王述蓮，李鵬宇，孫 鈞，鄭繼偉，李綿洋，王成彬，郭志強(qiáng)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是由于長時間嚴(yán)重心肌缺血引起部分心肌急性壞死，具有較高的病死率，胸骨劇烈疼痛是主要臨床表現(xiàn)，檢測顯示血清心肌酶升高，循環(huán)功能障礙等變化[1]。AMI發(fā)病急、早期診斷困難是導(dǎo)致病人死亡率較高的主要原因，因此，早期準(zhǔn)確診斷對及時救治病人具有重要的臨床意義。目前主要根據(jù)病人臨床表現(xiàn)、心電圖、實(shí)驗(yàn)室檢測AMI標(biāo)志物進(jìn)行診斷，實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果反映病人病情。血清心肌酶是判斷心肌梗死的標(biāo)志物之一，但單一血清心肌酶檢測特異性不高[2]。肌鈣蛋白I(cTnI)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)和肌紅蛋白(Myo)等指標(biāo)聯(lián)合檢測可提高AMI早期診斷率[3-4]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA(microRNA，miRNAs)在不同疾病中表達(dá)不同，具有一定的組織和細(xì)胞特異性，心肌梗死后檢測到miRNAs發(fā)生變化，可作為心肌損傷的標(biāo)志物[5-6]。本研究探討miR-182、miR-23a-3p聯(lián)合cTnI、CK-MB、Myo在AMI早期診斷中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年6月—2018年12月武警北京市總隊(duì)醫(yī)院治療的AMI病人80例作為AMI組，其中男45例，女35例，年齡34～68(59.29±15.38)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《急性心肌梗死診斷和治療指南》[7]標(biāo)準(zhǔn)診斷(具有以下至少一項(xiàng)臨床指標(biāo)：如典型胸痛、缺血癥狀、心電圖病理性Q波形成、新發(fā)缺血性心電圖改變；血清肌酸激酶發(fā)病后6 h內(nèi)升高，24 h 達(dá)到高峰，4～72 h消失)；年齡30～70歲；病人于發(fā)病后2 h內(nèi)入院。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有心力衰竭、心瓣膜疾病病人；肺部疾病病人；血液系統(tǒng)疾病、急性腦血管疾病、感染性疾病。另選擇同期在醫(yī)院進(jìn)行體檢的健康體檢者40名作為對照組，其中男28名，女12名，年齡40～69(57.43±15.06)歲。兩組研究對象性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所有研究對象均簽署知情同意書，且本研究獲得醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法 對照組體檢時采集空腹靜脈血3 mL；AMI組發(fā)病后1～2 h、2～4 h、4～8 h、8～12 h分別采集空腹靜脈血3 mL，即時分離血清，-70 ℃保存待測。采用膠體金免疫層析法，使用CK-MB、cTnI、Myo三聯(lián)檢測試劑盒(基蛋生物科技股份有限公司，批號20050035)及FIA8000免疫定量分析儀檢測血cTnI、Myo、CK-MB含量。采用定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測miR-182、miR23a-3p，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，在PCR儀器上進(jìn)行擴(kuò)增，miR-23a引物序列：正向引物5′-ATCACATTGCCAGGGATTTCC-3′，反向引物5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′，miR-182引物序列：正向引物5′-TGCGGTTTGGCAATGGTAGAAC-3′，反向引物5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。反應(yīng)條件為94 ℃，30 s；55℃，60 s；72 ℃，45 s；進(jìn)行35個循環(huán)，結(jié)果在熒光定量操作系統(tǒng)中對比分析，計(jì)算相對定量。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn) cTnI正常參考值為0～0.5 μg/L，CK-MB正常參考值為0～25 U/L，Myo正常參考值為0～80 μg/L，若檢測數(shù)值高于正常參考值判斷為陽性。計(jì)算cTnI、CK-MB、Myo特異度和靈敏度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血清miR-182、miR-23a-3p、cTnI、CK-MB、Myo表達(dá)水平 AMI組miR-182、miR-23a-3p表達(dá)發(fā)病后1～2 h開始降低，8～12 h達(dá)到最低，且均低于對照組(P<0.05)。AMI組cTnI發(fā)病后1～2 h增加，8～12 h達(dá)峰值，不同時間均高于對照組(P<0.05)。AMI組CK-MB發(fā)病后1～2 h增加，4～8 h到達(dá)最高值，8～12 h開始回落，不同時間均高于對照組(P<0.05)。Myo發(fā)病后1～2 h達(dá)最大值，其他時間逐漸降低，AMI組不同時間均高于對照組(P<0.05)。詳見表1。對發(fā)病后1～2 h血清miR-182、miR-23a-3p、cTnI、CK-MB、Myo表達(dá)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果顯示：miR-182、miR-23a-3p與cTnI呈負(fù)相關(guān)(P<0.001)，與CK-MB不相關(guān)，與Myo呈正相關(guān)(P<0.001)。詳見表2。

表1 兩組不同時間血清miR-182、miR-23a-3p、cTnI、CK-MB、Myo表達(dá)水平比較

表2 AMI組發(fā)病后1～2 h miR-182、miR-23a-3p與cTnI、CK-MB、Myo的Pearson相關(guān)性分析

2.2 AMI組miR-182、miR-23a-3p、cTnI、CK-MB、Myo陽性檢出率 AMI組不同時間miR-182、miR-23a-3p、cTnI、CK-MB、Myo陽性檢出率均高于對照組(P<0.05)；發(fā)病后8～12 h，AMI組miR-182、miR-23a-3p、cTnI檢出率最高，發(fā)病后4～8 h CK-MB、Myo陽性檢出率最高。詳見表3。

表3 AMI組miR-182、miR-23a-3p、cTnI、CK-MB、Myo陽性檢出率 單位：例(%)

2.3 AMI病人發(fā)病后1～2 h miR-182、miR-23a-3p、cTnI、CK-MB、Myo靈敏度和特異度 AMI病人發(fā)病后1～2 h miR-182、miR-23a-3p、cTnI靈敏度均高于80%，其中miR-23-3p靈敏度最高，為92.5%；miR-182、miR-23a-3p、cTnI特異度均高于80%，cTnI特異度最高為87.5%。CK-MB、Myo靈敏度和特異度均較低。詳見表4。

表4 AMI病人發(fā)病后1～2 h miR-182、miR-23a-3p、cTnI、CK-MB、Myo靈敏度和特異度

2.4 AMI病人發(fā)病后1～2 h聯(lián)合檢測的靈敏度和特異度 miR-182、miR-23a-3p聯(lián)合檢測的靈敏度和特異度分別為90.0%和85.0%，cTnI、CK-MB、Myo聯(lián)合診斷的靈敏度和特異度分別為88.8%和82.5%，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表5。

表5 AMI病人發(fā)病后1～2 h聯(lián)合檢測的靈敏度和特異度

3 討 論

AMI死亡率高是由于早期不能做到及時準(zhǔn)確診斷，從而延誤了有效的治療時機(jī)。傳統(tǒng)的檢測指標(biāo)如心肌酶譜靈敏度和特異度較低，為37%～49%，易造成誤診漏診，延誤治療時間造成嚴(yán)重后果[8-9]。因此，進(jìn)行心臟損傷標(biāo)志物的臨床診斷研究，尋找具有較高靈敏度和特異度的指標(biāo)對臨床檢測至關(guān)重要，為了避免單一標(biāo)志物診斷不足，采用多種指標(biāo)聯(lián)合檢測方法。AMI病理機(jī)制之一是冠狀動脈粥樣硬化導(dǎo)致血管堵塞、脂質(zhì)積累、內(nèi)皮損傷、動脈粥樣硬化斑塊及引發(fā)的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡[10]。心肌細(xì)胞非正常凋亡是造成心肌梗死的主要原因，因此，減少細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)心肌細(xì)胞存活是治療AMI的主要方法[11]。

miRNA是小分子非編碼RNA，長約20個核苷酸，通過轉(zhuǎn)錄后機(jī)制調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)，對細(xì)胞、組織和器官功能發(fā)揮重要的調(diào)控作用，以調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡[12]。miRNA在細(xì)胞活動中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，有研究顯示，AMI早期缺血性壞死心肌細(xì)胞釋放多種miRNA，從而導(dǎo)致血漿miRNA表達(dá)譜改變。通過檢測血漿心肌特異性miRNA鑒別AMI，從而為AMI早期診斷提供依據(jù)[13-14]。有研究顯示，高表達(dá)miR-182通過調(diào)控p53實(shí)現(xiàn)促進(jìn)AMI細(xì)胞凋亡，miR-182表達(dá)下調(diào)有利于減少心肌細(xì)胞凋亡活動，這可能是由于機(jī)體的自我調(diào)節(jié)[15]。聶宇等[16]研究顯示，miR-23a-3p與心肌細(xì)胞生長密切相關(guān)，在新生大鼠心肌細(xì)胞肥大過程中發(fā)揮作用。本研究結(jié)果顯示，miR-182和miR-23a-3p發(fā)生心肌梗死1～2 h均降低，2～4 h、4～8 h、8～12 h均顯著低于對照組，提示這兩種指標(biāo)在心肌梗死發(fā)展中發(fā)揮作用。miR-182和miR-23a-3p與cTnI、Myo均有相關(guān)性，與CK-MB無相關(guān)性，分析原因是CK-MB表達(dá)隨著時間變化先升高后降低。AMI組不同時間miR-182和miR-23a-3p陽性檢出率均高于對照組，且特異度和靈敏度均較高，提示二者可作為檢測指標(biāo)。

cTnI對心肌損傷具有較高的靈敏度和特異度，是心肌特有的調(diào)節(jié)蛋白，cTnI特異性良好，具有較寬的時間窗，少量心肌細(xì)胞死亡導(dǎo)致血清濃度明顯升高，是臨床確診心肌損傷的標(biāo)志物[17-18]。CK-MB主要存在于心肌骨骼肌和腎細(xì)胞，是重要的能量調(diào)節(jié)酶，CK-MB濃度與心肌梗死關(guān)系密切，可反映心肌梗死面積大小[19]。有研究顯示，心肌細(xì)胞受損或凋亡后釋放大量CK-MB進(jìn)入血液，4～5 h后超過正常值，12～24 h到達(dá)峰值，48～72 h恢復(fù)正常水平[20]。CK-MB是重要的心肌酶譜之一，通常與其他指標(biāo)聯(lián)合檢測。Myo主要存在于心肌和骨骼肌，心肌梗死早期Myo濃度最早出現(xiàn)升高，心肌損傷后2 h可在血液檢測到，是AMI早期檢測的典型標(biāo)志物，由于骨骼肌損傷可能影響檢測結(jié)果，特異性較差[21-22]。本研究中血清cTnI、CK-MB、Myo不同時間表達(dá)均呈高表達(dá)，具有較高的陽性率、特異度和靈敏度。同時，miR-182和miR-23a-3p在AMI發(fā)病1～2 h檢測表達(dá)值降低，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且特異度和靈敏度較高，二者聯(lián)合檢測靈敏度為90.0%，特異度為85.0%均高于cTnI、CK-MB、Myo三者聯(lián)合診斷，miR-182和miR-23a-3p兩者聯(lián)合檢測與cTnI、CK-MB、Myo三者聯(lián)合檢測的靈敏度、特異度比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明miR-182和miR-23a-3p聯(lián)合檢測具有診斷AMI的有效性，可作為補(bǔ)充的檢測手段。

綜上所述，miR-182、miR-23a-3p可作為AMI早期檢測新型標(biāo)志物，聯(lián)合cTnI、CK-MB、Myo有利于提高急性心肌梗死早期診斷的準(zhǔn)確度。