趙藝璇 馮琪 田琳 張家培 王鑫 劉易超 劉冬云

摘 要： 為研究木槿（Hibiscus syriacus）不同品種花粉形態(tài)的多樣性及其親緣關(guān)系，該研究以22個木槿品種的花粉為材料，通過掃描電鏡進行形態(tài)特征及外壁紋飾觀測，然后使用R型聚類分析法和主成分分析法提取合適的指標(biāo)進行UPGMA聚類分析。結(jié)果表明：（1）木槿的花粉均為單粒近球形，直徑為148.98～111.65 μm;表面具有刺狀紋飾，長度為27.42～14.79 μm，刺先端較尖，細刺周圍均勻分布散孔;花粉表面分布有顆粒狀突起，萌發(fā)孔性狀不規(guī)則。（2）對測量指標(biāo)提取主成分后進行 UPGMA聚類分析，當(dāng)歐氏平均距離閾值為6時，22個木槿品種被分為6大類，單瓣藍紫色品種‘藍鳥、‘單瓣紫粉、‘細葉等親緣關(guān)系較近，半重瓣品種‘薰衣草雪紡、‘中國雪紡、‘粉色雪紡等親緣關(guān)系較近，而‘木橋、‘漢帛等粉白色單瓣木槿品種親緣關(guān)系相對較近。該研究認為木槿種內(nèi)藍紫色品種相對較為原始，白色半重瓣品種次之，紫色半重瓣品種相對較為進化，白色單瓣品種進化程度更高。該研究結(jié)果為木槿種內(nèi)遺傳演化、分類地位以及親緣關(guān)系的鑒定提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 木槿， 掃描電鏡， 花粉形態(tài)， 主成分分析， 聚類分析

Abstract： In order to study the morphological diversity of Hibiscus syriacus cultivars and their relationships， we observed morphological characteristics and exine sculpture of 22 H. syriacus pollen grains by scanning electron microscope， and used R-type cluster analysis and principal component analysis to extract appropriate indicators for UPGMA cluster analysis. The results were as follows： （1） The pollen of H. syriacus was single-spherical， nearly spherical with diameter of 148.98-111.65 μm with thorn-like ornamentation on the surface with length of 27.42-14.79 μm; The tip of the thorn was sharp， and the thorns distributed around scattered pores; The pollen surface was distributed with granular protrusions and the apertures were irregular. （2） UPGMA cluster analysis was performed after extracting principal components of the measured indicators. When the Euclidean mean distance threshold was 6， 22 H. syriacus cultivars were divided into six categories. The single-petal blue-violet cultivars ‘Bluebird， ‘Dan Ban Zi Fen and ‘Xi Ye had close relationships， and semidouble cultivars ‘Lavender Chiffon and ‘China Chiffon， ‘Pink Chiffon had close relationships， while white single-petal ‘Wood Bridge and ‘Hamabo were relatively close. It was believed that the single-petal blue-violet cultivars in H. syriacus were more primitive than the pink and white semidouble cultivars， while purple semidouble cultivars were more evolved and the white single-petal cultivars were highly evolved. The results of this study provide theoretical basis for genetic evolution， taxonomic status， and genetic relationship studies in H. syriacus.

Key words： Hibiscus syriacus， scanning electron microscope， pollen morphology， principal component analysis， cluster analysis

木槿（Hibiscus syriacus）是我國園林綠化常用的灌木或小喬木。木槿花色繁多有純白、米黃、紫色、粉色、紅色等，瓣型有單瓣、半重瓣、重瓣三類，花期極長，可在6—10月連續(xù)開花，彌補了我國北方園林綠化中夏季至秋季缺少開花木本植物的不足（劉小冬等，2008）。木槿品種繁多，歐美國家和韓國已培育出200余個品種，常用于歐美園林的有40余種，但我國對于木槿分類和繁育工作研究較少，缺乏系統(tǒng)深入研究，長時間以來，由于不斷的人工雜交和自然選擇，使得木槿品種關(guān)系混亂，來源不明，親緣關(guān)系模糊，分類與進化關(guān)系難以確認。因此，研究木槿品種分類、親緣關(guān)系對于木槿品種間雜交，培育新品種具有重要意義。

不同植物的花粉形態(tài)差異較大，可以反映出植物的遺傳差異性。在遺傳基因的控制下，花粉形態(tài)具有保守、可靠和穩(wěn)定的特性（黎懷成等，2018）。國外進行了有關(guān)錦葵科植物的胞粉學(xué)研究，EL Naggar （2004）研究了錦葵科10個屬21種植物的花粉形態(tài)，Bibi et al.（2010）研究了錦葵科6個屬下9個種的花粉形態(tài)，均認為錦葵科植物花粉的形態(tài)性狀、花粉外壁表面紋飾對本科內(nèi)物種劃分有很大的參考價值。近年來關(guān)于其他科屬植物種內(nèi)花粉形態(tài)研究均發(fā)現(xiàn)不同種質(zhì)間花粉形態(tài)具有一定差異，可作為劃分品種，進行品種間親緣關(guān)系研究的重要依據(jù)（羅樂等，2017;張銳等，2018;劉秀麗等，2018）。因此，進行花粉形態(tài)觀察，進行孢粉學(xué)標(biāo)記研究對于研究植物品種遺傳多樣性及親緣關(guān)系具有重要意義。

為了研究木槿品種間親緣關(guān)系，本試驗以22個木槿品種的花粉為材料，通過掃描電鏡觀察測量其形態(tài)差異，根據(jù)測量結(jié)果進行聚類分析，進而探討木槿種內(nèi)親緣關(guān)系，旨在為木槿品種分類和親緣關(guān)系研究提供孢粉學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取22個品種木槿的成熟花粉為供試材料，品種名稱及來源詳見表1。

1.2 方法

1.2.1 花粉采集及不同儲藏方法處理 選擇健康無病蟲害的木槿樣本，采集新鮮花粉，加入4%戊二醛溶液浸泡，儲存于4 ℃冰箱中等待檢測（Erdtman， 1978）。每品種采集3個不同單株花朵的花粉，重復(fù)3次。

1.2.2 脫水預(yù)處理 電鏡觀察前，取出待測儲藏花粉。先用去離子水浸泡3次，時長分別為6、7、8 min，再經(jīng)過50%乙醇14 min→70%乙醇14 min→85%乙醇14 min→95%乙醇15 min→100%乙醇15 min逐級脫水處理。

1.2.3 干燥處理 先打開二氧化碳臨界點干燥儀氣閥，制冷到10 ℃，放入試驗樣品，充入CO2液體，靜置27 min后放出CO2液體，這個步驟重復(fù)3次;再次充入CO2液體，加熱45 min后關(guān)閉總氣閥，等待氣體全部緩慢放出之后，取出處理后的試驗樣品。

1.2.4 電鏡觀察 對木槿花粉進行噴金處理后使用HITACHI SU8010掃描電鏡觀察。選取典型花粉粒進行拍照，在×200視野下拍攝花粉群體圖像，在×500視野下拍攝花粉個體圖像，在×3 000下拍攝花粉局部圖像。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 參考彭煥文等（2018）和劉金蘭等（1987）的方法，測量不同花粉直徑、刺狀凸起長度、兩刺間距離等花粉形態(tài)指標(biāo)。

使用SPSS 22.0根據(jù)Tukey檢驗法對測量指標(biāo)進行顯著性檢驗。以最小值和最大值表示變異幅度。變異系數(shù)（CV）%=S×100%x，其中，S為標(biāo)準(zhǔn)差。根據(jù)計算所得平均值對所選指標(biāo)進行R型檢驗，提取主成分并將所得主成分作為因子進行UPGMA聚類方法分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉的基本特征

根據(jù)彭煥文等（2018）和劉金蘭等（1987）對錦葵科植物花粉形態(tài)分類所使用指標(biāo)進行測量，分析22個木槿樣本花粉電鏡掃描結(jié)果。如圖版Ⅰ所示，22個木槿品種的花粉形態(tài)為單粒近球形，表面分布刺狀紋飾，刺為圓錐形，先端鈍圓，細刺周圍均勻分布散孔。花粉表面分布有顆粒狀突起，萌發(fā)孔形狀不規(guī)則，細刺脫落后，萌發(fā)孔暴露于花粉表面。

2.2 花粉的大小

總體而言，木槿花粉均以單粒近球形形式存在，平均直徑為122.54 μm，直徑這一指標(biāo)變異系數(shù)為1.01%。其中，‘法國紫色酒館直徑最大，為148.98 μm;‘藍鳥直徑最小，為111.65 μm。

2.3 花粉外壁紋飾特征

22種木槿花粉表面均分布有刺狀紋飾，刺狀紋飾粗細大小不一，且在花粉表面分布狀況各不相同，具體結(jié)果見表2所示。細刺平均長度為21.18 μm，變異系數(shù)為1.56%;‘單瓣紫粉刺長最長，為27.42 μm;‘藍色雪紡刺長最短，為14.79 μm;22個品種刺基部寬度為10.44 μm，變異系數(shù)為1.79%;‘薄荷基部寬度最大，為13.26 μm;‘紫柱基部寬度最小，為6.84 μm;22個木槿品種瓣紫粉花粉直徑/刺長比值最小，其刺狀突起相對較長;從各指標(biāo)變異系數(shù)來看，該指標(biāo)變異系數(shù)最大，為2.24%（圖版Ⅱ-Ⅳ）。

2.4 22個木槿品種6個花粉形態(tài)R型聚類分析和主成分分析

R型聚類分析可分析所選取指標(biāo)之間有無相關(guān)性，從而選取代表性強的性狀指標(biāo)進行下一步分析。由圖1 R型聚類分析結(jié)果可知，圖中各性狀指標(biāo)較為分散，說明選取指標(biāo)較為合理，可用于下一步Q型聚類分析。對測定的6個木槿花粉外壁形態(tài)指標(biāo)提取主成分，進行主成分分析。由表3和表4結(jié)果可知，測定的6個形態(tài)指標(biāo)可以被劃分為2個主成分。第1主成分包括刺長、花粉直徑、刺長/刺基部寬和花粉直徑/刺長4個指標(biāo)。其中，貢獻率較大的為花粉直徑/刺長和刺長/刺基部寬2個指標(biāo);第2主成分包括刺基部直徑和兩刺距離2個指標(biāo)。這6個指標(biāo)累積貢獻率可達77.611%，說明可以較為完整地反映出木槿花粉外壁形態(tài)指標(biāo)信息。綜合R型聚類分析結(jié)果和主成分分析結(jié)果來看，選取的6個形態(tài)指標(biāo)具有代表性，可用于對木槿花粉進行Q型聚類分析。

2.5 22個木槿品種花粉外壁形態(tài)的聚類分析

根據(jù)這6個指標(biāo)對22種花粉進行Q型聚類分析。由圖2可知，歐氏平均距離閾值為6時，22個木槿品種被分為6大類，第1類僅‘藍色雪紡，第2類僅‘薄荷1個品種，這兩類花粉形態(tài)具有刺基部相對較寬、花粉直徑和花粉直徑/刺長值較大的特點;第3類包含‘藍鳥1個品種;第4類包含‘單瓣紫粉1個品種，該品種花粉刺長較短，刺基部寬，兩刺距離較長，花粉直徑較大，刺長/刺基部寬值較小，花粉直徑/刺長值較大;第5類包括‘紫柱、‘細葉、‘粉紅巨人和‘胭脂紅4個單瓣粉紫色木槿品種，第5類花粉中4個品種木槿花粉刺長/刺基部寬值均相對較大;第6類花粉刺長/刺基部寬值相對較小，花粉直徑/刺長值相對較大，主要包括‘紅心、‘漢帛、‘木橋等粉白色單瓣品種， ‘法國紫色酒館、 ‘玫瑰、 ‘薰衣草雪紡3個紫色半重瓣品種以及‘粉色雪紡和‘中國雪紡2個粉白色半重瓣品種。

3 討論與結(jié)論

3.1 關(guān)于木槿花粉系統(tǒng)進化特征

花粉體積越小，對植物體營養(yǎng)競爭越小，進化程度越高（周守標(biāo)等， 2005;楊晨漩等，2014）。22種木槿花粉直徑范圍為148.98～111.65 μm，屬于大?；ǚ??；ǚ郾诒砻婕y飾特征可以反映植物進化規(guī)律，一般來說，花粉表面平滑的較為原始，其次為花粉表面為顆粒狀突起，再到棒狀、刺狀，最終演化為網(wǎng)狀、皺波狀及條紋狀?；ǚ圻M化趨勢為大型表面粗糙到小型表面光滑。綜合來看，木槿花粉為大粒近球形花粉，花粉萌發(fā)孔屬于單一的不規(guī)則萌發(fā)孔，且表面均分布有粗細長短不一的刺狀紋飾，屬于進化程度較低的植物類群。

3.2 關(guān)于木槿在錦葵科內(nèi)進化地位

花粉形態(tài)受遺傳基因控制，具有穩(wěn)定性，受外界環(huán)境因子影響較小，因此孢粉學(xué)標(biāo)記可用作植物分類和親緣關(guān)系分析的重要依據(jù)。在分類水平較高的科與亞科之間，花粉形態(tài)差異較大，而在同科不同屬中，各種之間差異較小，而各品種之間遺傳差異則更小，相似點更多。前人已有研究表明，在錦葵科內(nèi)，花粉外壁紋飾進化趨勢為從中等大小到體積增大，從3孔溝到多散孔，從基部膨大短尖刺到基部平長尖刺（孫京田等，1993;El Naggar， 2004;El Nauuar & Sawady， 2008;彭煥文等，2018）。本試驗中所觀察木槿品種體積較大，表面分布有不規(guī)則散孔，刺細長且基部平坦，符合錦葵科內(nèi)較進化種的花粉外壁紋飾特征，因此，木槿在本科內(nèi)屬于進化程度較高的類群。

3.3 關(guān)于木槿花粉形態(tài)研究的分類學(xué)意義

根據(jù) R型聚類分析和主成分分析得出的6個木槿花粉外壁形態(tài)指標(biāo)對22個木槿品種進行聚類分析是對變量進行分類處理。本研究發(fā)現(xiàn)，木槿花粉聚類分析結(jié)果與其花形態(tài)指標(biāo)有一定的相關(guān)性。在第5類中，單瓣藍紫色品種‘藍鳥、‘單瓣紫粉、‘細葉、‘粉紅巨人單獨聚為一類，說明花粉形態(tài)特征與其花色花型具有一定相關(guān)性。肖芬等（2019）利用形態(tài)學(xué)標(biāo)記、孢粉學(xué)標(biāo)記及ISSR分子標(biāo)記對27個木槿品種親緣關(guān)系進行了綜合分析，得出27個木槿品種形態(tài)學(xué)、孢粉學(xué)以及ISSR分子標(biāo)記分析結(jié)果具有一定相似性，與本試驗研究結(jié)果具有一致性。張錚和史剛榮（2009）從木材解剖學(xué)角度研究了5個品種木槿進化關(guān)系，該研究認為，紫花單瓣木槿屬于最為原始的類群，紫花單瓣木槿在分化出牡丹木槿的基礎(chǔ)上再分化出了紫花重瓣木槿。在本研究中，當(dāng)歐氏平均距離閾值為3時，木槿與半重瓣品種‘薰衣草雪紡、‘中國雪紡和‘玫瑰聚為一類，而‘薰衣草雪紡、‘中國雪紡、‘玫瑰和牡丹木槿在形態(tài)上具有高度相似性，均屬于粉色半重瓣品種，說明這3個品種是紫色單瓣木槿最初分化得來的，相對較為原始。粉白色單瓣品種如‘木橋、‘漢帛、‘紅心遺傳關(guān)系較近，但和木槿遺傳關(guān)系相對較遠，說明此花型品種相對較為進化，由此推測較其他花型品種來說，白色單瓣品種進化程度相對較高。由于木槿是本種的原種，而木槿與其他單瓣藍紫色品種遺傳關(guān)系較近，因此本研究認為木槿種內(nèi)藍紫色品種相對較為原始，白色半重瓣品種次之，紫色半重瓣品種相對較為進化，白色單瓣品種與木槿遺傳關(guān)系較遠，相對于其他花形態(tài)的木槿進化程度更高。木槿花粉形態(tài)與其花形態(tài)存在一定聯(lián)系，而花形態(tài)可能會受外界環(huán)境因子影響，兩者可共同作為木槿系統(tǒng)分類標(biāo)準(zhǔn)。

總體而言，木槿屬于相對較為原始的類群，但在錦葵科內(nèi)，木槿屬于較為進化的類群，其花粉形態(tài)與花色花型具有一定的相關(guān)性?；ǚ弁獗诩y飾受基因控制，具有一定的穩(wěn)定性（趙娜，2014），但單憑孢粉學(xué)作為判斷品種間親緣關(guān)系及分類依據(jù)，還不夠全面，存在一定局限性，在今后研究中需要結(jié)合形態(tài)學(xué)標(biāo)記、分子標(biāo)記等多方面研究對其進行綜合分析。

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（責(zé)任編輯 李 莉）