趙曉麗 李培雯 劉婉玉 宗兆睿 夏 天 付 于

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖中心，天津 300193)

缺血性卒中是臨床上常見的心腦血管疾病，且近年來發(fā)病人群趨于年輕化[1-2]。缺血性卒中后盡快恢復(fù)再灌注能有效減少缺血造成的腦損傷，但再灌注也會產(chǎn)生鈣超載、炎性反應(yīng)激活、線粒體損傷等再灌注損傷，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡、壞死，造成不可逆損傷[3-4]。相關(guān)研究表明，卒中發(fā)生后積極有效的干預(yù)處理可以有效減輕卒中缺血再灌注造成的腦損傷[5]。合真中華藥香是天津市非物質(zhì)文化遺產(chǎn)，秉承著“藥借香氣，香借藥性”的中醫(yī)內(nèi)病外治理念，在防病、治病方面優(yōu)勢明顯。本研究將合真醒神香應(yīng)用于卒中后再灌注損傷的防治，通過觀察合真醒神香穴位貼敷和香熏預(yù)處理對卒中缺血再灌注損傷模型大鼠的保護(hù)作用，探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠72只，8周齡，體質(zhì)量260～280 g，均購自北京維通利華實驗動物公司[許可證號：SCXK(京)2016-0006]，常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后進(jìn)行實驗。

1.2 實驗藥物 合真醒神香主要成分包括沉香30 g、蘇合香5 g、安息香15 g、麝香0.3 g、冰片3 g、楠木粉黏合劑，由合真藥香文化藝術(shù)館(天津)有限公司提供。

1.3 實驗試劑及儀器

1.3.1 主要試劑 氯化三苯四氮唑(TTC)染色液、尼氏染色液(焦油紫法)、通用P物質(zhì)(SP)檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；大鼠白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、干擾素γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測試劑盒(達(dá)科為生物技術(shù)股份有限公司)；抗天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3(anti-Caspase-3)抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；抗B淋巴細(xì)胞瘤2相關(guān)X蛋白(anti-Bax)抗體(英國Abcam公司)；抗B淋巴細(xì)胞瘤2(p65)[anti-Bcl-2(p65)]抗體(美國Bioworld公司)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]；原位末端標(biāo)記法(TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.3.2 主要儀器 多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)；熒光顯微鏡、冷凍切片機(jī)(德國Leica公司)；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；臺式低速離心機(jī)(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；組織研磨機(jī)(南京先歐儀器制造有限公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗分組及給藥 將72只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、穴位貼敷組、穴位貼敷對照組、香熏組、香熏對照組，每組12只。假手術(shù)組和模型組大鼠均正常飼養(yǎng)14 d，不予任何藥物預(yù)處理。穴位貼敷組予合真醒神香穴位貼敷預(yù)處理14 d，貼敷前對大鼠腕部進(jìn)行脫毛處理，將合真醒神香粉碎成細(xì)粉，根據(jù)成人常規(guī)劑量以體表面積換算成等效劑量0.75 g，再以生姜汁調(diào)和成糊狀，貼敷于大鼠“內(nèi)關(guān)”及“外關(guān)”，并以膠布固定，每日更換2次。穴位貼敷對照組予楠木粉黏合劑貼敷預(yù)處理14 d，取穴和給藥方式同穴位貼敷組。香熏組予合真醒神香香熏預(yù)處理14 d，即將大鼠籠放置在15 m2的房間，在籠旁點燃合真醒神香，保持鼠籠空氣流通，緊閉門窗但不密封，以保持空氣中的熏香濃度穩(wěn)定，每次香熏15 min，每日1次。香熏對照組予楠木粉黏合劑香熏預(yù)處理14 d，香熏方法同香熏組。

1.4.2 建立模型 各組大鼠預(yù)處理14 d后，除假手術(shù)組外，其余各組參照文獻(xiàn)[9，10]中方法建立大腦中動脈缺血再灌注損傷模型。首先以10%水合氯醛按0.34 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，然后仰臥固定于手術(shù)臺上，常規(guī)皮膚消毒，頸正中剪長約3 cm切口，鈍性分離右側(cè)胸鎖乳突肌與胸骨鎖骨肌，分離右側(cè)頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈，避免損傷迷走神經(jīng)。結(jié)扎頸內(nèi)動脈顱外段的唯一分支翼腭動脈，再結(jié)扎頸總動脈近心端，于頸總動脈分叉處結(jié)扎頸外動脈，微動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈。在右側(cè)頸總動脈接近分叉處剪一小口插入線栓并用手術(shù)線輕度結(jié)扎，松開微動脈夾，輕推線栓沿頸總動脈入頸內(nèi)動脈至有阻力時止，系緊結(jié)扎線，線栓尾端露于體外。此時線栓頭端入大腦前動脈，其體部阻擋住大腦中動脈入口，形成大腦中動脈供血中斷，閉塞2 h后拔出線栓，形成再灌注。假手術(shù)組僅剝離頸總動脈后立即縫合創(chuàng)口。

1.5 觀察指標(biāo)及方法

1.5.1 神經(jīng)功能缺損評分 再灌注24 h后參照文獻(xiàn)[11]中評分方法對各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分進(jìn)行比較。0分：無神經(jīng)功能損傷；1分：左側(cè)(癱瘓側(cè))前爪不能完全伸展；2分：左側(cè)前肢不能伸展；3分：行走時，大鼠向左側(cè)轉(zhuǎn)大圈；4分：行走時，大鼠向左側(cè)轉(zhuǎn)小圈；5分：行走時，大鼠身體向左側(cè)傾倒。

1.5.2 TTC染色觀察腦梗死體積 神經(jīng)功能檢測完畢后，處死各組大鼠，迅速取腦組織，-20 ℃冷凍保存。切取冠狀位腦片，厚度為2 mm，將腦片放入2%的TTC溶液中，37 ℃避光孵育30 min，每5 min輕微晃動容器，使充分染色。染色結(jié)束后，用4%多聚甲醛溶液固定腦片，拍照，每組3個樣品，使用Image J 軟件計算梗死部位體積占腦總體積的百分比[12-14]。

1.5.3 TUNEL法檢測梗死腦組織細(xì)胞凋亡率 梗死腦組織冰凍切片，用4%多聚甲醛溶液固定30 min，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌2次，每次10 min，使用0.5%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)室溫通透5 min。在組織上滴加TUNEL反應(yīng)液，37 ℃避光孵育60 min。PBS洗滌3次，4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)避光復(fù)染5 min，再用PBS洗滌3次，抗熒光猝滅劑封片后，于熒光顯微鏡下觀察。每組3個樣品，采用Image J軟件進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，計算梗死腦組織細(xì)胞凋亡率。

1.5.4 HE染色觀察梗死腦組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài) 梗死腦組織冰凍切片，厚度8 μm。于蒸餾水中漂洗3 min，蘇木素染色10 min，流動水沖洗5 min，0.1%鹽酸-乙醇分色20 s，流動水沖洗1 min，PBS藍(lán)化，經(jīng)75%、85%、95%乙醇處理各10 s，伊紅染色2 min，95%乙醇、無水乙醇脫水，二甲苯透明，封片后于光學(xué)顯微鏡下觀察梗死腦組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)。

1.5.5 尼氏染色觀察海馬組織尼氏小體形態(tài) 海馬區(qū)腦組織冰凍切片，蒸餾水漂洗1 min，梯度乙醇復(fù)水，切片置于尼氏染色液，56 ℃溫箱浸染1 h，蒸餾水漂洗1 min，將切片置于分化液分化2 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片后于光學(xué)顯微鏡下觀察海馬區(qū)尼氏小體形態(tài)。

1.5.6 ELISA法檢測海馬區(qū)和皮質(zhì)部細(xì)胞因子含量 取海馬區(qū)和皮質(zhì)部，稱質(zhì)量，按1∶9加入預(yù)冷的0.9%氯化鈉注射液，勻漿，4000 r/min，離心10 min，取上清液。然后按照ELISA試劑盒操作說明書，使用多功能酶標(biāo)儀測定560 nm吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，每組3個樣品，分別計算海馬區(qū)和皮質(zhì)部IL-1β、IFN-γ、TNF-α的濃度。

1.5.7 免疫組化法檢測梗死腦組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 梗死腦組織冰凍切片，用甲醇固定10 min，3%雙氧水(H2O2)反應(yīng)10 min，PBS洗滌3次，每次5 min，0.5% Triton X-100室溫通透10 min，羊血清封閉30 min，一抗(1∶50)4 ℃孵育過夜，相應(yīng)二抗室溫孵育30 min，鏈酶親和素-過氧化物酶反應(yīng)液室溫孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色30 min，蘇木精輕度復(fù)染5 min，1%鹽酸酒精分化30 s，蒸餾水沖洗藍(lán)化，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察拍照，每組3個樣品，使用Image J軟件分析凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bax、Bcl-2染色陽性面積，計算相對表達(dá)情況及Bax/Bcl-2比值。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較 見表1。

由表1可見，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評分升高(P<0.05)。與模型組比較，穴位貼敷組和香熏組大鼠神經(jīng)功能缺損評分均降低(P<0.05)，穴位貼敷對照組和香熏對照組與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。穴位貼敷組和香熏組分別與穴位貼敷對照組和香熏對照組比較，大鼠神經(jīng)功能缺損評分均降低(P<0.05)。穴位貼敷組與香熏組大鼠神經(jīng)功能缺損評分組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較 分，

2.2 各組大鼠腦梗死體積百分比比較 見圖1、表2。

假手術(shù)組 模型組 穴位貼敷組 穴位貼敷對照組 香熏組 香熏對照組

表2 各組大鼠腦梗死體積百分比比較

由表2可見，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦梗死體積百分比增加(P<0.05)。與模型組比較，穴位貼敷組大鼠腦梗死體積百分比減小(P<0.05)，穴位貼敷對照組、香熏組、香熏對照組與模型組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與穴位貼敷對照組比較，穴位貼敷組大鼠腦梗死體積小于穴位貼敷對照組(P<0.05)，香熏組與香熏對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。穴位貼敷組大鼠腦梗死體積百分比小于香熏組(P<0.05)。

2.3 各組大鼠梗死腦組織細(xì)胞凋亡率比較 見圖2、表3。

圖2 各組大鼠梗死腦組織細(xì)胞凋亡情況[DNA片段用FITC標(biāo)記(綠色熒光)，細(xì)胞核用DAPI標(biāo)記(藍(lán)色熒光)，×40]

表3 各組大鼠梗死腦組織細(xì)胞凋亡率比較

由表3可見，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠梗死腦組織細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)。與模型組比較，穴位貼敷組和香熏組大鼠梗死腦組織細(xì)胞凋亡率均降低(P<0.05)，穴位貼敷對照組和香熏對照組與模型組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。穴位貼敷組和香熏組分別與穴位貼敷對照組和香熏對照組比較，大鼠梗死腦組織細(xì)胞凋亡率均降低(P<0.05)。穴位貼敷組和香熏組大鼠梗死腦組織細(xì)胞凋亡率組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 各組大鼠梗死腦組織海馬區(qū)和皮質(zhì)部IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平比較 見表4。

表4 各組大鼠梗死腦組織海馬區(qū)和皮質(zhì)部IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平比較

由表4可見，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬區(qū)和皮質(zhì)部IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平均升高(P<0.05)。與模型組比較，穴位貼敷組大鼠海馬區(qū)和皮質(zhì)部IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平均下降(P<0.05)，香熏組大鼠僅海馬區(qū)IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平下降(P<0.05)，皮質(zhì)部各指標(biāo)雖也有下降趨勢，但比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，穴位貼敷對照組和香熏對照組海馬區(qū)和皮質(zhì)部各指標(biāo)與模型組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與穴位貼敷對照組比較，穴位貼敷組大鼠海馬區(qū)和皮質(zhì)IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平均低于穴位貼敷對照組(P<0.05)，與香熏對照組比較，香熏組僅海馬區(qū)IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平和皮質(zhì)部IFN-γ水平低于香熏對照組(P<0.05)。穴位貼敷組大鼠皮質(zhì)部IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平均低于香熏組(P<0.05)。

2.5 各組大鼠梗死腦組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)和海馬區(qū)尼氏小體形態(tài)觀察 假手術(shù)組腦組織形態(tài)清晰，神經(jīng)細(xì)胞排列密集，神經(jīng)元胞漿豐富，膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列致密，細(xì)胞周圍間隙無水腫，海馬區(qū)尼氏小體排列緊密，數(shù)量繁多。模型組梗死腦組織可見大片神經(jīng)細(xì)胞消失，細(xì)胞稀疏，排列紊亂，間質(zhì)疏松，神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞周圍間隙明顯增寬，神經(jīng)纖維疏松，海馬區(qū)尼氏小體明顯減少，排列稀疏，形態(tài)不規(guī)則。穴位貼敷組和香熏組梗死腦組織神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量較模型組明顯增多，細(xì)胞排列較緊密，神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞周圍間隙縮小，海馬區(qū)尼氏小體較模型組形態(tài)規(guī)則，數(shù)量增多。穴位貼敷對照組和香熏對照組梗死腦組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)和海馬區(qū)尼氏小體形態(tài)與模型組類似。見圖3、4。

圖3 各組大鼠梗死腦組織腦細(xì)胞形態(tài)(HE染色，×20)

圖4 各組大鼠梗死腦組織海馬區(qū)尼氏小體形態(tài)(尼氏染色，×40)

2.6 各組大鼠梗死腦組織Caspase-3、Bax、Bcl-2相對表達(dá)情況及Bax/Bcl-2比較 見圖5、表5。

Caspase-3

表5 各組大鼠梗死腦組織Caspase-3、Bax、Bcl-2相對表達(dá)情況及Bax/Bcl-2比較

由表5可見，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠梗死腦組織Caspase-3、Bax、Bcl-2、Bax/Bcl-2水平均增加(P<0.05)。與模型組比較，穴位貼敷組和香熏組大鼠梗死腦組織Caspase-3、Bax、Bax/Bcl-2水平均降低(P<0.05)，穴位貼敷組Bcl-2水平升高(P<0.05)，穴位貼敷對照組和香熏對照組各指標(biāo)與模型組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與穴位貼敷對照組比較，穴位貼敷組大鼠梗死腦組織Caspase-3、Bax、Bax/Bcl-2水平均低于穴位貼敷對照組(P<0.05)，Bcl-2水平高于穴位貼敷對照組(P<0.05)，與香熏對照組比較，香熏組大鼠梗死腦組織Caspase-3、Bax、Bax/Bcl-2水平均低于香熏對照組(P<0.05)。穴位貼敷組大鼠梗死腦組織Bcl-2水平高于香熏組(P<0.05)，Bax/Bcl-2水平低于香熏組(P<0.05)。

3 討論

缺血性卒中又稱為腦梗死，是由于各種原因引起腦組織血液供應(yīng)障礙，從而導(dǎo)致腦組織缺血、缺氧性病變壞死，并出現(xiàn)一系列的神經(jīng)功能缺損癥狀，屬于臨床上的急癥、重癥，具有高致殘率、高致死率的特點[15]。早期的靜脈溶栓治療是治療急性缺血性卒中的重要方法，通過靜脈輸注溶栓藥物治療，溶解堵塞血管的血栓，從而最大限度地減輕因缺血、缺氧造成的腦細(xì)胞損傷，對患者神經(jīng)缺損功能的恢復(fù)具有重要臨床意義[16]。但大量臨床研究發(fā)現(xiàn)，部分患者采用靜脈溶栓治療在快速恢復(fù)梗死部位再灌注的同時，也帶來更為嚴(yán)重的損傷，并將這種現(xiàn)象稱為缺血再灌注損傷，是伴隨缺血性卒中的治療而產(chǎn)生，一般認(rèn)為其損傷機(jī)制包括氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、炎性反應(yīng)、血腦屏障破壞、細(xì)胞凋亡等[17]。

神經(jīng)細(xì)胞凋亡增加是引起缺血再灌注損傷的重要原因，導(dǎo)致缺血區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞死亡，細(xì)胞數(shù)量減少甚至消失，特別是海馬區(qū)細(xì)胞損傷，尼氏小體的數(shù)量明顯減少。Bax基因是人體最主要的凋亡基因，當(dāng)發(fā)生腦缺血時可導(dǎo)致Bax轉(zhuǎn)移至線粒體外膜，使線粒體外膜通透性增加，促進(jìn)細(xì)胞色素C(Cyt-C)和凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)釋放，激活Caspase-3介導(dǎo)的內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑[18]。研究顯示，缺血再灌注損傷可進(jìn)一步導(dǎo)致促凋亡蛋白Caspase-3和Bax表達(dá)增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡明顯增加[19]。Bcl-2能夠通過穩(wěn)定線粒體膜電位，抑制Cyt-C的釋放，發(fā)揮抑制凋亡作用，Bcl-2還可與Bax形成二聚體，當(dāng)Bax相對量高于Bcl-2時，Bcl-2與Bax形成同二聚體，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，當(dāng)Bcl-2相對量高于Bax時，Bcl-2與Bax形成異二聚體，抑制細(xì)胞凋亡[20]。因此，Bax與Bcl-2的平衡，是細(xì)胞凋亡途徑中的重要調(diào)節(jié)因子，決定了細(xì)胞的凋亡與存活。Zhang Y等[21]使用糖氧剝奪/復(fù)氧(OGD/R)方法模擬離體缺血再灌注，結(jié)果顯示降低Bax/Bcl-2能促進(jìn)細(xì)胞存活。Leung S W等[22]研究發(fā)現(xiàn)，大黃素可通過細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2通路增加Bcl-2表達(dá)，降低Caspase-3表達(dá)，發(fā)揮抑制線粒體凋亡作用，降低缺血再灌注導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷，具有神經(jīng)保護(hù)作用。本實驗研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評分升高(P<0.05)，腦組織出現(xiàn)大面積梗死(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率增加(P<0.05)，梗死腦組織中Caspase-3、Bax、Bcl-2、Bax/Bcl-2水平均增加(P<0.05)，鏡下觀察顯示梗死腦組織神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯減少，排列紊亂，海馬區(qū)尼氏小體明顯減少，排列稀疏。

神經(jīng)炎性反應(yīng)是介導(dǎo)缺血再灌注損傷的另一個重要機(jī)制。IL-1β是一種關(guān)鍵的促炎細(xì)胞因子，參與多種自身免疫性炎性反應(yīng)和多種細(xì)胞活動，IL-1β的局部激活是介導(dǎo)促炎反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)，IL-1β介導(dǎo)缺血后腦水腫等病理損傷，抑制IL-1β能減少中性粒細(xì)胞浸潤和腦水腫[23]。TNF-α是一種多向性的促炎細(xì)胞因子，主要由活躍的巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌，TNF-α表達(dá)的增加則可產(chǎn)生損傷性生物學(xué)效應(yīng)[24]。IFN-γ是主要由T淋巴細(xì)胞和自然殺傷(NK)細(xì)胞分泌的多功能細(xì)胞因子，可介導(dǎo)黏附分子表達(dá)，促進(jìn)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶的產(chǎn)生，活化小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β、TNF-α等，加重神經(jīng)性炎性反應(yīng)，并產(chǎn)生活性氧(ROS)、一氧化氮(NO)等造成氧化應(yīng)激損傷，ROS通過活化絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路亦可促進(jìn)炎癥因子釋放，并誘導(dǎo)線粒體凋亡途徑，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[25-26]。研究顯示，抑制炎癥因子釋放或給予抗炎治療能減少小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，減輕神經(jīng)炎癥，減少腦水腫，具有神經(jīng)保護(hù)作用[27-28]。本實驗研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬區(qū)和皮質(zhì)部的IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平均增加(P<0.05)，說明缺血再灌注損傷導(dǎo)致梗死腦組織炎性反應(yīng)加劇。

缺血性卒中屬中醫(yī)學(xué)中風(fēng)的范疇，元氣虛衰，風(fēng)、火、痰、瘀損傷腦絡(luò)，氣血瘀阻，導(dǎo)致竅閉神匿，神不導(dǎo)氣是其發(fā)病的主要病因病機(jī)，故治療應(yīng)以醒腦開竅、活血通絡(luò)為主。中醫(yī)自古就有“芳香避穢”的說法，是指芳香氣味的中藥多具有祛瘟除穢、避疫防病、醒腦開竅、扶正祛邪的功效，是中醫(yī)防病治病的重要方法[29]。合真醒神香是以芳香開竅藥為主制成，主要成分包括沉香、蘇合香、安息香、麝香、冰片。方中沉香溫腎通心，沁人心脾；蘇合香開竅辟穢，開郁豁痰；安息香開竅清神，行氣活血；麝香開竅醒神，活血通經(jīng)；冰片開竅醒神，清熱散毒。研究表明，芳香開竅中藥可通過抗氧化損傷、抑制炎癥因子表達(dá)、減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡等作用保護(hù)卒中后腦組織損傷[30]；沉香對氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的分泌具有調(diào)節(jié)作用，從而起到鎮(zhèn)靜安神的功效[31]；蘇合香可明顯改善缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評分，通過影響凝血功能增加正常及缺血狀態(tài)下血腦屏障通透性發(fā)揮腦保護(hù)作用[32]，蘇合香揮發(fā)油還可通過抑制神經(jīng)細(xì)胞Toll樣受體9(TLR9)的表達(dá)，降低Caspase-3表達(dá)量，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活[33]；安息香可通過抑制TNF-α等炎癥因子的釋放，從而減少內(nèi)皮細(xì)胞的損傷[34]；麝香可能通過抑制實驗性腦缺血模型大鼠缺血區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞增生介導(dǎo)的炎性反應(yīng)，減輕腦水腫，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)[35]；冰片、麝香等芳香開竅藥能顯著降低缺血再灌注損傷大鼠的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)含量，維持血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞的正常形態(tài)，發(fā)揮血腦屏障保護(hù)作用[36]，冰片還可抑制缺血再灌注損傷神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)ROS、NO的產(chǎn)生，抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)神經(jīng)元損傷[37]。穴位貼敷和香熏療法都屬中藥外治范疇，清·吳尚先在《理瀹駢文》中有言“外治之理，即內(nèi)治之理，外治之藥，即內(nèi)治之藥，所異者法耳”，充分概括和肯定了外治的治療作用。穴位貼敷是通過透皮吸收，香熏療法是通過呼吸道黏膜吸收，兩者略有不同，但藥物有效成分均可“切于皮膚，徹于肉理，攝于吸氣，融于滲液”(清·吳尚先《理瀹駢文》)，從而通經(jīng)走絡(luò)，直達(dá)臟腑。本實驗研究結(jié)果顯示，與模型組比較，穴位貼敷組大鼠神經(jīng)功能缺損評分降低(P<0.05)，腦梗死體積減小(P<0.05)，梗死腦組織細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)，海馬區(qū)和皮質(zhì)部IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平均下降(P<0.05)，梗死腦組織Caspase-3、Bax、Bax/Bcl-2水平均降低(P<0.05)，Bcl-2水平升高(P<0.05)，鏡下觀察顯示梗死腦組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)和海馬區(qū)尼氏小體形態(tài)均有改善；與模型組比較，香熏組大鼠神經(jīng)功能缺損評分降低(P<0.05)，梗死腦組織細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)，海馬區(qū)IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平均下降(P<0.05)，梗死腦組織Caspase-3、Bax、Bax/Bcl-2水平均降低(P<0.05)，鏡下觀察顯示梗死腦組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)和海馬區(qū)尼氏小體形態(tài)均有改善；穴位貼敷對照組和香熏對照組各指標(biāo)與模型組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；2個治療組組間比較，穴位貼敷組大鼠腦梗死體積小于香熏組(P<0.05)，皮質(zhì)部IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平均低于香熏組(P<0.05)，梗死腦組織Bcl-2水平高于香熏組(P<0.05)，Bax/Bcl-2水平低于香熏組(P<0.05)。

綜上所述，合真醒神香穴位貼敷和香熏預(yù)處理對大鼠卒中缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，可明顯減輕神經(jīng)功能缺損，減小腦梗死體積，減少細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與降低海馬區(qū)和皮質(zhì)部IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平，抑制炎性反應(yīng)，抑制缺血部位Caspase-3和Bax的表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)，降低Bax/Bcl-2水平，發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用有關(guān)，其中穴位貼敷干預(yù)的效果較香熏干預(yù)作用更為廣泛，效果更佳，對合真醒神香的臨床應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)作用。