韓莎 李成林 胡煒 趙斌 姚琳琳 王琦

(山東省海洋生物研究院，山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266104)

近年來，隨著我國刺參養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的高速發(fā)展，養(yǎng)殖敵害問題日趨突出[1-2]，一定程度上影響了產(chǎn)業(yè)的高效健康發(fā)展，如何有效防控?cái)澈ι镆殉蔀槔_刺參養(yǎng)殖者的問題。玻璃海鞘(Cionaintestinalis)作為刺參育苗系統(tǒng)中常見的危害較大的敵害生物，不僅與刺參爭奪生活空間和餌料，而且會(huì)消耗水體中的溶解氧并排泄大量代謝物，從而抑制刺參的生長，影響刺參苗種培育的產(chǎn)量和質(zhì)量[3]。一直以來，清除玻璃海鞘的首選做法是采用人工分揀，但傳統(tǒng)方式不僅費(fèi)工費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且很難清除干凈，在操作過程中還極易引起參苗的應(yīng)激反應(yīng)，從而影響刺參苗種的正常攝食和生長。目前在刺參苗期生產(chǎn)中有效防控及清除玻璃海鞘的技術(shù)和方法仍然不多，尤其是能夠有效殺除玻璃海鞘又對(duì)刺參無明顯不良影響的綠色藥物尚不多見。

茶皂素(tea saponin)又名茶皂苷，是從山茶屬(Cameuia)植物中提取的純天然活性物質(zhì)，尤其在茶籽中含量最多。已有研究證實(shí)，茶皂素在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上可作為清塘劑、殺蟲劑、生長調(diào)節(jié)劑、抗應(yīng)激劑等[4-5]，其效果優(yōu)良，對(duì)環(huán)境友好。目前尚未見采用茶皂素殺除玻璃海鞘的研究報(bào)道。本試驗(yàn)旨在研究茶皂素對(duì)玻璃海鞘的殺除效果，探究最適殺除質(zhì)量濃度和最佳作用時(shí)間，以加快有效殺除玻璃海鞘綠色藥物的研究開發(fā)，為刺參苗期有效防控和清除玻璃海鞘提供理論依據(jù)和技術(shù)參考，推進(jìn)刺參工廠化育苗和養(yǎng)殖生產(chǎn)的高效綠色發(fā)展。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用藥品為市購的天然高純度茶皂素(即茶籽粉)，實(shí)驗(yàn)室用，呈淺棕色，粉末狀，茶皂素有效含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為80%。

附有玻璃海鞘和刺參苗種的波紋板框采集于山東省海洋生物研究院種質(zhì)資源中心鰲山試驗(yàn)基地。玻璃海鞘個(gè)體直徑5～12 mm，參苗規(guī)格為(0.30±0.08)g。將附有參苗及玻璃海鞘的波紋板置于0.2 m3的玻璃鋼水槽中，24 h充氣，待刺參苗種適應(yīng)48 h后進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)海水為經(jīng)過沙濾的天然海水，水溫24.8～25.0 ℃，鹽度33.2，pH為8.3，DO不低于6.2 mg/L。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在60 L整理箱中進(jìn)行，每個(gè)整理箱中放置附有50個(gè)玻璃海鞘和50頭刺參苗的波紋板1枚。將茶皂素粉末溶解于海水中配制成溶液，設(shè)置茶皂素質(zhì)量濃度分別為5、10、20、30、40、50、60 mg/L的7個(gè)試驗(yàn)組，每組設(shè)3個(gè)平行，分別于試驗(yàn)開始后1、2、3、6、12 h觀測玻璃海鞘的脫落及死亡情況，以及參苗體表、肉刺的變化和附著活動(dòng)情況。試驗(yàn)結(jié)束后，將參苗轉(zhuǎn)移到注有新鮮海水的整理箱中，觀察并統(tǒng)計(jì)其恢復(fù)和活動(dòng)情況。

1.3 試驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

玻璃海鞘死亡判定標(biāo)準(zhǔn)：水孔關(guān)閉，對(duì)外界刺激無反應(yīng)，背囊褶皺、無彈性，內(nèi)臟呈黃色、渾濁狀，轉(zhuǎn)移到新鮮海水中無法恢復(fù)。刺參恢復(fù)狀態(tài)判定標(biāo)準(zhǔn)：初步復(fù)蘇的刺參活力較差，受到外界刺激時(shí)有收縮反應(yīng)，附著力較弱，分布于整理箱底部，不活動(dòng)；完全復(fù)蘇的刺參活力正常，附著力較強(qiáng)，分布并附著于波紋板或者容器壁上，呈自由爬行活動(dòng)狀態(tài)。

玻璃海鞘死亡率和刺參損傷率按下式計(jì)算。

死亡率(%)=死亡的玻璃海鞘數(shù)/玻璃海鞘總數(shù)×100

(1)

損傷率(%)=化皮的參苗數(shù)/參苗總數(shù)×100

(2)

2 結(jié)果

2.1 茶皂素對(duì)玻璃海鞘的作用效果

試驗(yàn)結(jié)果表明，茶皂素對(duì)玻璃海鞘具有致死作用。當(dāng)加入茶皂素溶液后，玻璃海鞘逐漸向內(nèi)部用力收縮，身體緊縮、變小，出水口緊閉，放入新鮮海水中恢復(fù)一段時(shí)間后能夠恢復(fù)正常狀態(tài)。但隨著茶皂素質(zhì)量濃度的提高，玻璃海鞘出水孔緩慢張開，水孔閉合節(jié)奏變慢，與正常狀態(tài)明顯不同。在藥物作用下，其出水孔逐漸伸長并保持張開的狀態(tài)，人為刺激無閉合反應(yīng)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，死亡玻璃海鞘的背囊褶皺、無彈性，出水孔處于張開狀態(tài)，內(nèi)臟團(tuán)緊縮，呈黃色渾濁狀，對(duì)人為刺激毫無反應(yīng)，放入新鮮海水中亦不能恢復(fù)到正常狀態(tài)。

2.2 不同質(zhì)量濃度茶皂素對(duì)玻璃海鞘的殺除效果

不同質(zhì)量濃度茶皂素溶液對(duì)玻璃海鞘的殺除效果見表1。試驗(yàn)結(jié)果顯示，5、10、20 mg/L質(zhì)量濃度組在藥浴12 h后玻璃海鞘的殺除率分別為32.3%、67.7%、83.3%。30 mg/L組在藥浴3 h后，玻璃海鞘的殺除率為98.3%，藥浴6 h殺除率可達(dá)100%。40 mg/L組在藥浴2 h后，玻璃海鞘的殺除率為99.7%，藥浴3 h時(shí)殺除率可達(dá)到100%。50、60 mg/L組藥浴2 h，玻璃海鞘的殺除率即可達(dá)到100%，其中60 mg/L組在藥浴1 h后，玻璃海鞘的殺除率可達(dá)97.7%。

表1 不同質(zhì)量濃度茶皂素對(duì)玻璃海鞘的殺除率

2.3 茶皂素對(duì)刺參的毒性影響

刺參苗種在質(zhì)量濃度為5～60 mg/L的茶皂素溶液中藥浴，6 h內(nèi)均活力正常(見表2)，其棘刺無收縮，身體自由伸展，無明顯異常，藥浴12 h后則出現(xiàn)不同程度的身體疲軟、棘刺收縮現(xiàn)象，其中50、60 mg/L試驗(yàn)組刺參在藥浴8 h后出現(xiàn)輕度化皮現(xiàn)象，12 h時(shí)刺參的損傷率分別為6.7%和13.3%。藥浴完成后，將刺參放入新鮮海水中，質(zhì)量濃度5～40 mg/L試驗(yàn)組的刺參在12 h后即可恢復(fù)到正常狀態(tài)，其棘刺恢復(fù)正常，無化皮、吐腸等不良現(xiàn)象，50、60 mg/L試驗(yàn)組中有化皮損傷的刺參也未出現(xiàn)死亡，放入新鮮海水中經(jīng)過一段時(shí)間能夠恢復(fù)到正常狀態(tài)。

表2 茶皂素對(duì)刺參的毒性影響

3 討論

作為1種天然藥物，茶皂素在環(huán)境中易降解，對(duì)人畜安全，口服無毒，在水產(chǎn)上也有根據(jù)其生物活性開發(fā)出的具有養(yǎng)殖保護(hù)[5]、促進(jìn)生長[6]、病害防治[7]等功能的產(chǎn)品。已有研究表明，茶皂素對(duì)細(xì)菌和某些真菌有顯著的抑制作用，還可以防治對(duì)蝦黑鰓病，控制寄生蟲，對(duì)一些有害生物如福壽螺等螺類[8-9]、雜魚類也有一定的毒殺效果。茶皂素對(duì)福壽螺卵的孵化有較強(qiáng)抑制作用，對(duì)幼螺也有極強(qiáng)的毒殺作用，用質(zhì)量濃度為2.5 mg/L的茶皂素溶液浸浴3 d，幼螺死亡率達(dá)100%，但茶皂素對(duì)成螺作用效果較差。本研究表明，茶皂素在刺參苗期對(duì)玻璃海鞘殺滅效果良好，分別用30、40 mg/L的茶皂素溶液藥浴6 h、3 h，用50、60 mg/L的茶皂素溶液藥浴2 h，玻璃海鞘的殺除率均可達(dá)100%。目前，茶皂素的生物活性及其毒殺作用機(jī)理尚不完全清楚，從已有的研究推斷，它是通過改變細(xì)胞膜的通透性而使細(xì)胞質(zhì)外滲，即對(duì)動(dòng)物血紅細(xì)胞具有溶血作用是其毒性的原因[4,10]，這可能也是茶皂素殺除玻璃海鞘的作用機(jī)制之一，具體原因有待進(jìn)一步研究證實(shí)。研究結(jié)果可為有效控制玻璃海鞘的生存與繁殖，探明茶皂素活性物質(zhì)作用機(jī)理及綠色藥物的研制開發(fā)提供理論依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，刺參對(duì)茶皂素有較好的適應(yīng)性。雖然茶皂素有一定的毒害作用，但刺參敏感性較差，用低濃度的茶皂素短時(shí)間浸浴對(duì)刺參無明顯不良作用，而在高濃度的茶皂素溶液中浸浴8 h后刺參出現(xiàn)輕度不適現(xiàn)象，但放入新鮮海水中一段時(shí)間后也能夠恢復(fù)正常狀態(tài)。作為1種優(yōu)良的植物源表面活性劑，茶皂素具有良好的濕潤和懸浮能力[11]，高濃度溶液濕潤展布性能較好，易在參苗體表形成一層藥膜，一定程度上阻礙了刺參的呼吸活動(dòng)。推測這可能是長時(shí)間浸浴后刺參出現(xiàn)不同程度身體疲軟、棘刺收縮甚至輕度化皮等現(xiàn)象的原因。

綜合考慮茶皂素對(duì)玻璃海鞘殺除效果以及對(duì)刺參苗種的影響，選用質(zhì)量濃度為30～40 mg/L的茶皂素溶液藥浴2～3 h對(duì)玻璃海鞘具有很好的殺除效果，殺除率接近100%，同時(shí)對(duì)刺參苗種無明顯的毒副作用，不會(huì)產(chǎn)生不良應(yīng)激反應(yīng)，參苗在重新放入新鮮海水中后很快恢復(fù)到正常狀態(tài)?；趯?duì)生態(tài)環(huán)境的保護(hù)，我國在漁業(yè)生產(chǎn)上大力推行綠色養(yǎng)殖，化學(xué)藥品的使用正逐步規(guī)范化，一些藥品被限制甚至禁用，而茶皂素經(jīng)濟(jì)高效、綠色安全、生態(tài)環(huán)保，具有較好的生產(chǎn)應(yīng)用效果。因此，在刺參育苗和工廠化養(yǎng)殖中采用適當(dāng)質(zhì)量濃度的茶皂素殺除玻璃海鞘，對(duì)刺參育苗和工廠化養(yǎng)殖中敵害生物的有效防控以及綠色環(huán)保具有積極的意義。