尹偉力，吳 葳，劉曉靜，馬曉玲，韓 偉，吳寧寧，陳燕平

(1.煙臺海關(guān)技術(shù)中心，山東 煙臺 264000；2.武漢農(nóng)業(yè)檢測中心，湖北 武漢 430016；3.榮成海關(guān)，山東 榮成 264300；4.上海醫(yī)藥集團 青島國風藥業(yè)股份有限公司，山東 青島 266000；5.青島海關(guān)技術(shù)中心，山東 青島 266000)

2014年9月，浙江省養(yǎng)殖的凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)暴發(fā)了一種高死亡率的新疫病，患病蝦出現(xiàn)蝦殼變軟、顏色變淡，空胃，伴隨肝胰腺萎縮[1]。經(jīng)中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所研究表明，這種疾病是由一種新發(fā)現(xiàn)的虹彩病毒引起的，命名為十足目虹彩病毒1(Decapodiridescentvirus1，DIV1)[2-3]，舊稱為蝦血細胞虹彩病毒(SHIV)。對主要衣殼蛋白(MCP)和ATP酶的氨基酸序列分析，該病毒屬于虹彩病毒科下的一個新屬[4]。流行病學調(diào)查結(jié)果顯示，十足目虹彩病毒1也可感染中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)和羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)[5-6]。近年來，該病已蔓延至我國沿海部分地區(qū)，并有加速擴散趨勢，若未有效防控，將成為嚴重影響我國蝦類養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的疫病之一。

蝦類疫病的傳統(tǒng)檢測方法是PCR[7]，但該方法需要專用擴增儀器，不適合基層及現(xiàn)場快速檢測。近來，愈來愈多操作簡便、檢測周期短的分子生物檢測技術(shù)廣泛應(yīng)用于十足目虹彩病毒1，其中，重組酶聚合酶擴增技術(shù)(RPA)發(fā)展較為迅速。該技術(shù)無需造價高昂的升降溫儀器，在恒溫條件下20 min內(nèi)即可完成核酸擴增，反應(yīng)快速而靈敏，擴增產(chǎn)物可以通過構(gòu)建熒光探針法進行實時定量檢測，也可以與DNA芯片、瓊脂糖凝膠電泳、側(cè)流層析試紙條等多種檢測技術(shù)相結(jié)合進行檢測[8-10]，適合基層實驗室及一線口岸的現(xiàn)場檢測。筆者根據(jù)十足目虹彩病毒1保守序列ATP酶基因設(shè)計了一對特異性引物，基于重組酶聚合酶擴增技術(shù)，建立一種操作簡便、檢測時間短、特異性好、靈敏度高的僅需普通恒溫設(shè)備的十足目虹彩病毒1檢測方法，適用于一線口岸實驗室的現(xiàn)場檢測，可以有效對十足目虹彩病毒1進行早期監(jiān)控及日常檢測。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料

白斑綜合征病毒(WSSV)泰國株由本實驗室保存，十足目虹彩病毒1、傳染性皮下造血器官壞死病毒(IHHNV)廣西株、Taura綜合征病毒(TSV)ZHZC3 株、黃頭病毒基因1型(YHV-1) Qingdao201603 株由廣西水產(chǎn)研究科學院提供。

2016—2018年，共采集國內(nèi)養(yǎng)殖蝦樣品509批，每批至少30尾。蝦類主要有中國明對蝦、斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)、羅氏沼蝦、凡納濱對蝦。采集蝦苗、幼蝦和成蝦，取每尾蝦的鰓、血淋巴、胃部和腹部肌肉。

DNA和RNA提取試劑盒(西安天隆科技有限公司)；質(zhì)粒DNA抽提試劑盒、Pmd18-T載體、DL2000 Marker、PCR Master Mix[寶生物工程(大連)有限公司]；重組酶及聚合酶試劑盒(北京強欣博瑞生物科技有限公司)。

1.2 引物設(shè)計

登錄GenBank，根據(jù)已發(fā)表的十足目虹彩病毒1的ATP酶基因(KY681040)保守序列，參照重組酶聚合酶擴增技術(shù)引物設(shè)計要求[11-12]設(shè)計引物，上下游引物序列如下：

上游引物S1:5′-GACAGGAGAGGGAAATAACGGGAAAACGGT-3′(KY681040中318～347位點)；下游引物S2:5′-ATTTGGTTCATCCATGACTGCCCATCTAACA-3′(KY681040中471～501位點)。預期擴增條帶為184 bp。采用中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所的巢式PCR的引物，進行巢式PCR。

第1輪PCR引物:F1,5′-GGGCGGGAGATGGTGTTAGAT-3′;R1,5′-TCGTTTCGGTACGA AGATGTA-3′。第2輪PCR引物:F2,5′-CGGGA AACGATTCGTATTGGG-3;R2,5′-TTGCTTGA TCGGCATCCTTGA-3′。上述引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 重組酶聚合酶擴增技術(shù)的優(yōu)化

構(gòu)建50 μL重組酶聚合酶擴增技術(shù)反應(yīng)體系：向含有重組酶及聚合酶的反應(yīng)管中加入25 μL(2×)反應(yīng)緩沖液、濃度為5 μmol/L的上下游引物S1、S2各4 μL，加入模板DNA 2.0 μL，加入雙蒸水至總體積為47.5 μL后混合均勻，加入2.5 μL濃度為280 mmol/L的醋酸鎂溶液后充分混勻。試驗共設(shè)置25、30、35、40、42 ℃ 5個溫度梯度，探尋最優(yōu)反應(yīng)溫度，同時設(shè)置空白對照。將待優(yōu)化樣品放置于金屬浴內(nèi)，37 ℃條件下，反應(yīng)時長為30 min，經(jīng)瓊脂糖電泳分析擴增產(chǎn)物確定最佳反應(yīng)溫度。以相同反應(yīng)體系，在最優(yōu)反應(yīng)溫度條件下優(yōu)化反應(yīng)時間，恒溫孵育15、20、25、30 min，產(chǎn)物經(jīng)電泳分析確定最優(yōu)反應(yīng)時間。最終確定完整的重組酶聚合酶擴增技術(shù)反應(yīng)體系。

1.4 G基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

參照文獻[13]設(shè)計的擴增十足目虹彩病毒1 ATP酶基因的引物進行PCR擴增，將擴增目的片段進行膠回收，純化后連接pMD18-T載體構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-S，將構(gòu)建好的陽性質(zhì)粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列分析鑒定。測定pMD18-S質(zhì)粒含量，計算拷貝數(shù)。

1.5 重組酶聚合酶擴增技術(shù)特異性試驗

利用DNA提取試劑盒提取十足目虹彩病毒1、白斑綜合征病毒、傳染性皮下造血器官壞死病毒病毒株的DNA；利用RNA提取試劑盒提取Taura綜合征病毒、YHDV-1，以RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以上述DNA、cDNA作為模板，利用建立的重組酶聚合酶擴增技術(shù)方法進行檢測，對該方法的特異性進行評價。

1.6 重組酶聚合酶擴增技術(shù)靈敏度試驗

以倍比稀釋的重組質(zhì)粒pMD18-G作為模板進行重組酶聚合酶擴增技術(shù)反應(yīng)，確定該方法的敏感性。同時采用中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所設(shè)計的巢式PCR[6]對重組質(zhì)粒進行PCR，比較兩種方法的檢測結(jié)果。

1.7 臨床樣品的檢測

采集自養(yǎng)殖場的樣品中，整個蝦苗被用作樣本；幼蝦和成蝦取鰓等組織均勻化以提取DNA，利用建立的重組酶聚合酶擴增技術(shù)進行檢測。50 μL反應(yīng)體系，其中25 μL反應(yīng)緩沖液(2×)、上下游引物S1、S2(5 μmol/L)各4 μL以及2.0 μL 樣品DNA，用雙蒸水補至總體積為47.5 μL后充分混勻，加入2.5 μL 280 mmol/L醋酸鎂溶液并混合均勻。同時利用巢式PCR方法檢測，比較二者結(jié)果。

引物F1和R1進行第1輪PCR，反應(yīng)體系：PCR Master Mix 12.5 μL，引物 F1 (10 pmol/μL)和R1 (10 pmol/μL)各1 μL，樣品DNA 2 μL，加ddH2O至25 μL。反應(yīng)程序:94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，共36個循環(huán)；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。第1輪PCR預計目標條帶為457 bp。

第1輪的產(chǎn)物稀釋100倍后作為第2輪的模板。使用第2輪PCR的特異性引物F2和R2再次進行PCR。反應(yīng)體系和程序與第1輪PCR一致。反應(yīng)結(jié)束后產(chǎn)物經(jīng)電泳分析預測目標條帶為129 bp。

2 結(jié) 果

2.1 ATP酶基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以十足目虹彩病毒1基因組DNA為模板擴增ATP酶基因，提取擴增片段后純化，連接載體轉(zhuǎn)化，對重組質(zhì)粒pMD18-S進行篩選，重組質(zhì)粒經(jīng)PCR擴增鑒定，結(jié)果顯示，擴增出一條約1200 bp的片段，與設(shè)計相符，表明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMD18-S。用核酸蛋白檢測儀測定pMD18-S的含量，根據(jù)公式計算出拷貝數(shù)為7.0×1010拷貝/μL(圖1)。

圖1 ATP酶基因重組質(zhì)粒的PCR鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of recombinant plasmid ATPase gene by PCRM.DL2000;1.ATP酶基因;2.陰性對照.M.DL2000;1.ATPase gene;2.negative control.

2.2 十足目虹彩病毒1的重組酶聚合酶擴增技術(shù)建立

設(shè)置5個溫度梯度，用以摸索最佳反應(yīng)溫度。擴增結(jié)果顯示，溫度為25～42 ℃時，均可以擴增出184 bp的特異性目的條帶。擴增溫度設(shè)置為35、40、42 ℃時，由圖2a可見，除目的條帶外，還出現(xiàn)了微弱的非目的條帶。擴增溫度為25 ℃時擴增的目的條帶不如30 ℃的擴增條帶明亮，因此十足目虹彩病毒1的最佳擴增溫度最終確定為30 ℃。在30 ℃下重組酶聚合酶擴增反應(yīng)，20 min反應(yīng)時間特異性條帶比15 min更清晰明亮，因此20 min為十足目虹彩病毒1的最優(yōu)擴增時長(圖2b)。

圖2 十足目虹彩病毒1的重組酶聚合酶擴增技術(shù)優(yōu)化試驗Fig.2 Optimization test of RPA for DIV1a:M.DL2000;1.陰性對照negative control;2.25 ℃;3.30 ℃;4.35 ℃;5.40 ℃;6.42 ℃.b:M.DL2000;1.陰性對照negative control;2.15 min;3.20 min;4.25 min;5.30 min.

2.3 重組酶聚合酶擴增技術(shù)的特異性試驗

運用建立的重組酶聚合酶擴增技術(shù)對十足目虹彩病毒1、白斑綜合征病毒和傳染性皮下造血器官壞死病毒的DNA，以及Taura綜合征病毒和黃頭病毒基因1型cDNA進行檢測，結(jié)果顯示，只有十足目虹彩病毒1在約184 bp處出現(xiàn)明顯的特異性條帶，其余4種病毒均未出現(xiàn)特異性擴增條帶(圖3)。表明所建立的重組酶聚合酶擴增技術(shù)檢測方法具有較好的特異性。

圖3 十足目虹彩病毒1的重組酶聚合酶擴增技術(shù)特異性試驗Fig.3 The specificity results of recombinase polymerase amplification technology(RPA) for DIV1 by RPAM.DL2000;1.十足目虹彩病毒1;2.白斑綜合征病毒;3.傳染性皮下造血器官壞死病毒;4.Taura綜合征病毒;5.黃頭病毒基因1型;6.陰性對照.M.DL2000;1.DIV1;2.WSSV;3.IHHNV;4.TSV;5.YHV-1;6.negative control.

2.4 重組酶聚合酶擴增技術(shù)與PCR方法靈敏度試驗

以倍比稀釋的重組質(zhì)粒pMD18-G(7.0×104～7.0×100拷貝/μL)為模板，進行靈敏度試驗，并與巢式PCR方法進行比較，結(jié)果顯示重組酶聚合酶擴增技術(shù)的檢測限為7拷貝/μL，遠高于巢式PCR方法的檢測限70拷貝/μL(圖4)，表明重組酶聚合酶擴增方法比PCR方法靈敏度高。

圖4 重組酶聚合酶擴增技術(shù)(a)與PCR(b)敏感性對比試驗Fig.4 Sensitivity test of RPA(a) compared with PCR(b)M.DL2000;1.7.0×104拷貝/μL;2.7.0×103拷貝/μL;3.7.0×102拷貝/μL;4.7.0×101拷貝/μL;5.7.0×100拷貝/μL;6.陰性對照.M.DL2000;1.7.0×104copies/μL;2.7.0×103 copies/μL;3.7.0×102 copies/μL;4.7.0×101 copies/μL;5.7.0×100copies/μL;6.negative control

2.5 臨床樣品的檢測

用建立好的重組酶聚合酶擴增技術(shù)法與巢式PCR方法對本實驗室采集的509份臨床樣品進行檢測。對比結(jié)果顯示，十足目虹彩病毒1的重組酶聚合酶擴增技術(shù)法與巢式PCR法的檢測結(jié)果相同，共檢測出13份陽性樣品，但巢式PCR檢測結(jié)果出現(xiàn)了2份弱陽性樣品(表1)，結(jié)果表明，十足目虹彩病毒1重組酶聚合酶擴增技術(shù)法可有效地檢出巢式PCR方法的弱陽性樣品，因此十足目虹彩病毒1重組酶聚合酶擴增技術(shù)法的靈敏度高于巢式PCR方法。

表1 重組酶聚合酶擴增技術(shù)法(RPA)和巢式PCR方法對臨床樣品檢測結(jié)果Tab.1 The detective result comparison of clinical samples by RPA and nested-PCR methods

3 討 論

3.1 重組酶聚合酶擴增技術(shù)的特異性試驗

十足目虹彩病毒1作為國內(nèi)新流行的蝦類疫病病原，是口岸檢疫的重要檢疫對象。因為蝦類病毒無法進行細胞培養(yǎng)，分子生物學技術(shù)成為主要檢測方法，如PCR、環(huán)介導等溫擴增等成為檢測蝦類病毒的主要檢測技術(shù)。這些方法還存在一些不足，PCR需要價值較高的變溫擴增儀，某些基層實驗室條件無法滿足，并且檢測周期較長，擴增時長約2～3 h；而環(huán)介導等溫擴增法需要設(shè)計2～3組引物，引物之間容易產(chǎn)生二聚體，造成結(jié)果假陽性[14-16]。與傳統(tǒng)核酸擴增技術(shù)相比，重組酶聚合酶擴增技術(shù)檢測周期短，0.5 h內(nèi)即可完成，無需變溫擴增儀，使用恒溫水浴鍋等普通設(shè)備即可完成，檢測靈敏度高，結(jié)果判定簡單、形式多樣化[17]。作為新發(fā)展起來的恒溫擴增技術(shù)，近些年被應(yīng)用于多種領(lǐng)域，如轉(zhuǎn)基因檢測、病原微生物檢驗、動物致病病原體檢疫等。鄧婷婷等[18]利用重組酶聚合酶擴增技術(shù)，建立了Cry1Ab/c基因的37 ℃恒溫快速檢測方法，可以鑒別轉(zhuǎn)基因水稻；劉立兵等[19]建立了可以在38 ℃恒溫條件下快速檢測豬細小病毒的重組酶聚合酶擴增技術(shù)。重組酶聚合酶擴增技術(shù)最佳反應(yīng)溫度在25～42 ℃，本試驗設(shè)置了25、30、35、40、42 ℃ 5個溫度梯度，對比各個溫度的擴增結(jié)果，確定30 ℃為最佳反應(yīng)溫度。在確定最優(yōu)反應(yīng)溫度后，設(shè)計了15、20、25、30 min 4個反應(yīng)時間，結(jié)果表明，20 min反應(yīng)時間特異性條帶比15 min更清晰明亮，因此20 min為十足目虹彩病毒1的最優(yōu)擴增時長。

3.2 重組酶聚合酶擴增技術(shù)的特異性試驗

引物設(shè)計是重組酶聚合酶擴增技術(shù)設(shè)計的核心。不同于PCR引物的設(shè)計，重組酶聚合酶擴增技術(shù)引物沒有專門的生物軟件，只可人工比對序列，在保守區(qū)域設(shè)計[20]。重組酶聚合酶擴增技術(shù)引物設(shè)計一般遵循以下幾個規(guī)律：一是重組酶聚合酶擴增技術(shù)引物長度不多于45 bp，最優(yōu)堿基數(shù)為30～35 bp，引物堿基數(shù)太少會影響與重組酶的結(jié)合，降低了擴增速度，但是堿基數(shù)大于45 bp的引物設(shè)計時會出現(xiàn)引物發(fā)夾、連續(xù)序列的重復、回文序列等問題，造成引物設(shè)計失敗[21-22]；二是擴增目的片段長度的選擇，重組酶聚合酶擴增技術(shù)目的片段通常長度在80～400 bp，100～200 bp之間的片段擴增效果最佳，靈敏度高，特異性好[23-24]。

3.3 重組酶聚合酶擴增技術(shù)的特異性和靈敏度

筆者根據(jù)十足目虹彩病毒1的ATP酶基因保守區(qū)域的序列設(shè)計了引物，建立了十足目虹彩病毒1的重組酶聚合酶擴增技術(shù)快速、準確的檢測方法。該方法在30 ℃效果最優(yōu)，無需昂貴的變溫儀器；20 min反應(yīng)即可完成檢測，相比常規(guī)的PCR方法，大大縮短了檢測時間，提高檢測效率；該方法對十足目虹彩病毒1的最低檢出限為7 拷貝/μL，比巢式PCR 70拷貝/μL的最低檢出限靈敏。夏小明[25]基于重組酶聚合酶擴增技術(shù)，建立了白斑綜合征病毒和傳染性皮下造血器官壞死病毒的重組酶聚合酶擴增技術(shù)快速檢測方法，最低檢出限分別為10拷貝/μL和4 拷貝/μL，與本試驗的檢出限類似，說明重組酶聚合酶擴增技術(shù)在水生動物病毒最低檢出限基本約為10拷貝/μL。利用本試驗建立的方法對國內(nèi)養(yǎng)殖場采集的509份臨床樣品進行重組酶聚合酶擴增技術(shù)檢測，采集樣品種類涉及國內(nèi)養(yǎng)殖最多的中國明對蝦、斑節(jié)對蝦、羅氏沼蝦、凡納濱對蝦等蝦類，其中凡納濱對蝦陽性率最高(6/293)。將重組酶聚合酶擴增技術(shù)法檢測的結(jié)果與巢式PCR法進行比較，重組酶聚合酶擴增技術(shù)法可以有效地檢出巢式PCR法的弱陽性樣品，且其余樣品重組酶聚合酶擴增技術(shù)法與巢式PCR法的檢測結(jié)果一致，證明重組酶聚合酶擴增技術(shù)檢測的靈敏度高于巢式PCR，避免假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。巢式PCR檢測出的弱陽性樣品因為擴增產(chǎn)物含量較低，無法進行測序分析，從而不能確定樣品檢測結(jié)果是否為陽性。

4 結(jié) 論

本試驗建立了十足目虹彩病毒1的重組酶聚合酶擴增技術(shù)快速檢測方法，20 min反應(yīng)即可完成檢測，最低檢出限為7 拷貝/μL。該方法快速靈敏、特異性好、操作簡便，適用于基層養(yǎng)殖單位和一線口岸的現(xiàn)場檢測。