焦 揚(yáng),吳 帆，2

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽(yáng) 550025；2.廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院肝膽外科， 廣東 廣州 510220)

肝癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位居我國(guó)各類癌癥發(fā)病率的第4位，病死率居第2位[1]，對(duì)我國(guó)人民的生命健康造成了嚴(yán)重的威脅。因此，使用更快捷、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法篩選出有效的肝癌診斷標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)以指導(dǎo)肝癌的精準(zhǔn)治療是目前一項(xiàng)迫切的任務(wù)。DNA測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)為肝癌的診治帶來(lái)了新的途徑，尤其是第2代DNA測(cè)序技術(shù)因其通量大、靈敏度高、檢測(cè)速度快、成本低等優(yōu)點(diǎn)，成為了近年來(lái)極具吸引力的測(cè)序技術(shù)之一，已經(jīng)在肝癌研究中得以應(yīng)用并取得了巨大的進(jìn)步。本文綜述了第2代DNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展及其在肝癌的基因突變、信號(hào)傳導(dǎo)通路等方面的應(yīng)用。

1 第1代DNA測(cè)序技術(shù)

DNA測(cè)序技術(shù)是指分析特定DNA片段的堿基序列(即腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的排列方式)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。DNA測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)極大地推動(dòng)了生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的研究與發(fā)展，使得人類對(duì)基因的研究逐漸深入[2]。第1代DNA測(cè)序技術(shù)是SANGER等[3]于19世紀(jì)70年代在基因研究中發(fā)現(xiàn)的創(chuàng)新性技術(shù)，也被稱為“桑格測(cè)序技術(shù)”，該技術(shù)的原理是核苷酸在某一固定的堿基處開(kāi)始，隨機(jī)在某一個(gè)特定的堿基處終止，并且在每個(gè)堿基后面進(jìn)行熒光標(biāo)記，產(chǎn)生以腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤結(jié)束的4組不同長(zhǎng)度的核苷酸，然后在尿素變性的丙烯酰胺凝膠上電泳，從而獲得可見(jiàn)的DNA堿基序列。應(yīng)用桑格測(cè)序技術(shù)，人們首次完成了人類基因組的測(cè)序，但由于該技術(shù)是通過(guò)短鏈DNA片段的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)的測(cè)序，因而成本高、工作量大，且只能對(duì)特定的樣本(如DNA片段)進(jìn)行測(cè)序，這也決定了該技術(shù)無(wú)法直接應(yīng)用于癌癥患者的臨床診斷和治療。

2 第2代DNA測(cè)序技術(shù)

自桑格測(cè)序技術(shù)創(chuàng)建以來(lái)，盡管其仍然存在成本高且耗時(shí)長(zhǎng)的固有缺點(diǎn)，但一直被作為分子生物學(xué)研究的金標(biāo)準(zhǔn)[4]。但隨著人們對(duì)基因研究的不斷深入以及科學(xué)技術(shù)的不斷革新，逐漸出現(xiàn)了第2代DNA測(cè)序技術(shù)。

2.1 第2代DNA測(cè)序技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)近10 a來(lái)，第2代DNA測(cè)序技術(shù)逐漸成形，具有高通量、高靈敏度、低成本、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)[5]，其逐漸取代桑格測(cè)序技術(shù)成為目前基因研究中最常使用的方法之一。第1代DNA測(cè)序技術(shù)需要耗費(fèi)數(shù)十億美元和數(shù)年時(shí)間才能完成人類基因組測(cè)序，第2代DNA測(cè)序技術(shù)則僅需耗費(fèi)幾千美元并在短短幾天內(nèi)就能完成1個(gè)人的基因組測(cè)序，這為癌癥患者的及時(shí)診治帶來(lái)了曙光[6]。第2代DNA測(cè)序技術(shù)的成功在于其不需要提前了解序列，就可以同時(shí)對(duì)數(shù)百萬(wàn)的基因片段進(jìn)行大規(guī)模的測(cè)序，因此,使其耗費(fèi)的成本和時(shí)間都顯著降低[7-8]。

在基礎(chǔ)研究方面，第2代DNA測(cè)序技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于全基因組測(cè)序、全外顯子組測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、靶向區(qū)域測(cè)序、表觀遺傳測(cè)序等，使得基因相關(guān)的基礎(chǔ)研究得到了快速的發(fā)展，研究數(shù)據(jù)的分析也更加精確、可靠[9-11]。在臨床治療方面，第2代DNA測(cè)序技術(shù)可以用于各種疾病尤其是癌癥的分子診斷及預(yù)后評(píng)估，有助于癌癥的個(gè)性化治療和精準(zhǔn)醫(yī)療。第2代DNA測(cè)序技術(shù)已經(jīng)可以識(shí)別多種癌癥的突變基因，包括肝癌、膀胱癌、乳腺癌、甲狀腺癌、腎細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、急性粒細(xì)胞白血病和慢性淋巴細(xì)胞白血病等，使精確、高效地識(shí)別癌癥的罕見(jiàn)特異性基因突變成為可能。正是第2代DNA測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用和普及，才使癌癥基因組圖譜和國(guó)際癌癥基因組聯(lián)盟等大型研究項(xiàng)目得以進(jìn)一步完善，從而為研究癌癥的類型及分類提供更加準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)支持。

2.2 第2代DNA測(cè)序技術(shù)的方法目前，已經(jīng)有多家公司研發(fā)了各具特點(diǎn)的第2代DNA測(cè)序技術(shù)。Roche公司推出的測(cè)序技術(shù)是以焦磷酸測(cè)序法為基礎(chǔ)，依靠生物發(fā)光法對(duì)DNA序列進(jìn)行檢測(cè)，在進(jìn)行未知基因組測(cè)序方面具有較大優(yōu)勢(shì)，但在處理堿基序列時(shí)會(huì)因熒光信號(hào)的判斷錯(cuò)誤導(dǎo)致核苷酸插入或缺失[12]。Illumina-Solexa公司利用其專利核心技術(shù)“DNA簇”和“可逆性末端終結(jié)”，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化樣本制備及基因組中數(shù)百萬(wàn)個(gè)堿基的大規(guī)模平行測(cè)序[13]。Ion Torrent公司推出了第1個(gè)不需要光學(xué)系統(tǒng)的測(cè)序儀，其所采用的技術(shù)為半導(dǎo)體測(cè)序，將化學(xué)信號(hào)通過(guò)半導(dǎo)體芯片直接轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)，是適合擴(kuò)增子測(cè)序的革命性技術(shù)[14]。SOLID公司使用連接法測(cè)序技術(shù)獲得基于“雙堿基編碼原理”的顏色編碼序列，對(duì)原始顏色序列進(jìn)行數(shù)據(jù)分析后轉(zhuǎn)換成顏色編碼的標(biāo)準(zhǔn)序列，把顏色序列定位到標(biāo)準(zhǔn)序列上，同時(shí)校正測(cè)序錯(cuò)誤，結(jié)合原始顏色序列的質(zhì)量信息發(fā)現(xiàn)潛在單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)[15]。QIGEN公司推出的Gene Reader系統(tǒng)包含了從最初的數(shù)據(jù)收集到最終的數(shù)據(jù)分析，建立了一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的第2代DNA測(cè)序技術(shù)工作流程，可以靶向DNA檢測(cè)并得到明確的臨床結(jié)果[16]。

第2代DNA測(cè)序技術(shù)除了上述幾種測(cè)序技術(shù)外，還有美國(guó)太平洋生物科學(xué)公司、英國(guó)牛津納米孔技術(shù)有限公司、Bionano Genomics公司等的測(cè)序技術(shù)[17-19]，這些測(cè)序技術(shù)在不同的方面展現(xiàn)出了各自的優(yōu)勢(shì)，是測(cè)序技術(shù)的一次重要改革，增加了測(cè)序的通量，縮短了時(shí)間，降低了成本。第2代DNA測(cè)序技術(shù)比桑格測(cè)序技術(shù)的涵蓋面更加寬廣，同時(shí)可以實(shí)現(xiàn)臨床實(shí)驗(yàn)室要求的特異性、敏感性、重現(xiàn)性和分析準(zhǔn)確性。

2.3 第2代DNA測(cè)序技術(shù)的基本步驟無(wú)論使用何種平臺(tái)進(jìn)行第2代DNA測(cè)序技術(shù)測(cè)序，都需要以下步驟[20]：(1)臨床病理診斷、提取樣本DNA/RNA；(2)選擇第2代DNA測(cè)序技術(shù)測(cè)序類型，包括全基因組測(cè)序、全外顯子組測(cè)序、靶向測(cè)序等；(3)基因文庫(kù)生成，指選擇DNA片段并通過(guò)適配器放大和濃縮樣品；(4)依賴平臺(tái)生成模版；(5)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、序列質(zhì)量評(píng)價(jià)、比對(duì)參考序列、變異調(diào)用、變異注釋、致病變異的識(shí)別、解釋和分類。

3 第2代DNA測(cè)序技術(shù)在肝癌研究中的應(yīng)用

3.1 第2代DNA測(cè)序技術(shù)在肝癌基因突變研究中的應(yīng)用第2代DNA測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)及應(yīng)用，使對(duì)肝癌基因突變的研究取得了巨大的突破。使用第二代DNA測(cè)序技術(shù)檢測(cè)肝癌基因突變是通過(guò)分別提取正常肝臟組織、肝癌癌旁組織、肝癌原發(fā)灶組織、肝癌轉(zhuǎn)移灶組織及肝癌異體移植組織等的DNA進(jìn)行基因組測(cè)序，使用Newbler、AMOScmp、Phred/Phrap/Consed/Polyphred和Velvet等軟件進(jìn)行基因組組裝后與基因組平均讀取覆蓋度進(jìn)行比較，過(guò)濾掉低質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)，將高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組或數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，篩選出單堿基變異、插入缺失、拷貝數(shù)變異、結(jié)構(gòu)變異等，然后可利用Glimmer、GeneMarkS、Prodiga等蛋白質(zhì)編碼基因預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，再利用特定的軟件或數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因組注釋得到基因組序列，分析預(yù)測(cè)其對(duì)蛋白質(zhì)功能的影響。

KAN等[21]通過(guò)第2代DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)88例肝癌患者進(jìn)行基因組測(cè)序分析，不僅驗(yàn)證了眾多已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的基因突變位點(diǎn)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了BRCA2基因和IGF1R基因新突變位點(diǎn)，從而為肝癌發(fā)生機(jī)制的研究提供了新的思路。此外，LU等[22]通過(guò)第2代DNA測(cè)序技術(shù)研究p53基因突變?cè)谌烁伟┘?xì)胞中的作用，也發(fā)現(xiàn)了一些既往認(rèn)為與肝癌無(wú)關(guān)的癌基因的突變，包括RUNX1基因和 JAK3 基因，這對(duì)于肝癌基因圖譜的完善有很大的幫助。OBA等[23]利用第2代DNA測(cè)序技術(shù)開(kāi)展的研究也表明，ARID2基因的缺失減弱了DNA損傷部位的核苷酸切除修復(fù)，提示ARID2基因可能參與DNA的修復(fù)。ARID2基因在肝炎相關(guān)肝癌組織中表達(dá)下調(diào)，其也被認(rèn)為是肝炎相關(guān)肝癌細(xì)胞中基因突變的抑制因子，因而有望利用ARID2基因誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，從而對(duì)肝炎相關(guān)肝癌患者的治療帶來(lái)新的突破[23]。YIN等[24]通過(guò)第2代DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)肝癌患者的體細(xì)胞線粒體DNA突變進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)肝癌組織中D-環(huán)區(qū)突變的異質(zhì)性水平顯著升高，提示肝癌組織中D-環(huán)區(qū)突變可能是陽(yáng)性選擇；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)D-環(huán)區(qū)突變患者的線粒體DNA拷貝數(shù)明顯較低，癌癥復(fù)發(fā)的可能性更大；體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，D-環(huán)區(qū)突變的肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力明顯高于無(wú)D-環(huán)區(qū)突變的肝癌細(xì)胞。

3.2 第2代DNA測(cè)序技術(shù)在肝癌信號(hào)傳導(dǎo)通路研究中的應(yīng)用通過(guò)第2代DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)基因序列進(jìn)行高通量篩選，并結(jié)合相應(yīng)的細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)，不僅可以驗(yàn)證和發(fā)現(xiàn)基因突變位點(diǎn)，而且還可以為基因的信號(hào)傳導(dǎo)通路研究提供方向。近年來(lái)已發(fā)現(xiàn)TERT啟動(dòng)子、CTNNB1、AXIN1、LAMA2、ARID1A、WWP1等眾多基因在肝癌發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中具有顯著的調(diào)控作用[25-30]。此外，第2代DNA測(cè)序技術(shù)同樣可以應(yīng)用于非編碼RNA的信號(hào)通路研究中。ZHUANG等[31]報(bào)道了一種新的長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)-DRHC，lncRNA-DRHC 在肝癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，且其低表達(dá)與肝癌患者的不良預(yù)后相關(guān)，在體外實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)其可以抑制肝癌細(xì)胞系的增殖、遷移、侵襲和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化；基于第2代DNA測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn) lncRNA-DRHC與MYBBP1A基因存在相互作用，并且lncRNA-DRHC可通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子c-Myb調(diào)節(jié)有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路中的MEK/ERK信號(hào)通路，表明lncRNA-DRHC在肝癌的進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用，其有望成為一個(gè)新的肝癌治療靶點(diǎn)。ZHANG等[32]采用第2代DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)肝癌患者腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞和癌旁成纖維細(xì)胞的外顯子進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)，肝癌患者腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞提取液中外泌體內(nèi)的微RNA (microRNA,miR)-320a水平顯著降低，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-320a可以通過(guò)與其下游靶點(diǎn)PBX3基因結(jié)合來(lái)抑制MAPK通路的激活，從而抑制腫瘤的進(jìn)展，發(fā)揮抗腫瘤作用，因此，miR-320a可能是抑制肝癌進(jìn)展的潛在治療靶點(diǎn)。CHAVALIT等[33]采用第二代DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)聚乙二醇-干擾素α-2a治療后的慢性肝炎患者血清中的乙肝病毒編碼的miR-3(hepatitis B virus encoded microRNA-3，HBV-miR-3)進(jìn)行分析，證實(shí)HBV-miR-3可通過(guò)抑制鎂離子依賴的蛋白磷酸酶1A的表達(dá)促進(jìn)肝癌相關(guān)細(xì)胞的增殖，這是首次在肝癌的研究中發(fā)現(xiàn)乙肝病毒編碼的miRNA可以調(diào)節(jié)宿主基因的表達(dá)。

3.3 第2代DNA測(cè)序技術(shù)在肝癌其他方面研究中的應(yīng)用第2代DNA測(cè)序技術(shù)還可以用于篩選肝癌診斷和預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物。徐紅梅等[34]利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)獲取4例肝癌患者和3例健康對(duì)照者外周血單個(gè)核細(xì)胞中環(huán)狀RNA的差異表達(dá)譜，采用GO/KEGG富集分析差異表達(dá)顯著的環(huán)狀RNA及其潛在功能和信號(hào)通路，并對(duì)其中6種顯著差異的環(huán)狀RNA通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR在72例肝癌患者和30例健康對(duì)照者外周血單核細(xì)胞樣本中再次進(jìn)行驗(yàn)證，最后結(jié)合受試者工作特征曲線發(fā)現(xiàn)circ0000798最有潛力成為肝癌無(wú)創(chuàng)性診斷分子標(biāo)志物。CHEN等[35]通過(guò)使用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，HK2基因和ENO1基因在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于正常組織，并且HK2基因和ENO1基因在p53突變型肝癌組織中的表達(dá)也明顯高于p53野生型肝癌組織，提示HK2基因和ENO1基因與突變型p53肝癌的發(fā)生有關(guān)；同時(shí)根據(jù)HK2基因和ENO1基因在熱圖中是紅色像素，采用Kaplan-meier方法對(duì)這2種基因進(jìn)行總體生存曲線分析，顯示其在預(yù)后較差的肝癌患者中呈高表達(dá)，提示HK2基因和ENO1基因是潛在的肝癌預(yù)后標(biāo)志物，同時(shí)驗(yàn)證了利用世界范圍內(nèi)豐富的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)數(shù)據(jù)來(lái)識(shí)別肝癌新的潛在標(biāo)志物具有很好的效果。此外，第2代DNA測(cè)序技術(shù)也有助于肝癌治療藥物的研發(fā)。王惠國(guó)等[36]通過(guò)對(duì)HepG2和Huh7肝癌細(xì)胞給予不同濃度的青蒿素，培養(yǎng)不同時(shí)間，再利用第2代DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)2種肝癌細(xì)胞系中的miRNA進(jìn)行測(cè)序分析，并結(jié)合細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)證實(shí)，青蒿素可抑制HepG2和Huh7肝癌細(xì)胞系的增殖，且青蒿素的這種效應(yīng)具有劑量依賴性和時(shí)間依賴性。此外，王惠國(guó)等[35]還通過(guò)靶基因富集分析第2代DNA測(cè)序技術(shù)得到的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，青蒿素是通過(guò)調(diào)控Rap1和MAPK信號(hào)通路抑制HepG2和Huh7肝癌細(xì)胞系的增殖，這為青蒿素在肝癌治療中的應(yīng)用提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

4 總結(jié)與展望

第2代DNA測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用對(duì)于肝癌研究發(fā)揮了顯著的促進(jìn)作用，為肝癌精準(zhǔn)醫(yī)療、個(gè)性化治療等醫(yī)療理念的實(shí)現(xiàn)提供了有力的支撐，并可為尋找新的肝癌治療靶點(diǎn)和診斷標(biāo)志物提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。近幾年來(lái)，成本更低、測(cè)序速度更快、PCR偏倚更小的第3、4代測(cè)序技術(shù)正在逐漸出現(xiàn)，但第3、4代測(cè)序技術(shù)目前仍處于發(fā)展測(cè)試階段，技術(shù)還不夠成熟，尚不能為肝癌研究帶來(lái)質(zhì)的改變，相信隨著技術(shù)的改進(jìn)和完善其在未來(lái)也將成為肝癌研究的重要方法。