韓 雪 韓紅梅 李 捷（通信作者） 天津市第五中心醫(yī)院輸血科（天津，300450）

Rh 血型系統(tǒng)是人類紅細胞血型系統(tǒng)中最具有高度多態(tài)性的一個，抗原復(fù)雜多變，最常見的有D、E、C、c、e 5 種抗原，D 抗原是Rh 血型抗原中免疫原性最強的， 由RHD 基因編碼，10 個外顯子組成，編碼區(qū)總長為1 251 bp， 編碼417 個氨基酸組成的糖蛋白， 且存在多種變異體， 包括部分D 型（partial D）、弱D（weak D）型、DEL 等，是臨床上引起新生兒溶血病、溶血性輸血反應(yīng)的最主要的血型抗原，對D抗原陰性的孕婦的妊娠具有重要的臨床意義。 關(guān)于Rh 陰性個體的血清學表型、RHD 基因型檢測分析一直是國內(nèi)外研究的熱點，不同地區(qū)、民族皆對其有相關(guān)報道。本研究旨在對RhD 初篩陰性的孕產(chǎn)婦RHD 基因分型進行研究。

1 材料與方法

1.1 研究對象

2016 年1 月～2019 年6 月共收集本院產(chǎn)科就診的圍產(chǎn)期婦女標本10 139 例， 其中RhD 抗原血清學初篩試驗陰性標本104 例，每例留取EDTA 抗凝血標本約5 ml。

1.2 試劑與儀器

ABO、RhD 血型定型檢測卡 （單克隆抗體）（生產(chǎn)批號20151204、20161204、20171204、20181204，長春博訊生物技術(shù)有限公司）。 RhD 血型抗原檢測卡 （單克隆抗體）（生產(chǎn)批號20160601、20170601、20180601，長春博訊生物技術(shù)有限公司）；TD-3A 型血型血清學離心機（長春博訊科研儀器有限責任公司）移液器（Eppendrof 公司）。 核酸提取或純化試劑盒（天津秀鵬，生產(chǎn)批號201808001）；人類紅細胞RHD 基因分型試劑盒（PCR-SSP 法）（天津秀鵬，生產(chǎn)批號201810002）；瓊脂糖（Biowest）EB 染料（天津秀鵬，生產(chǎn)批號201703001）；JY300C 電泳儀（北京君意東方電泳有限公司）；PCR 擴增儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)（ABI）公司9700 型）；GenoSens1860 凝膠成像系統(tǒng)（上海勤翔科學儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 Rh 抗原檢測

采用RhD 血型抗原試劑卡檢測D、C、c、E、e 5種抗原，操作步驟按照試劑卡說明書進行。

1.3.2 基因組DNA 的提取

嚴格按照天津秀鵬生物技術(shù)開發(fā)有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑盒說明書操作， 提取104 例經(jīng)抗人球蛋白法確定為RhD 陰性的樣本的基因組DNA 備用。 DNA 產(chǎn)物應(yīng)該保存在-20 ℃，以防降解。

1.3.3 PCR 檢測

將80μl dNTP-Buffer 工作液、0.8 μl Taq 酶和10 μl DNA 總共90.8 μl 混合液漩渦混勻并瞬時離心；向每個引物孔（1～8 孔）各加入10 μl 上述混合液。 PCR 循環(huán)參數(shù)為96 ℃2 min，1 個循環(huán)；96 ℃20 s，68 ℃60 s，5 個循環(huán)；96 ℃20 s，65 ℃50 s，72 ℃45 s，10 個循環(huán)；96 ℃20 s，62 ℃50 s，72 ℃45 s，18 個循環(huán)；72 ℃5 min，1 個循環(huán)。 將PCR 產(chǎn)物移至2.5%瓊脂糖凝膠電泳孔中， 電泳參數(shù)設(shè)置為140-150 V，電泳15-20 min，電泳后紫外光下成像儀拍照記錄并對照說明書判讀結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 Rh 血型系統(tǒng)抗原檢測

104 份陰性標本均未發(fā)現(xiàn)CCEe、CcEE 及CCEE 表型，見表1。

表1 RhD 初篩陰性孕產(chǎn)婦標本Rh 血型系統(tǒng)分型結(jié)果

2.2 104 例RhD 陰性圍產(chǎn)期婦女標本RHD 基因分型

RHD 基因全缺失型70 例， 占全部陰性標本的67.3%；DEL RHD 1227A 純合型標本13 例，占全部陰性標本的12.5%；RHD-CE （2-9）-D 標本10 例，占全部陰性標本的9.6%；弱D15 型標本5 例，占全部陰性標本的4.8%；DEL RHD 1227A 雜合型標本2 例，占全部陰性標本的1.9%；RhD 陽性標本2 例，占全部標本的1.9%，判讀為D 變異體；另外有2 例不能用此PCR-SSP 試劑盒確定其基因型，占全部標本的1.9%。圖1-6 為RHD 基因分型PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳的條帶格局表2 顯示不規(guī)則抗體篩查檢出3 例陽性，其抗體為抗-D，基因分型均為全缺失型。

表2 104 例RhD 初篩陰性圍產(chǎn)期婦女標本RHD 基因分型結(jié)果

圖1 RHD 基因全缺失型

圖2 DEL RHD1227A 純合型

圖3 RHD-CE（2-9）-D 型

圖4 弱D15 型

圖5 DEL RHD1227A 雜合型

圖6 RhD 陽性

2.3 104 例不同D 表現(xiàn)型在RhCE 表型中的分布見表3。

表3 104 例不同D 表現(xiàn)型在RhCE 表型中的分布[n（%）]

3 討論

Rh 血型系統(tǒng)最具復(fù)雜多態(tài)性，在臨床輸血體系中占有重要地位，僅次于ABO 血型系統(tǒng)。 本次實驗104 例RhD 陰性標本的血型抗原分型中以ccee（54.8%）和Ccee（27.9%）頻率最高，而基因分型中以RHD 全缺失型為大多數(shù)， 占全部標本的67.3%，其Rh 表型主要是ccee（78.6%），說明RHD 全缺失型與ccee 表型具有高度關(guān)聯(lián)。 Del 型主要是Ccee（69.2%），RHD-CE（2-9）-D 型主要是Ccee（60%）。

D 抗原因具有多種變異體而具有復(fù)雜多樣性，不同民族和遺傳背景均有不同。有研究表明是RHD基因之間產(chǎn)生的氨基酸重排和基因突變影響了抗原的表達［1］，目前發(fā)現(xiàn)亞洲人群中存在部分D（partial D）、弱D（weak D）、Del 等變異體。 部分D 主要有RHD-CE（2-9）-D、DVIⅢ型、RHD-CE（2-7）-D2等類型， 是由于RHD 基因與RHCE 基因在方向上相反，有很大的幾率產(chǎn)生替換，表現(xiàn)為缺失1 個或多個抗原表位，且易被致敏產(chǎn)生對應(yīng)缺失的抗原表位的抗體。 RHD-CE（2-9）-D 型是中國人群中主要的等位基因，其分子機制是缺少2～9 外顯子，本研究中共發(fā)現(xiàn)10 例， 分別在表型Ccee、ccEe 中檢出，與先前國內(nèi)學者檢測RHD-CE （2-9）-D 等位基因存在于CDe 單體型中的結(jié)果不一致，表明RHD-CE（2-9）-D 等位基因與RhC/E 抗原之間沒有明確聯(lián)系。

Becker 等［2］采用Southern 分析技術(shù)及PCR 基因定型分析了弱D 中RHD 基因表達情況， 發(fā)現(xiàn)弱D 在基因水平及轉(zhuǎn)錄水平和正常D 相比沒有任何差異，所以認為其在基因數(shù)量上引起變異，而非堿基對的結(jié)構(gòu)變異， 導(dǎo)致紅細胞膜上的抗原數(shù)量減少，而抗原表位不變。 另一些研究認為，弱D 是由于發(fā)生了氨基酸替換和外顯子突變［3］。 如果弱D 型供血者的紅細胞輸注給了Rh 陰性患者， 可刺激機體產(chǎn)生同種免疫， 產(chǎn)生IgG 抗體而引起嚴重的溶血性輸血反應(yīng)。 其中弱D 最常見有弱D15 型和弱D12型，而弱D15 型在中國人群中被廣泛發(fā)現(xiàn)，同樣可激發(fā)同種免疫反應(yīng)，所以應(yīng)該重視對弱D15 型的檢測。 本次實驗共檢測出5 例弱D15 型，血清分型分別是Ccee（60%）和CcEe（40%）。

Del 型極弱表達D 抗原， 只有通過吸收放散的方法才能檢測到， 輸注給Rh 陰性患者仍會產(chǎn)生免疫應(yīng)答，并且各地Del 表型的分子機理各有其特點，中國漢族人群的研究資料表明，Del 型主要由RHD1227A 等位基因編碼組成［4-5］。 亞洲Rh 陰性個體中，Del 表型占有較高比例， 高加索人RhD 初篩陰性個體中Del 型占0.33%［6］， 國內(nèi)報道為15.6%-29.95%［7-9］。本研究檢出Del RHD1227A 型15 例，占14.4%，說明Del 型的分布存在一定的地區(qū)差異。 其血清表型分別為Ccee、CCee 及CcEe， 推測1227A可能與C 抗原相關(guān)， 但由于本次研究標本量較少，這一觀點還需要大量標本進一步研究證實。 雖然DEL 型具有完整的RHD 基因， 但極弱的表達D 抗原，因此臨床上將把它歸為RhD 陰性。 有研究發(fā)現(xiàn)DEL 型與正常D 抗原相比，具有很少的抗原分子數(shù)量， 每個紅細胞上的D 抗原分子數(shù)量可能在30 個以下［10］，1227A 因其位于第9 外顯子最后一位，影響了mRNA 的正常連接，形成了短的mRNA，從而降低了RHD 基因的表達效率， 也就造成了紅細胞膜上的D 抗原分子數(shù)量明顯減少。 邵超鵬等［11］研究說明，編碼RhD 1227A 等位基因的中國漢族Del 個體100%攜帶RHD 基因。 如果Del 型個體表達完整的D 抗原，Del 個體將可能不會被D 抗原免疫產(chǎn)生免疫應(yīng)答， 本文中104 例標本中有3 例產(chǎn)生了抗-D，其基因型均為全缺失型，可以印證上述觀點，也就是說Del 患者可以輸注RhD 陽性紅細胞而不產(chǎn)生抗-D 抗體，Del 型女性妊娠RhD 陽性胎兒將可能不會引起新生兒溶血病。 即對于這部分孕婦，在整個孕期及產(chǎn)后不需要注射RhD 免疫球蛋白，可免去產(chǎn)婦對注射免疫球蛋白產(chǎn)生的風險和經(jīng)濟負擔，以及對是否產(chǎn)生抗-D 影響胎兒的心理壓力。 目前，國際上均不對Del 型進行檢測，將其作為RhD 陰性血型對待，供給RhD 陰性患者使用，而由于輸注Del 血液產(chǎn)生抗-D 的病例并不罕見，這無疑存在很多弊端和風險， 國外已有學者發(fā)現(xiàn)RhD 陰性孕產(chǎn)婦被Del 型胎兒或紅細胞免疫和RhD 陰性受血者輸注Del 型血液而產(chǎn)生抗-D 抗體的病例［12-14］，由此可見，結(jié)合血清學檢查和RHD 基因分型對RhD 陰性產(chǎn)婦和臨床輸血均具有重要的意義， 檢測圍產(chǎn)期孕婦的RHD基因型并篩查其血清抗體，可對RhD 陰性孕產(chǎn)婦二次妊娠及新生兒溶血病的及時預(yù)防提供重要依據(jù)。

通過本次研究， 基本確定了Rh 陰性個體的基因分型情況， 但仍有部分個體的基因型通過此PCR-SSP 法無法確定，需對其外顯子測序才能明確其基因型。 也證實了RhD 陰性個體的D 基因多態(tài)性，研究RHD 基因的變異，對人類輸血安全和新生兒溶血病的防治具有重要意義。