-15b-5p miRNA相對表達(dá)水平

與空白對照組相比較，miR-15b-5p mimics NC組 、miR-15b-5p inhibitor NC組中的miR-15b-5p miRNA相對表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與miR-15b-5p mimics NC組相比，miR-15b-5p mimics組中的miR-15b-5p miRNA相對表達(dá)水平增高（F=24.65，P<0.05）;反之，miR-15b-5p inhibitor NC組相比，miR-15b-5p inhibitor組中的miR-15b-5p miRNA相對表達(dá)水平降低（F=83.86，P<0.05），見圖1。說明轉(zhuǎn)染成功。

2.2使用雨蛙素造模后各組中miR-15b-5p miRNA相對表達(dá)水平

與空白對照組相比較，雨蛙素組中的miR-15b-5p miRNA表達(dá)水平增高（F=21.32，P<0.05）;雨蛙素組、雨蛙素+miR-15b-5p mimics NC組 、雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor NC組中的miR-15b-5p miRNA相對表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與雨蛙素+miR-15b-5p mimics NC組相比，雨蛙素+miR-15b-5p mimics組中的miR-15b-5p miRNA相對表達(dá)水平增高（F=64.24，P<0.05）;反之，與雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor NC組相比，雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor組中的miR-15b-5p miRNA相對表達(dá)水平降低（F=65.73，P<0.05），見圖2。說明使用雨蛙素胰腺炎造模后，miR-15b-5p在胰腺炎細(xì)胞中高表達(dá)。

2.3使用雨蛙素造模后各組中Caspase-3和Caspase-9的mRNA相對表達(dá)水平

與空白對照組相比較，雨蛙素組中的Caspase-3和Caspase-9的mRNA表達(dá)水平增高（F=82.96、41.85，P<0.05）;雨蛙素組、雨蛙素+miR-15b-5p mimics NC組 、雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor NC組中的Caspase-3和Caspase-9的mRNA相對表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與雨蛙素+miR-15b-5p mimics NC組相比，雨蛙素+miR-15b-5p mimics組中的Caspase-3和Caspase-9的mRNA相對表達(dá)水平增高（F=66.10、18.24，P<0.05）;反之，與雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor NC組相比，雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor組中的Caspase-3和Caspase-9的mRNA相對表達(dá)水平降低（F=91.14、6.36，P<0.05），見圖3。說明使用miR-15b-5p inhibitor后，細(xì)胞凋亡有關(guān)基因Caspase-3和Caspase-9的mRNA相對表達(dá)水平下降，而在使用mimics之后，細(xì)胞凋亡有關(guān)基因Caspase-3和Caspase-9的mRNA相對表達(dá)水平提高。

2.4使用雨蛙素造模后各組中Caspase-3和Caspase-9的蛋白表達(dá)水平

與空白對照組相比較，雨蛙素組中的Caspase-3和Caspase-9的蛋白質(zhì)相對表達(dá)水平增高（F=29.70、31.82，P<0.05）;與雨蛙素組、雨蛙素+miR-15b-5p mimics NC組 、雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor NC組中的Caspase-3和Caspase-9的蛋白質(zhì)相對表達(dá)無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與雨蛙素+miR-15b-5p mimics NC組相比，雨蛙素+miR-15b-5p mimics組中的Caspase-3和Caspase-9的蛋白質(zhì)相對表達(dá)水平增高（F=20.14、76.98，P<0.05）;反之，與雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor NC組相比，雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor組中的Caspase-3和Caspase-9的蛋白質(zhì)的相對表達(dá)水平降低（F=54.01、48.73，P<0.05），見圖4。說明使用miR-15b-5p inhibitor后，細(xì)胞凋亡有關(guān)基因Caspase-3和Caspase-9的蛋白質(zhì)相對表達(dá)水平下降，而在使用mimics以后，細(xì)胞凋亡有關(guān)基因Caspase-3和Caspase-9的蛋白質(zhì)的相對表達(dá)水平上升。

2.5使用miR-15b-5p inhibitor和mimics后各組細(xì)胞的凋亡發(fā)生率

與空白對照組相較，雨蛙素組中的細(xì)胞凋亡發(fā)生率增高（F=26.41，P<0.05）;雨蛙素組、雨蛙素+miR-15b-5p mimics NC組 、雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor NC組中的細(xì)胞凋亡發(fā)生率差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與雨蛙素+miR-15b-5p mimics NC組相比較，miR-15b-5p mimics + 雨蛙素組中的細(xì)胞凋亡發(fā)生率升高（F=34.27，P<0.05）;反之，與雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor NC組相比，雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor組中的細(xì)胞凋亡發(fā)生率下降（F=76.92，P<0.05），見圖5。說明使用miR-15b-5p inhibitor后，細(xì)胞凋亡率發(fā)生下降，而在使用mimics以后，細(xì)胞凋亡發(fā)生率上升。

3討論

在本研究中，我們證明了miR-15b-5p在雨蛙素誘導(dǎo)的胰腺外分泌細(xì)胞中高表達(dá)，miR-15b-5p inhibitor可以通過抑制Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)水平，減輕雨蛙素誘導(dǎo)的胰腺外分泌細(xì)胞的凋亡。我們的結(jié)果為研究雨蛙素誘導(dǎo)的AP凋亡提供了理論依據(jù)。

雨蛙素誘導(dǎo)AP是一種成熟的AR42J細(xì)胞造模實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀Ｓ醒芯勘砻?，miRNAs可參與調(diào)節(jié)胰腺外分泌細(xì)胞的增殖、活化、凋亡等過程，從而影響AP進(jìn)展。Shen Yang等證實(shí)miR-9 mimics降低AP的炎癥反應(yīng)和凋亡。Zhang Yongpeng等證明miR-551b-5p參與AP炎癥反應(yīng)的調(diào)控。結(jié)合miR-15b-5p在乳腺癌、糖尿病腎病等疾病中發(fā)揮著抑制細(xì)胞凋亡的作用，我們推測miR-15b-5p在AP中起著調(diào)控凋亡的作用。在我們的研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-15b-5p的mimics與胰腺外分泌細(xì)胞的功能障礙之間具有相關(guān)性。雨蛙素處理后的大鼠胰腺外分泌細(xì)胞中miR-15b-5p表達(dá)上調(diào)，結(jié)果和早期大鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)一致。

另外，越來越多的證據(jù)表明胰腺外分泌細(xì)胞的死亡可能是AP發(fā)病的主要機(jī)制。而半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3（Caspase-3）則作為一種主要的凋亡蛋白酶，處于細(xì)胞凋亡通路的下游，Caspase-3在細(xì)胞胞質(zhì)中以無活性的酶原形態(tài)呈現(xiàn)，在細(xì)胞產(chǎn)生凋亡信號(hào)時(shí)，發(fā)生裂解并被激活，使細(xì)胞走向死亡。在我們的實(shí)驗(yàn)中，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染，成功得到miR-15b-5p inhibitor和miR-15b-5p激活的AR42J細(xì)胞株，使用miR-15b-5p inhibitor后，Caspase-3表達(dá)水平下降，AR42J細(xì)胞凋亡水平下降，使用miR-15b-5p mimics后，Caspase-3表達(dá)水平上升，AR42J細(xì)胞凋亡水平上升。miR-15b-5p對Caspase-3表達(dá)水平的影響和早期的報(bào)道一致。這些結(jié)果表明miR-15b-5p可能參與并調(diào)控胰腺外分泌細(xì)胞的凋亡。

Caspase-3主要通過三個(gè)途徑參與細(xì)胞凋亡過程，一是線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑，二是死亡受體介導(dǎo)途徑，三是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞所介導(dǎo)的顆粒酶B途徑。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（ Caspase-9） 位于凋亡級聯(lián)反應(yīng)上游，并活化下游效應(yīng)Caspase。在本研究中，我們觀察到，使用miR-15b-5p inhibitor后，Caspase-9的表達(dá)水平下降，使用miR-15b-5p mimics后，Caspase-9的表達(dá)水平上升。說明miR-15b-5p可能通過活化Caspase-9激活下游Caspase-3，經(jīng)由線粒體途徑誘發(fā)細(xì)胞凋亡。

本研究初步論述了miR-15b-5p在調(diào)節(jié)胰腺外分泌細(xì)胞凋亡方面的分子機(jī)制，未來還可繼續(xù)研究miR-15b-5p上游及下游靶基因，從而進(jìn)一步探討miR-15b-5p參與胰腺細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制，以期為AP的疾病診斷和預(yù)防提出新的依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Zhang K， Zhang X. MiR-146b-3p protects against AR42J cell injury in cerulein-induced acute pancreatitis model through targeting Anxa2[J]. Open Life Sci， 2021， 16（1）： 255-265.

[2] Gukovskaya A S， Gorelick F S， Groblewski G E， et al. Recent Insights Into the Pathogenic Mechanism of Pancreatitis： Role of Acinar Cell Organelle Disorders[J]. Pancreas， 2019， 48（4）： 459-470.

[3] Bansod S， Godugu C. Nimbolide ameliorates pancreatic inflammation and apoptosis by modulating NF-κB/SIRT1 and apoptosis signaling in acute pancreatitis model[J]. International Immunopharmacology， 2021， 90： 107246.

[4] Sinonquel P， Laleman W， Wilmer A. Advances in acute pancreatitis[J]. Curr Opin Crit Care， 2021， 27（2）： 193-200.

[5] Zou J， Qian J， Fu H， et al. MicroRNA15b5p exerts its tumor repressive role via targeting GDI2： A novel insight into the pathogenesis of thyroid carcinoma[J]. Molecular Medicine rePorTS， 2020， 22（4）： 2723-2732.

[6] Salimi S， Noorbakhsh F， Faghihzadeh S， et al. Expression of miR-15b-5p， miR-21-5p， and SMAD7 in Lung Tissue of Sulfur Mustard-exposed Individuals with Long-term Pulmonary Complications[J]. Iran J Allergy Asthma Immunol， 2019， 18（3）： 332-339.

[7] Zhu J， Xu X， Liang Y， et al. Downregulation of microRNA-15b-5p Targeting the Akt3-Mediated GSK-3beta/beta-Catenin Signaling Pathway Inhibits Cell Apoptosis in Parkinson's Disease[J]. Biomed Res Int， 2021， 2021： 11.

[8] Huang X， Hou Y， Weng X， et al. Diethyldithiocarbamate-copper complex （CuET） inhibits colorectal cancer progression via miR-16-5p and 15b-5p/ALDH1A3/PKM2 axis-mediated aerobic glycolysis pathway[J]. Oncogenesis， 2021， 10（4）： 2-16.

[9] Chang J， Yu Y， Fang Z， et al. Long non-coding RNA CDKN2B-AS1 regulates high glucose-induced human mesangial cell injury via regulating the miR-15b-5p/WNT2B axis[J]. Diabetol Metab Syndr， 2020， 12（1）： 109.

[10] Shen Y， Xue C， You G， et al. miR-9 alleviated the inflammatory response and apoptosis in caerulein-induced acute pancreatitis by regulating FGF10 and the NF-kappaB signaling pathway[J]. Exp Ther Med， 2021， 22（2）： 795.

[11] Zhang Y， Yan L， Han W. Elevated Level of miR-551b-5p is Associated With Inflammation and Disease Progression in Patients With Severe Acute Pancreatitis[J]. Ther Apher Dial， 2018， 22（6）： 649-655.

[12] Wu B， Liu G， Jin Y， et al. miR-15b-5p Promotes Growth and Metastasis in Breast Cancer by Targeting HPSE2[J]. Front Oncol， 2020， 10： 108.

[13] Tsai Y C， Kuo M C， Hung W W， et al. High Glucose Induces Mesangial Cell Apoptosis through miR-15b-5p and Promotes Diabetic Nephropathy by Extracellular Vesicle Delivery[J]. Mol Ther， 2020， 28（3）： 963-974.

[14] 于豐銘， 徐揚(yáng). Caspase-3的研究進(jìn)展[J]. 中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)， 2020， 42（11）： 2072–2078.

[15] 劉大銳， 李報(bào)春， 李懷東. 細(xì)胞凋亡核心基因Caspase家族的研究進(jìn)展[J]. 中國醫(yī)藥導(dǎo)刊， 2020， 22（11）： 800-805.

作者簡介：王福貴，男，碩士研究生， E-mail：wfg1994@126.com 電話：18326661901

孫昀：男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：sunyun15@163.com

基金項(xiàng)目：安徽省高校自然科學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目基金（編號(hào)：KJ2017A183）;安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院臨床研究培育計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：2020LCZD08）