余舒瑩 祝曉飛 嚴(yán)俊

[摘要] 目的 觀察大鼠肺炎鏈球菌腦膜炎模型中水通道蛋白4（AQP4）的表達(dá)變化及調(diào)節(jié)機(jī)制。 方法 采用肺炎鏈球菌腦池內(nèi)注射誘導(dǎo)建立大鼠細(xì)菌性腦膜炎模型，以注射等量生理鹽水者為對(duì)照，在造模后24 h、48 h、5 d處死大鼠，用HE染色、干濕重法、熒光定量PCR和免疫印跡法（Western blot）分別檢測(cè)其腦部炎癥程度、腦組織含水量、AQP4 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。采用半胱氨酰白三烯受體（CysLTs）選擇性拮抗劑在造模前30 min和造模后30 min、12 h、24 h、48 h分別腹腔注射給藥1次，于造模后48 h觀察AQP4的表達(dá)變化。 結(jié)果 與對(duì)照組相比，光鏡下可見模型組所有大鼠腦室內(nèi)均有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，造模后48 h及5 d大鼠腦含水量顯著升高（P<0.05）。PCR及Western blot結(jié)果顯示，模型組大鼠腦組織AQP4 mRNA及蛋白的表達(dá)在24 h開始升高，48 h達(dá)高峰，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），5 d時(shí)又下降。CysLT2受體拮抗劑HAMI3379可顯著抑制模型組AQP4的表達(dá)增加（P<0.05），而CysLT1受體選擇性拮抗劑普魯司特對(duì)模型組AQP4的表達(dá)增加無顯著影響（P>0.05）。 結(jié)論 AQP4參與了大鼠肺炎鏈球菌腦膜炎腦水腫的形成，同時(shí)CysLT2受體可能通過對(duì)AQP4表達(dá)的調(diào)節(jié)以控制腦水腫。

[關(guān)鍵詞] 水通道蛋白4;細(xì)菌性腦膜炎;肺炎鏈球菌;半胱氨酰白三烯受體

[Abstract] Objective To observe the expression changes and regulation mechanism of aquaporin 4（AQP4） in a rat model of Streptococcus Pneumoniae meningitis. Methods Intracerebral injection of Streptococcus Pneumoniae was used to induce and establish a rat model of bacterial meningitis， and the rats injected with the same amount of normal saline were collected as controls. The animals were sacrificed at 24 h， 48 h and 5 d after modeling. HE staining， dry and wet weight method， fluorescence quantitative PCR and western blot were used to detect the degree of cerebral inflammation， brain tissue water content， AQP4 mRNA， and protein expression levels. A selective antagonist of cysteinyl leukotriene receptor （CysLTs） was administered intraperitoneally once every 30 min before modeling and 30 min， 12 h， 24 h and 48 h after modeling. The expression changes of AQP4 were observed 48 h after modeling. Results Compared with the control group， under the light microscope， a large number of inflammatory cells infiltration could be seen in all rat ventricles in the model group. The brain water content of rats in the 48 h and 5 d groups were increased significantly after modeling（P<0.05）. PCR and Western blot results showed that the expression of AQP4 mRNA and protein in the brain tissue of the model group began to increase at 24 h and reached a peak at 48 h. Compared with the control group， there was a significant difference（P<0.05）， and the expression was decreased again at 5 d. CysLT2 receptor antagonist HAMI3379 could significantly inhibit the increased AQP4 expression in the model group（P<0.05）， and the selective antagonist prulast of CysLT1 receptor has no significant effect on the increased AQP4 expression in the model group（P>0.05）. Conclusion AQP4 is involved in the formation of cerebral edema due to Streptococcus Pneumoniae meningitis in rats. At the same time， CysLT2 receptor may control cerebral edema by regulating the expression of AQP4.

[Key words] Aquaporin 4; Bacterial meningitis; Streptococcus Pneumoniae; Cysteinyl leukotriene receptor

細(xì)菌性腦膜炎（Bacterial meningitis，BM）是嬰幼兒時(shí)期常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重感染性疾病[1]，炎癥并發(fā)腦水腫導(dǎo)致的顱內(nèi)壓增高是患兒高致死率及發(fā)生后遺癥的一個(gè)重要因素[2]，其發(fā)生機(jī)制不詳。腦水平衡的調(diào)節(jié)主要與水通道蛋白（Aquaporins，AQPs）有關(guān)[3]，其中水通道蛋白4（AQP4）是目前腦組織中分布最廣、數(shù)量最多的水通道蛋白，參與多種腦損傷的腦水腫過程[4-5]。半胱氨酰白三烯（Cysteinyl leukotienes，CysLTs）是一類重要的炎癥介質(zhì)，主要通過CysLT1受體（CysLT1R）和CysLT2受體（CysLT2R）發(fā)揮作用[6-7]。研究結(jié)果顯示，在大鼠肺炎鏈球菌腦膜炎模型中，CysLTs受體表達(dá)升高[8];腦內(nèi)CysLTs和AQP4均與局灶性腦缺血后繼發(fā)的腦水腫密切相關(guān)[9-11]，CysLTs可通過CysLT2受體上調(diào)AQP4表達(dá)，繼而引起細(xì)胞毒性腦水腫[12]。根據(jù)上述結(jié)果，推測(cè)在細(xì)菌性腦膜炎腦水腫的發(fā)生過程中CysLTs受體與AQP4可能存在相互聯(lián)系。本研究通過建立大鼠肺炎鏈球菌腦膜炎的動(dòng)物模型，觀察AQP4的表達(dá)特征及CysLTs受體拮抗劑對(duì)腦內(nèi)AQP4表達(dá)的影響，初步闡明與AQP4表達(dá)調(diào)節(jié)有關(guān)的CysLTs受體亞型。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 主要試劑與儀器? 肺炎鏈球菌Ⅲ型（中國(guó)藥品生物制品檢定所，菌號(hào)31003）;普魯司特（APExBio公司）;HAMI3379（APExBio公司）;兔抗AQP4多克隆抗體（Proteintech公司）;蘇木素-伊紅（北京中山生物技術(shù)有限公司）;RNA提取液、RIPA裂解液、抗鼠β-actin單克隆抗體、抗兔IRdye700及抗鼠IRdye800熒光標(biāo)記二抗（Servicebio公司）;立體定位儀（美國(guó)Stoeling公司）;Leica CM 1900型冰凍切片機(jī)（德國(guó)萊卡公司）;電光分析天平（上海天平儀器廠）;勻漿儀（康濤科技公司）;熒光顯微鏡Olympus BX51型（日本Olympus公司）;熒光定量PCR儀（ABI公司）;SDS-PAGE膠電泳轉(zhuǎn)膜裝置、Quantity One圖像分析軟件（美國(guó)BIORAD公司）;ODYSSEY免疫印跡膜熒光成像系統(tǒng)（美國(guó)LICOR Biosciences公司）;手術(shù)器械、手術(shù)縫線、縫合針（華東醫(yī)藥有限公司），手術(shù)相關(guān)的所有物品在使用前均洗凈、超聲除污漬、滅菌備用。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物? 3周齡SD大鼠72只，體重50～60 g，雌雄不限，購(gòu)自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)SCXK（浙）2014-0001。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批。實(shí)驗(yàn)過程在屏障系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室中完成。

1.2方法

1.2.1 細(xì)菌懸液的制備? 將肺炎鏈球菌Ⅲ型菌株接種于血瓊脂糖培養(yǎng)基，在37℃ 5%CO2環(huán)境中生長(zhǎng)過夜，再接種于肉湯中，生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期收菌，離心，用鹽水稀釋，通過紫外分光光度儀檢測(cè)菌液濁度，調(diào)整菌液濃度為107 cfu/mL。

1.2.2動(dòng)物分組及模型構(gòu)建? ①采用PCR及免疫印跡（Western blot）法觀察AQP4表達(dá)的時(shí)間特征，取40只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組（造模后24 h組、造模后48 h組、造模后5 d組），每組各10只。模型組大鼠用戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后，固定于立體定位儀。參照文獻(xiàn)進(jìn)行腦膜炎的誘導(dǎo)[13]，從大鼠小腦延髓池穿刺回抽20 μL腦脊液，模型組注入肺炎鏈球菌懸液20 μL（107 cfu/L），對(duì)照組注入20 μL無菌生理鹽水。觀察各組大鼠的臨床表現(xiàn)，每組大鼠各取2只做病理切片檢查。②為觀察CysLTs受體選擇性拮抗劑對(duì)細(xì)菌性腦膜炎大鼠AQP4表達(dá)的影響，取32只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、普魯司特（CysLT1受體拮抗劑，0.1 mg/kg）干預(yù)組、HAMI3379（CysLT2受體拮抗劑，0.1 mg/kg）干預(yù)組，每組各8只。普魯司特及HAMI 3379干預(yù)組在注入肺炎鏈球菌懸液前30 min、注入后30 min、4 h、12 h、24 h、48 h分別腹腔注射給藥1次。對(duì)照組及模型組在注入前后相同時(shí)間點(diǎn)，腹腔注射相同容積的無菌生理鹽水。48 h后各組大鼠均麻醉取腦。

1.2.3腦組織病理學(xué)檢查? 至預(yù)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)間，將大鼠麻醉，左心室灌注生理鹽水沖洗，4%多聚甲醛固定后取全腦，冠狀切片石蠟包埋，切為10 μm厚的切片，進(jìn)行HE染色。

1.2.4 腦組織含水量測(cè)定? 采用干濕重法[14]，取左側(cè)腦組織裝入干燥稱量杯中，用電光分析天平精密稱量腦組織濕重，再置于100℃烤箱內(nèi)持續(xù)烘烤24 h至恒重（兩次測(cè)定值之差≤0.2 mg）后測(cè)定腦組織干重，計(jì)算腦含水量，腦含水量=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.2.5熒光定量PCR檢測(cè)AQP4 mRNA表達(dá)? 各組大鼠在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)麻醉，立即斷頭取腦，在冰面上迅速取出右側(cè)腦組織，經(jīng)液氮凍存后，置-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。每只大鼠?0 mg腦組織，采用Trizol試劑盒抽提總mRNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，根據(jù)下列目的基因及條件進(jìn)行擴(kuò)增：AQP4引物，上游：5′-CAG AGA ACC CCC TAC CTG TGG A-3′，下游：5′-ATG TAG AAG ACG GAC TTG GCG A-3′，擴(kuò)增片段172 bp;GAPDH引物，上游：5′-CTG GAG AAA CCT GCC AAG TAT G-3′，下游：5′-GGT GGA AGA ATG GGA GTT GCT-3′，擴(kuò)增片段138 bp，95℃ 15 s、60℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)。ΔΔCT法分析基因mRNA表達(dá)水平。

1.2.6 Western blot檢測(cè)AQP4蛋白表達(dá)? 每只大鼠取100 mg腦組織，以常規(guī)方法提取總蛋白并定量后，取100 μg蛋白進(jìn)行硝酸纖維素膜電泳，后放入5%的脫脂奶粉中，在平緩搖動(dòng)的搖床平臺(tái)上室溫孵育2 h。取出硝酸纖維素膜，放入混有內(nèi)參β-actin單克隆抗體（1∶5000）及兔抗AQP4多克隆抗體（1∶200）的一抗中，室溫孵育2 h，再用抗兔IRdye700及抗鼠IRdye800熒光標(biāo)記的二抗（1∶5000）室溫孵育2 h。采用ODYSSEY免疫印跡膜熒光成像系統(tǒng)攝像，利用Quantity One圖像分析軟件分析條帶灰度，結(jié)果以AQP4和內(nèi)參β-actin的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用Prism 5 for windows（Graph Pad Software Inc.，USA）統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，采用One-way ANOVA檢驗(yàn)，以Dunnett′s進(jìn)行組間比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 對(duì)照組及模型組臨床表現(xiàn)及HE染色結(jié)果比較

模型組大鼠在接種肺炎鏈球菌24 h后，均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損癥狀，輕者僅表現(xiàn)為進(jìn)食少、活動(dòng)少，重者表現(xiàn)為精神差、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、拒食、抽搐、昏迷甚至死亡。其中造模后48 h組死亡1例，造模后5 d組死亡2例。對(duì)照組大鼠的精神及進(jìn)食無明顯異常，無上述癥狀。HE染色結(jié)果顯示，造模組大鼠蛛網(wǎng)膜下腔、腦室均有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，對(duì)照組大鼠未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。見封三圖1。

2.2 對(duì)照組及模型組腦含水量比較

與對(duì)照組的（72.75±2.15）%相比，模型組大鼠腦含水量在接種肺炎鏈球菌后48 h及5 d均顯著升高，分別為（85.68±5.23）%及（84.47±4.43）%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3對(duì)照組及模型組腦組織AQP4 mRNA表達(dá)比較

模型組大鼠腦組織AQP4 mRNA表達(dá)在感染肺炎鏈球菌后24 h開始有所升高，48 h達(dá)高峰，為（165.43±47.97）%，與對(duì)照組的（100.00±35.97）%及造模后24 h組的（107.34±5.58）%比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;其在5 d時(shí)又下降，為（118.10±18.68）%，但仍高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖1。

2.4對(duì)照組及模型組腦組織AQP4蛋白表達(dá)比較

造模后48 h組大鼠的腦組織AQP4蛋白表達(dá)為（127.54±12.59）%，顯著高于對(duì)照組的（100.00±32.37）%及造模后24 h組的（100.49±14.47）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;造模后5 d組大鼠的腦組織AQP4蛋白表達(dá)為（109.92±16.29）%，與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖2。

2.5腦組織AQP4表達(dá)受CysLTs受體拮抗劑的影響比較

Western blot結(jié)果顯示，模型組大鼠腦組織AQP4表達(dá)量為（134.03±19.38）%，與對(duì)照組的（100.00±6.41）%相比顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;普魯司特干預(yù)組大鼠腦組織AQP4表達(dá)量為（134.58±9.88）%，與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;HAMI3379干預(yù)組大鼠腦組織AQP4表達(dá)量為（105.90±28.31）%，與模型組相比顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖3。

3討論

細(xì)菌性腦膜炎是兒童常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重感染性疾病，其中肺炎鏈球菌是導(dǎo)致腦膜炎嚴(yán)重神經(jīng)后遺癥的主要致病菌[2]。本研究采用肺炎鏈球菌直接注入3周齡大鼠的延髓腦池，模型組大鼠出現(xiàn)精神差、厭食、運(yùn)動(dòng)少等腦膜炎癥狀，同時(shí)HE染色結(jié)果顯示，其腦膜及腦室內(nèi)有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，提示大鼠肺炎鏈球菌腦膜炎模型建立成功。

目前已發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物腦組織中至少分布著AQP1、AQP4和AQP9這3種水通道蛋白，這幾種蛋白的分布具有細(xì)胞特異性[15]。AQP4是其中分布最廣的水通道蛋白，且被證實(shí)參與多種類型中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的腦水腫，如帕金森病、創(chuàng)傷性腦損傷、腦卒中、癲癇、自閉癥等[16]。本研究結(jié)果顯示，大鼠腦含水量在腦組織感染肺炎鏈球菌后48 h及5 d時(shí)顯著升高，與腦組織AQP4 mRNA及蛋白表達(dá)的變化基本保持一致，提示肺炎鏈球菌腦膜炎時(shí)腦水腫的形成與AQP4的表達(dá)增高有關(guān)。熒光定量PCR與Western blot結(jié)果顯示，AQP4 mRNA表達(dá)在腦組織感染肺炎鏈球菌后24 h開始升高，48 h達(dá)高峰，5 d時(shí)仍持續(xù)在較高的表達(dá)水平;而AQP4蛋白表達(dá)在腦組織感染肺炎鏈球菌后48 h最高，5 d時(shí)已接近對(duì)照組的正常水平。提示在細(xì)菌性腦膜炎的后期，腦組織仍不斷表達(dá)mRNA，而AQP4則可能被消耗用于促進(jìn)腦水腫的消退。

腦水腫按發(fā)生機(jī)制主要分為細(xì)胞毒性腦水腫和血管源性腦水腫[17]。細(xì)胞毒性腦水腫是由于細(xì)胞能量代謝障礙導(dǎo)致離子泵轉(zhuǎn)運(yùn)失調(diào)，從而使細(xì)胞外隙的水分過度進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞腫脹。星形膠質(zhì)細(xì)胞是細(xì)胞毒性腦水腫中發(fā)生腫脹的主要細(xì)胞，其終足部位恰是AQP4在腦內(nèi)高表達(dá)的位點(diǎn)[15]。AQP4基因敲除對(duì)肺炎鏈球菌腦膜炎[18]、早期局灶性腦缺血[19]等原因造成的細(xì)胞毒性腦水腫具有保護(hù)作用。研究結(jié)果顯示，AQP4可促進(jìn)腦損傷后細(xì)胞毒性腦水腫的形成和血管源性腦水腫的消退[20-24]。在細(xì)菌性腦膜炎腦水腫早期，AQP4可能主要參與腦水腫的形成，后期其又與腦水腫的消退有關(guān)[25]。上述研究結(jié)果為AQP4在肺炎鏈球菌腦膜炎腦水腫中的作用提供了直接的功能性證據(jù)，同時(shí)也提示AQP4表達(dá)調(diào)節(jié)劑在治療細(xì)菌性腦膜炎腦水腫中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

第一部分研究結(jié)果顯示，AQP4 mRNA和蛋白的表達(dá)在腦組織感染肺炎鏈球菌后48 h顯著升高，因此第二部分研究選取腦組織感染肺炎鏈球菌后48 h的大鼠作為模型組。研究結(jié)果顯示，肺炎鏈球菌腦膜炎腦組織AQP4表達(dá)的上調(diào)可被CysLT2受體選擇性拮抗劑HAMI3379抑制，而非CysLT1受體選擇性拮抗劑普魯司特，提示AQP4在細(xì)菌性腦膜炎腦水腫中的作用可能通過CysLT2受體介導(dǎo)。目前研究已經(jīng)證實(shí)，CysLTs可通過激動(dòng)CysLT1受體以增高血腦屏障通透性，從而誘導(dǎo)血管源性腦水腫;同時(shí)通過激動(dòng)CysLT2受體以引起腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上AQP4表達(dá)增加，從而誘導(dǎo)細(xì)胞毒性腦水腫[12]。星形膠質(zhì)細(xì)胞在缺血性炎癥損傷后可通過激活CysLT2受體誘導(dǎo)AQP4表達(dá)上調(diào)，增加的AQP4繼而又加重細(xì)胞損傷[26]。因此，抑制CysLT2受體，進(jìn)而抑制AQP4的功能，可能將有利于減輕細(xì)菌性腦膜炎病程中出現(xiàn)的細(xì)胞毒性腦水腫。另一方面，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明亞低溫可能通過抑制p38 MAPK信號(hào)通路的激活，從而降低心肺復(fù)蘇大鼠腦組織AQP4的表達(dá)[27]，阿托伐他汀可通過抑制p38 MAPK信號(hào)通路，減少AQP4的表達(dá)，從而減輕缺血性腦水腫[28];離體實(shí)驗(yàn)證明，在星形膠質(zhì)細(xì)胞缺血性損傷時(shí)，CysLT2受體激活后可通過p38 MAPK信號(hào)通路參與AQP4的表達(dá)上調(diào)[26]，但細(xì)菌性腦膜炎時(shí)，CysLT2受體激活后是否通過此信號(hào)通路調(diào)節(jié)AQP4的表達(dá)，還有待進(jìn)一步研究闡明。

綜上所述，本研究初步確定AQP4與大鼠肺炎鏈球菌腦膜炎腦水腫的形成有關(guān)，同時(shí)CysLT2受體可能通過對(duì)AQP4表達(dá)的調(diào)節(jié)以控制腦水腫，以此為基礎(chǔ)，為分子水平治療細(xì)菌性腦膜炎腦水腫提供了新的作用靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2020-02-05）