羅德威，歐陽輝，黃光春

1.江西中醫(yī)藥大學，中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心，江西 南昌 330045；2.南昌傲凡良品科技有限公司，江西 南昌 331799

成纖維細胞（Fibroblasts）是皮膚真皮層構(gòu)成中最常見的細胞，其作為一種修復細胞可以合成及分泌膠原、細胞外基質(zhì)和生長因子，在創(chuàng)傷修復、愈合、收縮中起著極其重要的作用［1-3］。皮膚損傷創(chuàng)面的臨床治療方法選擇，一直是研究的熱點內(nèi)容。根據(jù)以往文獻報道，膠原蛋白在皮膚燒傷的修復、治療和護理中能發(fā)揮重要的作用，其能有效地改善傷口燒傷的程度,并起到預防感染的效果［4-6］。本研究運用體外培養(yǎng)人真皮膚成纖維細胞，觀察不同來源的膠原蛋白對成纖維細胞生長干預的影響，對各膠原蛋白生物活性進行考察，為進一步研究膠原蛋白提供了基礎(chǔ)［7-10］。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

不同廠家來源膠原蛋白粉、彈性蛋白、復合彈性蛋白、玫瑰花粉、鮭魚蛋白粉共12 種，具體編號見表1。

表1 膠原蛋白受試樣品編號

1.2 實驗試劑

DMEM 高糖培養(yǎng)基（GE 有限公司）；胰蛋白酶（Solarbio 有限公司）；青霉素、鏈霉素（Solarbio 有限公司）；胎牛血清（Invitrogen 有限公司）；四氮甲唑藍（MTT，北京索萊寶科技有限公司）；SDS、異丁醇、鹽酸均試劑均為AR 級（國藥試劑）；人真皮成纖維細胞株（HDF-a 細胞，中科院上海細胞庫，Lot.No 13056）。

1.3 實驗儀器

3111 細胞培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技有限公司）；倒置顯微鏡（上海皆準儀器設(shè)備有限公司）；DK-420S 恒溫水浴鍋（江蘇榮華儀器制造有限公司）；124986D 微量進樣器（Eppendorf 公司）；LEICA DMI3000 B 倒置顯微鏡（萊卡公司）；Infinite M2000 PRO 全波長酶標儀（TECAN 有限公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 不同來源膠原蛋白樣品處理 根據(jù)實驗設(shè)計，配制10 000 μg/mL不同來源膠原蛋白作為評價母液，并用0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，并稀釋至5 000、2 000、1 000、500、250、125、100、62.5 μg/mL 共8 個濃度，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 四氮甲唑藍（MTT）法檢測膠原蛋白 對HDF-a 細胞生長的影響將HDF-a 細胞用胰酶消化，吹打計數(shù)，稀釋至1×105個/mL，每孔100 μL 接種于96 孔細胞培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h。24 h 后吸出培養(yǎng)基，樣品組加入不同濃度膠原蛋白100 μL，空白對照組加入等量的細胞培養(yǎng)基，每個濃度設(shè)5 個復孔，繼續(xù)孵育48 h后每孔加入20 μL（5 mg/mL）MTT，再于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，每孔加入100 μL 濃度10%的SDS 三聯(lián)溶解液，靜置孵育過夜后，于酶標儀上測定吸光度（檢測波長490 nm）。細胞存活率（%）=實驗組吸光度/空白對照組吸光度均值×100。

2 結(jié)果

由（圖1）可見，1 號、2 號除在濃度100 μg/mL 外，在其他各濃度對成纖維細胞生長均為促進作用。4號、8 號、10 號、11 號和12 號，于本實驗的不同濃度下對成纖維細胞的生長均起到促進效果，且10 號對人真皮成纖維細胞生長促進作用最為顯著。9 號除在濃度62.5 μg/mL 外，在其他各濃度下作用成纖維細胞均起到了促進生長效果。5 號在本次實驗設(shè)置的濃度下對成纖維細胞生長均為抑制作用。3 號、6 號除了在濃度為10 000 μg/mL 情況之外，在其他濃度下對成纖維細胞生長均為抑制作用。7 號除了在10 000 μg/mL、2 000 μg/mL 情況外，在其他濃度下對成纖維細胞生長均為抑制作用。具體影響情況見表2。

圖1 膠原蛋白在不同濃度下對人真皮成纖維細胞存活率的影響

表2 膠原蛋白對人真皮成纖維細胞生長影響

3 討論

MTT 檢測法結(jié)果顯示，不同來源的膠原蛋白，大部分對HDF-a 細胞均能起到生長促進的作用，驗證了膠原蛋白可以作用臨床皮膚損傷創(chuàng)面治療使用。過高或過低濃度的膠原蛋白，均不能起到最佳促進纖維蛋白生長作用，在臨床中要選擇最適濃度進行治療。部分膠原蛋白對HDF-a 細胞生長起到了抑制作用，這種情況的出現(xiàn)可能與對HDF-a 細胞起到了免疫排斥作用有關(guān)，在臨床使用中，需進一步甄別不同來源膠原蛋白，杜絕不合理膠原蛋白使用。

本研究中，考察了12 個批次來源膠原蛋白對HDF-a 細胞生長的影響。各批次樣品設(shè)置了10 000 μg～62.5 μg 范圍內(nèi)9 個濃度值，涵蓋范圍廣。對膠原蛋白發(fā)揮對細胞活性影響進行了有效的篩選，對于解釋膠原蛋白對成纖維細胞生長調(diào)控提供了基礎(chǔ)。本次研究只針對體外活性進行了考察，由于創(chuàng)面損傷修復過程發(fā)生在復雜體內(nèi)，關(guān)于膠原蛋白參與真皮組織修復的內(nèi)在機制，尚有待于進一步探索［11-13］。

膠原蛋白因其獨特的三維結(jié)構(gòu)和良好的生物相容性，日漸成為生物醫(yī)學、功能性保健品領(lǐng)域的熱門研究課題［14-16］。皮膚損傷創(chuàng)面治療中使用具有優(yōu)良修復功能的膠原蛋白，展示出了極具前景的治療效果，但關(guān)于膠原蛋白促進成纖維細胞生長在基因水平、蛋白水平及分子水平的具體作用機制還有待深入研究。