閆登科，陶 麗，郝 潔，黃瑞娜，鐘加滕

(1.平頂山第一人民醫(yī)院消化內(nèi)二科，河南 平頂山 467000；2.鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 鄭州 450000；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院感染疾病科，河南 衛(wèi)輝 453100；4.新鄉(xiāng)醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院病理學教研室，河南 新鄉(xiāng)453003)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我國常見的惡性腫瘤之一，嚴重危害人們的身體健康，目前，HCC發(fā)病率和病死率呈上升趨勢，其主要治療手段為手術(shù)治療、放射治療和化學治療。隨著化學治療藥物的廣泛應用，HCC對藥物呈現(xiàn)出明顯的耐受，新的治療方案和聯(lián)合用藥策略的提出迫在眉睫。細胞內(nèi)泛素蛋白酶體降解途徑的異常與腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)?；诖?，研究者開發(fā)了多種靶向蛋白酶體的藥物，其中對硼替佐米的研究最為廣泛，其也是第1個應用于臨床研究的蛋白酶體抑制劑。目前臨床上硼替佐米主要應用于治療難治性、多發(fā)性骨髓瘤和套細胞淋巴瘤，其對肝癌細胞生物學行為的影響以及可能的作用機制尚不清楚。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一個動態(tài)、特化、拉長的膜狀網(wǎng)絡小管和扁平圓盤，其以囊狀連接橫跨細胞質(zhì)的大部分區(qū)域和分支管[1]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)參與細胞的多種生物學過程，包括生物合成和維持細胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)等[1]。同時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可以與細胞內(nèi)其他細胞器協(xié)調(diào)作用，感知細胞內(nèi)外各種因子的作用，維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)[2-3]。研究顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)調(diào)控著細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊與加工，包括加速適當?shù)牡鞍踪|(zhì)折疊、未折疊蛋白反應的激活和通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解或自噬的蛋白質(zhì)清除過程[4]，當出現(xiàn)大量的錯誤折疊或未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)聚集會導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激[5]。近年來研究顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用，特別是在抗腫瘤藥物誘導腫瘤細胞凋亡的過程中[6-7]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激往往在癌癥的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著雙向調(diào)控作用，既可以引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激保護機制，也可以通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)凋亡信號通路誘導細胞凋亡的發(fā)生[8]。本研究將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激引入硼替佐米的作用機制研究中，通過體外實驗明確靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激對肝癌細胞的硼替佐米耐受性的影響，為臨床克服腫瘤耐藥和尋找可能的聯(lián)合用藥策略提供一定的方向和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞、儀器與試劑人肝癌HepG2和HuH7細胞購自中國科學院細胞庫；細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher Scientific公司，細胞計數(shù)試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)購自南京碧云天生物試劑有限公司，Western blot電泳套裝購自美國Bio-Rad公司；胎牛血清、達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium,DMEM)購自美國Gibco公司，硼替佐米、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)抑制劑4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid,4-PBA)和?；敲撗跄懰?taurourso-deoxycholic acid,TUDCA)購自美國MCE公司，切割片段的半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase，cleaved caspase-3)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)、磷酸化真核翻譯起始因子2α(phosphorylated eukaryotic initiation factor-2α,p-eIF-2α)、激活轉(zhuǎn)錄因子4 (activating transcription factor 4,ATF4)、Tubulin抗體購自美國CST公司。

1.2 細胞培養(yǎng)取HepG2和HuH7細胞加入含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37 ℃、含體積分數(shù)5%CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細胞生長至鋪滿細胞培養(yǎng)瓶底部面積的80%時利用胰蛋白酶消化后傳代，取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。

1.3 CCK-8檢測HepG2和HuH7細胞的存活率及增殖率取對數(shù)生長期HepG2和HuH7細胞，棄除原培養(yǎng)液后應用胰蛋白酶消化處理，細胞吹勻后進行細胞計數(shù)，將細胞接種于96孔板(細胞存活率檢測按照每孔1.2×104個細胞，細胞增殖率檢測按照每孔5.0×103個細胞)，鋪板混勻后培養(yǎng)過夜，第2天細胞完全貼壁后進行實驗。細胞存活率檢測實驗將細胞分為0、5、10、15、20、30 nmol·L-1硼替佐米組，檢測藥物干預24 h時細胞存活率；細胞增殖率檢測實驗將細胞分為0、5 nmol·L-1硼替佐米組，檢測藥物干預0.24、48、72、96 h時細胞增殖率；藥物作用完成后，在避光條件下每孔加入10 μL CCK-8試劑，加入液面以下，輕輕拍打培養(yǎng)板側(cè)壁，混勻CCK-8，置于37 ℃孵育箱中孵育30 min后取出96孔板，使用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測波長450 nm處各孔吸光度值，每組設(shè)6個重復孔，取均值。

1.4 Western blot檢測HepG2和HuH7細胞中凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3的表達取對數(shù)生長期HepG2和HuH7細胞，將細胞隨機分為0、10、15 nmol·L-1硼替佐米組；藥物作用完成后磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)清洗細胞2次，每組給予300 μL 放射免疫沉淀試驗細胞裂解液(含體積分數(shù)1% 苯甲基磺酰氟、150蛋白酶抑制劑和蛋白磷酸酶抑制劑)冰上裂解5 min。使用細胞刮刮下培養(yǎng)皿內(nèi)全部細胞，移至提前預冷的EP管中，冰上再次裂解20 min。將EP管放入離心機，12 000 r·min-1離心15 min，離心后吸取上清進行蛋白濃度測定(二喹啉甲酸法)。根據(jù)蛋白濃度計算上樣體積，蛋白中加入加樣緩沖液，95 ℃煮蛋白10 min使其變性后進行丙烯酰胺垂直電泳，電泳結(jié)束后將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束放入50 g·L-1脫脂奶粉中封閉1 h，加入一抗，室溫孵育30 min后4 ℃低溫孵育過夜，第2天應用含Tween-20的PBS洗膜3次，加入二抗，溫孵育1 h，應用含Tween-20的PBS洗膜3次，發(fā)光顯色，拍照，應用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.5 硼替佐米耐藥的HepG2細胞株構(gòu)建取生長狀態(tài)優(yōu)良的對數(shù)生長期HepG2細胞，加入2 mL PBS緩慢清洗2遍，加入1 mL胰蛋白酶進行消化，消化完全后加入4 mL DMEM培養(yǎng)液中和，混勻，移至離心管內(nèi)，2 000 r·min-1離心2 min，移除上清液，加入適當?shù)呐囵B(yǎng)液制成細胞懸液，首先加入濃度為5 nmol·L-1的硼替佐米，連續(xù)作用 48 h，移除含有硼替佐米的培養(yǎng)液，加入不含藥物的培養(yǎng)液培養(yǎng)，細胞長至鋪滿皿面積的90%時進行消化傳代，再次加入含有硼替佐米的培養(yǎng)液，藥物濃度先后使用 10、50、100、500、1 000 nmol·L-1與HepG2細胞共培養(yǎng)，HepG2從5 nmol·L-1逐漸增加到1 000 nmol·L-1，從而建立抗硼替佐米細胞，命名為HepG2/Bort。為了排除選擇性硼替佐米濃度的干擾，在實驗開始前，將耐硼替佐米細胞在無硼替佐米培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少72 h。細胞耐藥后，進入下一濃度篩選，最后使HepG2細胞能夠耐受1 000 nmol·L-1。采用CCK8實驗，通過抑制生長曲線計算細胞的半抑制濃度(50% inhibiting concentration,IC50)，并計算細胞耐藥指數(shù)(resistance index,RI)。RI=HepG2細胞IC50/HepG2/Bort細胞IC50。

1.6 CCK-8法和Western blot法檢測HepG2/Bort細胞存活率和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)蛋白的表達將HepG2/Bort細胞分為對照組、硼替佐米組(給予15 nmol·L-1硼替佐米干預)、硼替佐米+4-PBA組(給予15 nmol·L-1硼替佐米和8 mmol·L-14-PBA干預)、硼替佐米+TUDCA組(給予15 nmol·L-1硼替佐米和1 mmol·L-1TUDCA干預)，藥物作用24 h后，應用CCK-8法檢測HepG2/Bort細胞存活率，采用Western blot法檢測HepG2/Bort細胞中凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)蛋白GRP78、p-eIF-2α、ATF4的表達。

2 結(jié)果

2.1 硼替佐米對肝癌細胞存活率的影響結(jié)果見表1。硼替佐米干預24 h后，5、10、15、20、30 nmol·L-1硼替佐米組HepG2和HuH7細胞存活率均顯著低于0 nmol·L-1硼替佐米組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 硼替佐米對肝癌細胞存活率的影響

2.2 硼替佐米對肝癌細胞增殖率的影響結(jié)果見表2和表3。硼替佐米干預0、24 h時，5 nmol·L-1硼替佐米組與0 nmol·L-1硼替佐米組HepG2和HuH7細胞增殖率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；硼替佐米干預48、72、96 h時，5 nmol·L-1硼替佐米組HepG2和HuH7細胞增殖率顯著低于0 nmol·L-1硼替佐米組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 硼替佐米對HepG2細胞增殖率的影響

表3 硼替佐米對HuH7細胞增殖率的影響

2.3 硼替佐米對肝癌細胞凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3表達的影響結(jié)果見圖1、圖2和表4。10、15 nmol·L-1硼替佐米組HepG2和HuH7細胞中cleaved caspase-3表達顯著高于0 nmol·L-1硼替佐米組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表4 3組HepG2和HuH7細胞中cleaved caspase-3表達比較

2.4 HepG2細胞和HepG2/Bort耐藥細胞對Bortezomib的IC50HepG2/Bort細胞和HepG2細胞對硼替佐米的IC50分別為122.36、13.23 nmol·L-1，HepG2/Bort細胞對硼替佐米的RI為9.25。

2.5 硼替佐米對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)蛋白表達的影響結(jié)果見圖3和表5。HepG2/Bort細胞中GRP78、p-eIF-2α、ATF4蛋白表達顯著高于HepG2細胞，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖3 HepG2細胞和HepG2/Bort細胞中質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)蛋白表達(Western blot)

表5 HepG2細胞和HepG2/Bort細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)蛋白表達比較

2.6 抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激對HepG2/Bort細胞藥物敏感性的影響對照組、硼替佐米組、硼替佐米+4-PBA組、硼替佐米+TUDCA組HepG2/Bort細胞存活率分別為1.201±0.085、1.076±0.055、0.723±0.045、0.570±0.062；硼替佐米組HepG2/Bort細胞存活率顯著低于對照組，硼替佐米+4-PBA組和硼替佐米+TUDCA組HepG2/Bort細胞存活率顯著低于硼替佐米組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。對照組、硼替佐米組、硼替佐米+4-PBA組、硼替佐米+TUDCA組HepG2/Bort細胞內(nèi)cleaved caspase-3相對表達量分別為0.074±0.026、0.105±0.041、0.457±0.112、0.862±0.176；硼替佐米組HepG2/Bort細胞內(nèi)cleaved caspase-3相對表達量顯著高于對照組，硼替佐米+4-PBA組和硼替佐米+TUDCA組HepG2/Bort細胞內(nèi)cleaved caspase-3相對表達量顯著高于硼替佐米組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；見圖4。

1：對照組；2：硼替佐米組；3：硼替佐米+4-PBA組；4：硼替佐米+TUDCA組。

3 討論

肝癌是世界范圍內(nèi)常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，在我國，肝癌發(fā)病率在所有惡性腫瘤中居第4位；目前，肝癌的治療方法仍然以手術(shù)治療、放射治療和化學治療為主，患者5 a生存率低于12%[9]。研究顯示，HCC由于先天性或后天性耐藥的出現(xiàn)，常用的化學治療藥物對患者生存率的改善效果不明顯[10]。因此，尋找新的治療靶點和聯(lián)合用藥策略，提高抗腫瘤藥物的敏感性成為克服耐藥和改善患者生存率的關(guān)鍵。

硼替佐米是一種蛋白酶體抑制劑，2003年獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局批準，是目前唯一被批準應用于臨床的蛋白酶體抑制劑，主要用于治療難治性多發(fā)性骨髓瘤和套細胞淋巴瘤[11]。蛋白酶體活性抑制被認為是硼替佐米的典型功能，是治療難治性多發(fā)性骨髓瘤的主要作用機制[12]。硼替佐米干擾26S蛋白酶體，通過增強凋亡相關(guān)蛋白caspase的表達促進細胞凋亡的發(fā)生[13]。目前，硼替佐米對肝癌細胞的影響尚不完全明確。本研究結(jié)果顯示，硼替佐米可以顯著降低肝癌HepG2和HuH7細胞的存活率和增殖率，誘導肝癌細胞凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3表達升高，提高細胞內(nèi)caspase-3酶活性；提示硼替佐米可以抑制肝癌細胞的生長、增殖，并促進肝癌細胞凋亡。為明確肝癌細胞對硼替佐米耐藥的可能機制，本研究建立了對硼替佐米耐藥的HepG2細胞株，即HepG2/Bort細胞，結(jié)果顯示，HepG2/Bort和HepG2細胞的IC50分別為122.36、13.23 nmol·L-1，HepG2/Bort細胞對硼替佐米的RI為9.25。有研究顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可能參與腫瘤細胞的耐藥機制[14]。細胞在生長過程中面臨各種應激的發(fā)生，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激是其中常見的一種類型。細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激時通過誘導未折疊蛋白反應來平衡應激作用。當未折疊蛋白反應達到臨界閾值時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)伴侶分子GRP78與傳感器分離，被激活的蛋白激酶RNA樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶通過磷酸化真核翻譯起始因子2α亞基的 Ser51降低其翻譯。p-eIF-2α會暫時抑制整體蛋白的翻譯，以最大程度地降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)折疊負荷，同時p-eIF-2α會在其包含較短的上游開放閱讀框的5′非翻譯區(qū)中選定 mRNA優(yōu)先翻譯。ATF4是翻譯上調(diào)的蛋白之一，ATF4激活旨在緩解內(nèi)質(zhì)激素應激的基因表達。ATF4 有助于細胞穩(wěn)態(tài)的多個方面，包括氨基酸生物合成和抗氧化劑程序[15]。本研究結(jié)果顯示，HepG2/Bort細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)蛋白GRP78、p-eIF-2α、ATF4的表達顯著高于HepG2細胞，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)抑制劑4-PBA和TUDCA可以顯著降低HepG2/Bort細胞存活率，并誘導細胞凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3表達增加；提示抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可以提高HepG2/Bort細胞對硼替佐米的敏感性。

綜上所述，硼替佐米可以抑制肝癌細胞增殖，并誘導其凋亡；對硼替佐米耐受的HepG2細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激水平明顯升高，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可以明顯提高對硼替佐米耐受的HepG2細胞的藥物敏感性。本研究為臨床克服肝癌耐藥性提供了新的方向，也為臨床聯(lián)合用藥提供了理論依據(jù)。