曹蘇珊，薛 靜，王倩楠，張秀海，安賢惠

(1.江蘇海洋大學(xué) 海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇省海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222005；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院，北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，北京 100097)

小球藻(Chlorella)是一種單細(xì)胞真核藻類，屬綠藻門、綠藻綱、綠球藻目、小球藻科、小球藻屬[1]。作為最早開發(fā)的真核微藻之一，具有高營養(yǎng)價值、生長快速、結(jié)構(gòu)簡單、易工業(yè)化集成等顯著優(yōu)點(diǎn)。其細(xì)胞形態(tài)為球形或橢圓形，直徑3～12 μm，呈單生或聚集成群狀生長[2]，分布廣泛，多見于淡水、咸水和土壤中。作為地球上最早的生命之一，小球藻基因比較穩(wěn)定，至今未見有關(guān)其基因自發(fā)突變的報道。因其富含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、維生素、活性代謝產(chǎn)物等多種營養(yǎng)物質(zhì)而被公認(rèn)為具有高附加值和醫(yī)療保健作用，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于保健食品[3]、水產(chǎn)養(yǎng)殖[4]、生物能源[5]等方面，關(guān)于小球藻生物技術(shù)的研究主要集中在基因組學(xué)[6]、分子遺傳學(xué)[7]、代謝機(jī)理[8]、大規(guī)模培養(yǎng)[9]等方向。

小球藻具有通過基因工程表達(dá)外源基因進(jìn)而規(guī)?；a(chǎn)外源蛋白的潛在特質(zhì)，而且具有低成本、環(huán)境友好等優(yōu)勢，用于真核生物基因表達(dá)前景廣闊[10-12]。我國常見培養(yǎng)的小球藻種類有蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)、橢圓小球藻(C.ellipsoidea)和普通小球藻(C.vulgaris)[13]，都可作為優(yōu)質(zhì)的蛋白來源，同時也是進(jìn)行生物技術(shù)研究的良好材料。截至目前，據(jù)不完全統(tǒng)計，有超過12種小球藻實(shí)現(xiàn)了遺傳轉(zhuǎn)化[14]。

1 小球藻遺傳轉(zhuǎn)化影響因素

1.1 轉(zhuǎn)化受體的預(yù)處理

小球藻的細(xì)胞壁主要是由微纖維和基質(zhì)構(gòu)成，主要成分是蛋白質(zhì)、纖維素、葡糖胺以及脂質(zhì)等。研究者在電鏡下觀察到小球藻表面由直徑為3～5 nm的微纖維不規(guī)則地交織在連續(xù)網(wǎng)絡(luò)狀的細(xì)胞壁上，將整個基質(zhì)包圍。微纖交織維貫穿于整個細(xì)胞壁，并沿兩個不同的方向延伸，夾角近似為直角?；|(zhì)外表面為顆粒狀，電鏡檢測和酶處理顯示，這些顆粒主要分布在細(xì)胞壁外表面和細(xì)胞壁內(nèi)表面[15]。這一方面為細(xì)胞提供了強(qiáng)大的防御能力，另一方面也導(dǎo)致小球藻細(xì)胞壁較厚且硬、成分復(fù)雜、難以輕易去除，在一部分轉(zhuǎn)化方法中需要先通過弱化細(xì)胞壁形成原生質(zhì)體從而提高遺傳轉(zhuǎn)化效率[16-17]。小球藻原生質(zhì)體主要通過物理方法如研磨法、超聲波法或者生物方法如酶解法來制備[15]。研磨法和超聲波法因?yàn)樾枰ㄟ^物理因素來施加外力，導(dǎo)致小球藻死亡率升高，不利于后續(xù)對小球藻的進(jìn)一步利用；而酶解法通過利用溫和的生物方法更有利于制備原生質(zhì)體，以獲得高活力與高收獲率的原生質(zhì)體為前提，結(jié)合不同的轉(zhuǎn)化方法使轉(zhuǎn)化效率得到提升。

目前小球藻原生質(zhì)體的制備并未達(dá)到成熟階段[18]。由于小球藻細(xì)胞壁成分復(fù)雜多樣，利用單一種類的酶對細(xì)胞壁進(jìn)行酶解并不能達(dá)到理想效果，研究者開始利用不同種類的酶以不同比例混合對小球藻細(xì)胞進(jìn)行酶解，以期達(dá)到良好的原生質(zhì)體獲取率。早在1982年，Yamada等[19]已經(jīng)成功制備出小球藻原生質(zhì)體，并發(fā)現(xiàn)不同藻株之間細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)可能存在差異；Hatano等[20]以酶液混合物獲得橢圓小球藻的原生質(zhì)體；Cho等[21]用纖維素酶對小球藻進(jìn)行酶解處理，也可以有效去除細(xì)胞壁；Kumar等[22]先對小球藻酶解后再進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，成功將青色熒光蛋白(CFP)基因和綠色熒光(GFP)基因在其中進(jìn)行整合表達(dá)。也有研究者通過在培養(yǎng)基中添加2-脫氧-D-葡萄糖(2-DG)增加細(xì)胞通透性，以此更高效制備原生質(zhì)體。謝偉民等[23]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過2-DG預(yù)培養(yǎng)的小球藻酶解處理獲得的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率明顯高于未經(jīng)2-DG預(yù)培養(yǎng)的小球藻原生質(zhì)體。陳波[24]將普通小球藻在酶解前用2-DG預(yù)處理，得到了37%的原生質(zhì)體形成率。

1.2 選擇標(biāo)記的篩選

在小球藻基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中，選擇合適的選擇標(biāo)記基因十分關(guān)鍵。目前的選擇標(biāo)記基因缺乏多樣性，通常使用抗生素進(jìn)行標(biāo)記篩選，利用對受體細(xì)胞致死的抗生素培養(yǎng)基來選擇含有抗生素抗性基因的質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。小球藻中常用的選擇標(biāo)記基因主要包括nptⅡ(產(chǎn)生G418、卡那霉素、新霉素抗性)[25]、ble(產(chǎn)生博來霉素抗性)[17]、hpt(產(chǎn)生潮霉素抗性)[26]和cat基因(產(chǎn)生氯霉素抗性)[27]。部分常用抗生素對不同小球藻最佳作用質(zhì)量濃度見表1。

在小球藻的篩選中要本著篩選標(biāo)記對小球藻的作用劑量小、除菌效果良好且對小球藻生長不產(chǎn)生影響的原則，以提高篩選效果[35]。綜合目前研究可見，試驗(yàn)中常用的篩選標(biāo)記是G418和潮霉素，但不同種類并不完全一致(表1)。

表1 部分抗生素對不同種類小球藻最佳作用質(zhì)量濃度Tab.1 The optimal concentration of some antibiotics for different species of green alga Chlorella

1.3 轉(zhuǎn)化方法的選擇

Jarvis等[37]于1991年首次利用聚乙二醇(PEG)融合法在橢圓小球藻中成功表達(dá)出熒光素酶。Dawson等[38]于1997年在硝酸還原酶基因缺失的小球藻(C.sorokiniana)突變藻株中利用粒子轟擊的方法將硝酸還原酶基因?qū)胨拗鞑⑶冶磉_(dá)，得到了可以在硝酸鹽環(huán)境中生長的轉(zhuǎn)化株。當(dāng)前研究對小球藻經(jīng)常使用的轉(zhuǎn)化方法主要為農(nóng)桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)法[32]、電擊法[26]、粒子轟擊法[39]以及PEG融合法[37]。分別簡要闡述4種轉(zhuǎn)化方法及其優(yōu)缺點(diǎn)，同時分析并展望新型轉(zhuǎn)化方法。

1.3.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化已經(jīng)在部分微藻中成功應(yīng)用，是一種可行的小球藻轉(zhuǎn)化方法。這種方法通常在植物中表現(xiàn)為低基因拷貝數(shù)的高比例轉(zhuǎn)化[40]。作為一種自然界中天然存在的轉(zhuǎn)化方法，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對設(shè)備要求低、轉(zhuǎn)化效率高、外源基因易整合，但轉(zhuǎn)化過程中操作步驟復(fù)雜、轉(zhuǎn)化后小球藻需要進(jìn)行除菌處理。

Cha等[32]等使用含有綠色熒光蛋白基因∶β-葡萄糖苷酸酶基因(GFP∶GUS)的融合報道基因和花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子驅(qū)動的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的二元載體pCAMBIA1304通過農(nóng)桿菌在小球藻中進(jìn)行表達(dá)，在確定乙酰丁香酮含量、農(nóng)桿菌與藻細(xì)胞共培養(yǎng)時間、溫度等條件后，得到25%GUS陽性藻細(xì)胞。在Ma等[25]的研究中，透明顫菌血紅蛋白基因(vgb)也通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法被轉(zhuǎn)入小球藻中，明顯改善了小球藻的細(xì)胞生長和葉黃素產(chǎn)量。Lou等[16]將β-胡蘿卜素羥化酶基因(crtRB)和玉米黃素剪切雙加氧酶基因(ZCD1)利用農(nóng)桿菌在小球藻中表達(dá)，使其可以產(chǎn)生藏花酸。目前農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化體系的影響因素主要包括：小球藻預(yù)培養(yǎng)時間、農(nóng)桿菌狀態(tài)和含量以及共培養(yǎng)的條件等，可以通過優(yōu)化以上參數(shù)提高轉(zhuǎn)化效率[32]。

1.3.2 電擊法

電擊法是小球藻轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中較為常用的轉(zhuǎn)化方法。此方法是利用外界的物理力量，在適當(dāng)?shù)臈l件和含量下通過對細(xì)胞施加短時間的高強(qiáng)度電場而打開短時間的微孔，從而達(dá)到將外源基因運(yùn)送到細(xì)胞中并且進(jìn)行基因整合的目的。電擊轉(zhuǎn)化過程中緩沖液濃度、藻細(xì)胞培養(yǎng)周期、DNA濃度等因素均對轉(zhuǎn)化效率有重要的影響[41]。

牟云等[42]通過構(gòu)建電擊轉(zhuǎn)化體系在沙漠小球藻中成功表達(dá)人乳鐵蛋白。Zhang等[43]通過電穿孔的方法將來自大豆的轉(zhuǎn)錄因子GmDof4基因轉(zhuǎn)化到小球藻中，脂質(zhì)含量顯著提高46.4%～52.9%。另外，在一些研究中，為了防止可能出現(xiàn)因小球藻細(xì)胞壁較厚而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率偏低的情況，制備原生質(zhì)體再進(jìn)行電穿孔也是一種可行的方法[22]。電擊法操作相對簡單、轉(zhuǎn)化效率高且具有可重復(fù)性。雖然電擊法因其高強(qiáng)度的電場可以瞬間將外源基因?qū)爰?xì)胞中，但一些情況下因其電場強(qiáng)度過高也可能出現(xiàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化偶然性、細(xì)胞死亡率升高的情況。因此，電場強(qiáng)度的控制十分重要。

1.3.3 聚乙二醇融合法

聚乙二醇融合法是一種簡單有效的轉(zhuǎn)化方法。主要是將包括外源DNA、小球藻原生質(zhì)體、聚乙二醇和玻璃珠混合在一起進(jìn)行攪拌。借助聚乙二醇將原生質(zhì)體暴露于外源DNA中，促進(jìn)DNA滲入細(xì)胞中。該方法與電擊法相比轉(zhuǎn)化效率相對較低[44]，但因其操作簡單、成本低廉且不需要專門的設(shè)備，仍具有一定優(yōu)勢。

在一些小球藻中，已經(jīng)利用該方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化表達(dá)。Yang等[45]通過表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)成功構(gòu)建聚乙二醇介導(dǎo)的小球藻轉(zhuǎn)化體系。Hawkins等[46]曾采用聚乙二醇轉(zhuǎn)化法將人生長激素基因(hGH)在小球藻中進(jìn)行了瞬時表達(dá)，并檢測到hGH表達(dá)量有所提高。

1.3.4 基因槍法

基因槍法是一種廣泛使用和有效簡單的可重復(fù)的轉(zhuǎn)換方法。這種方法幾乎適用于所有類型，包括細(xì)胞壁堅硬的小球藻。該方法將外源DNA包裹在微米級的鎢粉或金粉中，然后在真空狀態(tài)下通過粒子轟擊槍加速對受體細(xì)胞進(jìn)行轟擊，實(shí)現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)化[38]。一些研究證明粒子轟擊對小球藻的轉(zhuǎn)化有效，El-Sheekh等[47-48]分別在小球藻(C.kessleri)和橢圓小球藻中成功表達(dá)GUS基因。

基因槍法主要受轟擊壓力、轟擊距離、載體情況及DNA含量等因素影響[47]。這種方法操作簡單、試驗(yàn)周期短，但其局限性在于使用儀器昂貴、轉(zhuǎn)化效率偏低，而且考慮到小球藻的直徑為3～12 μm，需要使用較小尺寸的微粒使其更容易進(jìn)入小球藻細(xì)胞內(nèi)。

1.3.5 納米磁珠轉(zhuǎn)化法

隨著生物技術(shù)與物理技術(shù)迅速交叉發(fā)展，納米技術(shù)在生物領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛，具有基因運(yùn)載功能的納米載體已經(jīng)成功運(yùn)用到動物細(xì)胞、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。納米磁珠傳遞法作為一種新型轉(zhuǎn)化方法，主要表現(xiàn)為納米磁性顆粒攜帶核酸在磁力作用下進(jìn)行磁力傳遞，在短時間內(nèi)將目的基因遞送至靶細(xì)胞，目前納米載體表現(xiàn)出轉(zhuǎn)染效率高、操作方便等優(yōu)點(diǎn)[49]。美國愛荷華州立大學(xué)的科學(xué)家首次報道利用納米二氧化硅多孔顆粒裝載基因及表達(dá)調(diào)控物質(zhì)，成功轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，并獲得轉(zhuǎn)基因植株[50]。我國研究者通過納米磁珠介導(dǎo)法成功將外源基因在棉花[49]、牡丹[51]等植物中轉(zhuǎn)化表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)室開展了利用不同粒徑的納米磁珠對小球藻進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的研究，得到了外源基因成功表達(dá)的陽性藻株(待發(fā)表)，同時為小球藻的轉(zhuǎn)基因方法提供了一個新的思路。

1.4 基因表達(dá)元件

小球藻遺傳轉(zhuǎn)化研究中通常使用的外源性啟動子有花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子[25,52-53]。玉米多聚泛素蛋白Ubiquitin和水稻肌動蛋白Actin也逐漸應(yīng)用于促進(jìn)外源基因在小球藻中的表達(dá)[17,43,54]。誘導(dǎo)型啟動子也在不斷地用于小球藻轉(zhuǎn)化表達(dá)的試驗(yàn)中，Niu等[27]鑒定了來自三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)的編碼硝酸還原酶(NR)基因的啟動子，其可以在作為唯一氮源的硝態(tài)氮存在下驅(qū)動轉(zhuǎn)化的cat報告基因在小球藻中的誘導(dǎo)型表達(dá)。劉曉鵬[55]在吲哚乙酸(IAA)誘導(dǎo)條件下，利用應(yīng)答植物生長素信號的DR5啟動子驅(qū)動GFP在小球藻內(nèi)實(shí)現(xiàn)表達(dá)。

小球藻自身的內(nèi)源性啟動子同樣具有驅(qū)動小球藻轉(zhuǎn)化表達(dá)的功能。Liu等[56]證明，小球藻八氫番茄紅素去飽和酶(PDS)基因啟動子、硝酸還原酶(NIT)基因啟動子和來源于核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶小亞基(RBCS)基因啟動子均能成功驅(qū)動PDS基因在小球藻表達(dá)。小球藻病毒啟動子也能夠驅(qū)動外源基因在小球藻中表達(dá)[57]。因此可以不斷開發(fā)小球藻病毒作為高效啟動子的重要來源來進(jìn)行關(guān)于小球藻轉(zhuǎn)化的深入研究。

增強(qiáng)子可以激活靶啟動子的轉(zhuǎn)錄，和啟動子共同作用強(qiáng)化外源基因表達(dá)。Chen等[58]研究了5種不同啟動子對GUS基因轉(zhuǎn)化小球藻的影響，發(fā)現(xiàn)與來自煙草花葉病毒的Ω增強(qiáng)子串聯(lián)的Ubiquitin啟動子驅(qū)動GUS基因在小球藻中的表達(dá)效率高于其他啟動子，證明增強(qiáng)子可以增強(qiáng)小球藻的外源基因表達(dá)。一部分內(nèi)含子也可能起到增強(qiáng)表達(dá)的功能，Liu等[56]在提高小球藻表達(dá)蝦青素含量的研究中發(fā)現(xiàn)，保留PDS基因的第一個內(nèi)含子可以提高91%的表達(dá)效率。

隨著對小球藻研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)除了高效的轉(zhuǎn)化方法、轉(zhuǎn)化載體，外源基因插入后小球藻對外源基因的整合、轉(zhuǎn)錄等表達(dá)調(diào)控過程同樣對轉(zhuǎn)化結(jié)果產(chǎn)生影響[43]。由于小球藻基因工程起步晚，當(dāng)前對小球藻中基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)理尚未完全清楚，因此外源基因插入的機(jī)制、遺傳表達(dá)的修飾等問題是當(dāng)前值得探討研究的重要方向。

2 外源蛋白表達(dá)

當(dāng)前利用小球藻作為生物反應(yīng)器使外源蛋白進(jìn)行高效表達(dá)并未達(dá)到產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模，主要原因是外源蛋白表達(dá)不穩(wěn)定、表達(dá)產(chǎn)量不夠高甚至是微量的。因此目前的研究主要集中在利用不同方法轉(zhuǎn)化的外源基因表達(dá)量及其生物活性分析[59-60]。一些不同外源蛋白在小球藻中表達(dá)含量的差異見表2。

表2 不同外源蛋白在小球藻中表達(dá)量Tab.2 Expression of different exogenous proteins in green alga Chlorella

當(dāng)前已經(jīng)有越來越多不同種類外源蛋白成功在小球藻中進(jìn)行表達(dá)，并呈現(xiàn)出一定活性(表2)，這證明小球藻在不同領(lǐng)域均具有巨大的潛力，同時提高外源基因在小球藻中的表達(dá)活力也成為一項(xiàng)必不可少的工作。

3 展 望

作為一種應(yīng)用前景廣泛的工業(yè)藻種，近年來關(guān)于外源基因在小球藻中轉(zhuǎn)化表達(dá)的研究不斷更新，豐富了小球藻生產(chǎn)有價值化合物的可能性。目前小球藻遺傳轉(zhuǎn)化工作還存在以下瓶頸有待解決：(1)小球藻遺傳信息與種質(zhì)信息不夠清晰；(2)轉(zhuǎn)化體系和方法有待進(jìn)一步優(yōu)化；(3)外源基因插入的表達(dá)調(diào)控機(jī)制對外源蛋白表達(dá)的影響。

對于外源基因在小球藻中高效表達(dá)體系的完善，可以從不同方面進(jìn)行：(1)研究小球藻物種的遺傳信息、對小球藻自身功能性基因的克隆與分析，并將小球藻自身的一部分基因應(yīng)用于其他高等植物或者微藻中的研究，有利于推進(jìn)小球藻遺傳轉(zhuǎn)化的進(jìn)程[62]。同時擴(kuò)大當(dāng)前已有的小球藻種類信息，獲得優(yōu)質(zhì)小球藻藻種，并從中發(fā)現(xiàn)更具應(yīng)用價值的物種，同樣可以加快小球藻生物技術(shù)的研究速度。(2)通過優(yōu)化現(xiàn)有轉(zhuǎn)化體系參數(shù)及開發(fā)新型小球藻轉(zhuǎn)化方法改善外源基因在小球藻中的表達(dá)效果。在轉(zhuǎn)化過程中開發(fā)利用新型高效啟動子、增強(qiáng)子等相關(guān)元件，制備高活力原生質(zhì)體，對轉(zhuǎn)化方法中的關(guān)鍵步驟進(jìn)行工藝改善，以及對轉(zhuǎn)化成功的藻種發(fā)酵條件優(yōu)化等小球藻轉(zhuǎn)化體系上游和下游工作的改進(jìn)對于外源基因在小球藻中表達(dá)效率的提高十分關(guān)鍵。同時在優(yōu)化現(xiàn)有轉(zhuǎn)化體系參數(shù)的基礎(chǔ)上，不斷研發(fā)安全高效的新型轉(zhuǎn)化方法，可以從不同途徑改善小球藻轉(zhuǎn)化過程中存在的不足。將新型納米載體技術(shù)應(yīng)用于小球藻轉(zhuǎn)化研究中，不但可以簡化傳統(tǒng)轉(zhuǎn)化方法的操作步驟，同時在提高轉(zhuǎn)化效率方面存在優(yōu)勢。(3)外源基因插入后的轉(zhuǎn)錄、翻譯、翻譯后修飾機(jī)制，外源蛋白是否被水解對高效表達(dá)產(chǎn)生重要影響。外源基因未表達(dá)的情況可能是由于存在多基因整合以及轉(zhuǎn)錄基因沉默(TGC)或轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGC)機(jī)制，這種機(jī)制在其他植物中出現(xiàn)，推測可能在小球藻中也會發(fā)生類似情況。外源重組蛋白通常被宿主細(xì)胞識別為外來細(xì)胞，相比于內(nèi)源蛋白有可能更快地發(fā)生降解[63]，推測小球藻外源基因轉(zhuǎn)化產(chǎn)物產(chǎn)量不高，可能部分是由此造成的。因此，深入探究小球藻轉(zhuǎn)化過程的分子機(jī)制有助于清晰外源基因在小球藻中的表達(dá)修飾等情況。

小球藻作為外源基因轉(zhuǎn)化宿主具有眾多優(yōu)點(diǎn)，在培養(yǎng)方面，可以在可控制的條件下高密度生長，短時間內(nèi)積累大量生物活性物質(zhì)；在應(yīng)用方面，可以作為健康無毒害的功能食品直接使用，用作表達(dá)系統(tǒng)時可以對蛋白進(jìn)行高水平的翻譯后修飾，而且翻譯后修飾機(jī)制與哺乳動物接近，因此可以用于生產(chǎn)如重組疫苗、抗體等有用物質(zhì)，應(yīng)用于水產(chǎn)、醫(yī)療等行業(yè)，這些使其相比于其他植物具有巨大的競爭優(yōu)勢。因此在優(yōu)化小球藻轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和發(fā)展小球藻轉(zhuǎn)化方法等方向不斷努力取得良好進(jìn)展，使其在產(chǎn)業(yè)化開發(fā)生產(chǎn)上不斷推進(jìn)，在生物技術(shù)方面應(yīng)用更加廣泛。