王菊紅 平頂山市傳染病醫(yī)院，檢驗(yàn)科（河南，平頂山，467000）

穆麗平 平頂山市傳染病醫(yī)院，結(jié)核科（河南，平頂山，467000）

結(jié)核屬于傳染性較強(qiáng)的疾病，會(huì)嚴(yán)重威脅患者的機(jī)體健康，甚至是生命安全，臨床上在對(duì)肺結(jié)核患者開(kāi)展治療時(shí)，需應(yīng)用規(guī)范藥物進(jìn)行治療，或?qū)颊邔?shí)施消毒隔離，由此使病菌傳播得到有效控制，從而使康復(fù)率得以有效提高， 并且還需使患者的休息時(shí)間得到保證，指導(dǎo)其開(kāi)展適量運(yùn)動(dòng)，從而使治療順利開(kāi)展［1］。結(jié)核病的致病菌為結(jié)核分枝桿菌（TB），在對(duì)結(jié)核病進(jìn)行診斷時(shí)，所參考的重要診斷依據(jù)為標(biāo)本中檢測(cè)出結(jié)核分歧桿菌病原體［2］。 臨床上在對(duì)可疑結(jié)核標(biāo)本開(kāi)展檢測(cè)時(shí)， 常用的方法為涂片、抗酸染色、金胺O 熒光染色法、熒光定量PCR 等，上述方法的操作較為簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度快，同時(shí)檢測(cè)費(fèi)用低［3］。 目前研究報(bào)道顯示，熒光定量PCR 是診斷結(jié)核病的有效方法之一， 但其研究大多為定性評(píng)估，而未重視定量評(píng)估［4］。本次研究選取可疑結(jié)核病患者1 012 例，探討熒光定量PCR 檢測(cè)TB-DNA 的拷貝數(shù)與涂片抗酸染色鏡檢陽(yáng)性程度的相關(guān)性。 報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020 年1 月至12 月我院收治的可疑結(jié)核病患者1 012 例，取TB-DNA 標(biāo)本1 012 份，包括男778 例，女234 例，年齡16～88 歲，平均（52.36±5.41）歲。

1.2 研究方法

抗酸染色應(yīng)用貝索熱染法染色液，根據(jù)《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》 以及試劑說(shuō)明書(shū)開(kāi)展檢測(cè)。 鏡檢結(jié)果評(píng)價(jià)：在300 個(gè)不同的視野內(nèi)無(wú)抗酸桿菌，則為陰性；在300 個(gè)視野內(nèi)發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌數(shù)量為1～8 條，則為可疑結(jié)果；在100 個(gè)視野內(nèi)發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌數(shù)量為3～9 條， 則為抗酸桿菌陽(yáng)性1+；在10 個(gè)視野內(nèi)發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌數(shù)量為1～9 條，則為抗酸桿菌陽(yáng)性2+； 在每個(gè)視野內(nèi)發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌數(shù)量為1～9 條，則為抗酸桿菌陽(yáng)性3+；在每個(gè)視野內(nèi)發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌數(shù)量超過(guò)10 條，則為抗酸桿菌陽(yáng)性4+。熒光定量PCR 法檢測(cè)方法： 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)開(kāi)展檢測(cè)，操作步驟包括樣本液化、DNA 提取、擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備、加樣以及PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)條件為37 ℃下反應(yīng)3 min，然后在93 ℃下反應(yīng)1 min，在93 ℃下5 s，在60 ℃溫度下40 s，40 個(gè)循環(huán)。

1.3 觀察指標(biāo)

（1）涂片染色鏡檢結(jié)果；（2）熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果和涂片結(jié)果間的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 涂片染色鏡檢結(jié)果分析

1 012 份標(biāo)本中包括陽(yáng)性標(biāo)本241 份， 陰性標(biāo)本771 份，其中陽(yáng)性標(biāo)本中包括18 份可疑陽(yáng)性，56份1+陽(yáng)性，63 份2+陽(yáng)性，84 份3+陽(yáng)性， 以及20 份4+陽(yáng)性。

2.2 熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果和涂片結(jié)果的相關(guān)性

771 份陰性標(biāo)本中189 份熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性， 結(jié)核桿菌DNA 拷貝數(shù)大多為102～103數(shù)量級(jí)；241 份陽(yáng)性標(biāo)本中223 份熒光定量PCR 檢測(cè)陽(yáng)性，結(jié)核桿菌DNA 拷貝數(shù)大多為103～104數(shù)量級(jí)， 與涂片陽(yáng)性程度表現(xiàn)為正相關(guān) （r=0.325，P＜0.05），如表1。

表1 熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果和涂片結(jié)果間相關(guān)性

3 討論

臨床上在對(duì)可疑結(jié)核標(biāo)本開(kāi)展檢測(cè)時(shí)，常用的方法為涂片、抗酸染色及金胺O 熒光染色法，上述方法的操作較為簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度快，同時(shí)檢測(cè)費(fèi)用低。 金胺O 染色法所具備的檢測(cè)特異度超過(guò)90%，導(dǎo)致這一情況出現(xiàn)的原因可能和非結(jié)核分歧桿菌感染率較低有關(guān)。 除此之外，涂片金胺O 染色法無(wú)法對(duì)結(jié)核分歧桿菌的活性進(jìn)行判斷，同時(shí)涂片檢測(cè)結(jié)果的特異性以及靈敏度也會(huì)受標(biāo)本中所具備的菌量以及操作人員自身辨識(shí)能力的影響。 目前公認(rèn)的對(duì)結(jié)核菌進(jìn)行檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)為結(jié)核菌培養(yǎng)，其具備較高的陽(yáng)性率，同時(shí)可對(duì)活菌進(jìn)行確認(rèn)［5］。但該檢測(cè)方法的不足之處在于需要耗費(fèi)較長(zhǎng)的檢測(cè)時(shí)間，除此之外，培養(yǎng)基上的菌落特征還需要開(kāi)展進(jìn)一步的鑒定和辨別。熒光定量PCR 技術(shù)是以分子生物學(xué)作為基礎(chǔ)，隨著研究的深入，其在病毒、慢性生長(zhǎng)菌和難生長(zhǎng)菌的檢測(cè)以及鑒定中的應(yīng)用率不斷提升，由于設(shè)計(jì)引物存在菌屬特異性，同時(shí)可發(fā)揮擴(kuò)大效應(yīng)，因此可提升檢測(cè)結(jié)果的可信度［6］。

熒光定量PCR 是依靠熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理，應(yīng)用相應(yīng)的熒光基團(tuán)以及淬滅基團(tuán)來(lái)標(biāo)記核酸探針或引物，再通過(guò)核酸雜交以及水解所獲取的熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)結(jié)合或分開(kāi)的原理而建立。 本次研究中，應(yīng)用的一對(duì)引物以及熒光雙標(biāo)記探針，可和引物擴(kuò)增區(qū)的一段DNA 模板進(jìn)行有效結(jié)合， 由此促使PCR 技術(shù)能夠和熒光檢測(cè)技術(shù)實(shí)現(xiàn)有效結(jié)合，并且在試劑盒內(nèi)對(duì)dUPT-UNG 酶防污染體系予以應(yīng)用，可有效預(yù)防實(shí)驗(yàn)污染的情況。 相較于普通的PCR 檢測(cè)，熒光定量PCR 檢測(cè)獲取的電泳靈敏度較前者高2～3 個(gè)數(shù)量級(jí)，可使檢測(cè)方法的敏感度明顯提高［7］。

本次研究中，1 012 份標(biāo)本中包括陽(yáng)性標(biāo)本241份，陰性標(biāo)本771 份，其中陽(yáng)性標(biāo)本中包括18 份可疑陽(yáng)性，56 份1+陽(yáng)性，63 份2+陽(yáng)性，84 份3+陽(yáng)性以及20 份4+陽(yáng)性。 771 份陰性標(biāo)本中189 份熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性， 結(jié)核桿菌DNA 拷貝數(shù)大多為102～103數(shù)量級(jí)； 通過(guò)理論分析， 熒光定量PCR 檢測(cè)具備的敏感度明顯高于涂片抗酸染色鏡檢， 而通過(guò)本次研究可知， 熒光定量PCR 檢測(cè)的DNA 拷貝數(shù)較涂片陽(yáng)性樣本明顯更低。 分析原因，可能是由于熒光定量PCR 陽(yáng)性檢出率的提升主要還是依靠其自身的靈敏度較高；當(dāng)然也可能存在實(shí)驗(yàn)污染的情況，雖然熒光定量PCR 檢測(cè)中實(shí)現(xiàn)全封閉操作，但DNA 提取、樣本液化過(guò)程中也可能導(dǎo)致污染情況的出現(xiàn)［8］。 本次研究中，241 份陽(yáng)性標(biāo)本中223 份熒光定量PCR 檢測(cè)陽(yáng)性， 結(jié)核桿菌DNA 拷貝數(shù)大多為103～104數(shù)量級(jí)， 與涂片陽(yáng)性程度表現(xiàn)為正相關(guān)，由于本次研究未對(duì)樣本開(kāi)展分枝桿菌培養(yǎng)，因此241 份陽(yáng)性標(biāo)本中出現(xiàn)陰性樣本，首先可能是由于涂片陽(yáng)性菌屬于非結(jié)核分枝桿菌；其次是熒光定量PCR 檢測(cè)過(guò)程中發(fā)生假陰性的情況。在熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的樣本中， 熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果和涂片結(jié)果間呈現(xiàn)為正相關(guān)，表明熒光定量PCR 檢測(cè)具備較高的定量準(zhǔn)確度。但在判定二者的相關(guān)性時(shí)，是以涂片鏡檢結(jié)果真實(shí)可靠作為前提，但涂片鏡檢結(jié)果可靠性也可能受到多種因素的影響，如染色質(zhì)量、樣本質(zhì)量、操作流程是否正確等， 同時(shí)涂片鏡檢結(jié)果的陽(yáng)性判定為半定量性質(zhì)。因此根據(jù)涂片鏡檢結(jié)果來(lái)分析熒光定量PCR 的定量功能，可能僅具備相對(duì)意義。

綜上所述， 熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)核桿菌DNA的拷貝數(shù)與涂片抗酸染色鏡檢陽(yáng)性程度存在較為明顯的相關(guān)性，可作為結(jié)核桿菌檢測(cè)的有效方法。