魏志敏，孫 斌，方 成，代子雯，劉滿強(qiáng)，焦加國(guó)，胡 鋒，李輝信，徐 莉

固氮芽孢桿菌N3的篩選鑒定及其對(duì)二月蘭的促生效果①

魏志敏，孫 斌，方 成，代子雯，劉滿強(qiáng)，焦加國(guó)，胡 鋒，李輝信，徐 莉*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，南京 210095)

從山東泰安農(nóng)田土壤中篩選獲得1株固氮能力強(qiáng)的菌株N3，通過形態(tài)觀察、生理生化特征以及16S rDNA基因序列分析，確定為巨大芽孢桿菌屬()，該菌株固氮酶活性達(dá)C2H428.33 nmol/(h·ml)。溫室條件下進(jìn)行二月蘭盆栽試驗(yàn)，設(shè)置不接菌對(duì)照(CK)、接種巨大芽孢桿菌N3、接種產(chǎn)吲哚乙酸(IAA)菌CDL29和復(fù)合接種菌株N3+CDL29四個(gè)處理，探討了接種不同植物促生菌對(duì)二月蘭的促生效果。結(jié)果表明：接種植物促生菌均促進(jìn)二月蘭的生長(zhǎng)，且單一接種固氮菌株N3的促生效果最好，其顯著提高二月蘭地上部氮、磷和地下部氮、鉀的含量，相比對(duì)照，增幅分別為33.03%、55.56% 和29.87%、51.11%，其他處理也有提高二月蘭養(yǎng)分含量的趨勢(shì)，但并不顯著；單一接種菌株N3，土壤有機(jī)質(zhì)、全氮和速效養(yǎng)分含量顯著提高；接種植物促生菌均提高土壤微生物生物量碳(MBC)和氮(MBN)的含量，單一接種固氮菌株N3提升效果最佳，接種產(chǎn)IAA菌株CDL29和復(fù)合接種次之。此外，接種固氮菌株N3能夠顯著提升土壤固氮酶活性，接種菌株CDL29對(duì)土壤固氮酶活性沒有顯著影響。因此，單一接種固氮菌株N3在促進(jìn)二月蘭生長(zhǎng)、養(yǎng)分含量提高及土壤理化和生物學(xué)性質(zhì)改良上都具有顯著的效果。

植物促生菌；固氮；吲哚乙酸(IAA)；二月蘭

二月蘭()是十字花科植物，具有觀賞和綠化的價(jià)值，是北方地區(qū)不可多得的早春觀花、冬季觀綠的地被植物。它還是一種實(shí)用性冬綠肥[1]，盛花期含有豐富的氮、磷、鉀等礦質(zhì)元素，翻壓可以提高土壤有機(jī)碳含量，促進(jìn)土壤微生物的活性，有利于保持土壤肥力[2-3]，還能提高主作物的產(chǎn)量和品質(zhì)[4]。綠肥生物量是發(fā)揮其地面覆蓋、土壤殘留氮素截獲、土壤固碳和養(yǎng)分循環(huán)等農(nóng)田生態(tài)服務(wù)功能的重要基礎(chǔ)。研究表明施用氮肥可以顯著提高二月蘭的鮮草產(chǎn)量、養(yǎng)分累積量和籽粒產(chǎn)量[5-6]。但現(xiàn)在大部分氮的施入是通過施加化肥，對(duì)土壤、作物和環(huán)境都會(huì)帶來一系列的危害[7]。有研究表明通過接種植物促生菌(PGPB)可以提高植株生物量[8-10]和養(yǎng)分含量[11]，并對(duì)土壤有一定的改良作用[12]。植物促生菌是在一定條件下有利于植物生長(zhǎng)的自由生活在土壤、根際、根表、葉際的細(xì)菌[13]。它們的促生機(jī)制包括固氮、解磷、產(chǎn)生植物激素等[14-15]。

土壤供氮能力是綠肥作物生長(zhǎng)的重要限制因子，特別對(duì)于非豆科綠肥作物，其生長(zhǎng)所需氮素主要來源于土壤殘留無機(jī)氮和土壤礦化氮，因此提高土壤氮水平很重要。土壤中有一些固氮微生物可以通過生命活動(dòng)，將空氣中游離態(tài)的氮素直接轉(zhuǎn)變?yōu)楹衔?，除供自身生長(zhǎng)發(fā)育外，部分以無機(jī)狀態(tài)或簡(jiǎn)單的有機(jī)氮化物分泌于體外，供植物吸收利用[16]。由于植物能夠調(diào)控土壤周圍有益微生物的數(shù)量和活性[17]，植物根際土壤中微生物具有更多功能多樣性，因此，可從根際土壤中分離和選育功能各異的有益微生物[18-19]，比較不同功能微生物或者混合培養(yǎng)物對(duì)植物生長(zhǎng)的促進(jìn)效應(yīng)。

目前植物促生菌接種綠肥作物的報(bào)道較少，不同功能微生物的復(fù)合接種更少，而且除生物量外，綠肥養(yǎng)分含量及對(duì)土壤性質(zhì)的影響很少被關(guān)注。因此，本文嘗試從根際土壤中分離篩選高效固氮菌，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室保存的產(chǎn)吲哚乙酸(IAA)菌株，在溫室盆栽條件下研究單一和復(fù)合接種植物促生菌對(duì)綠肥作物——二月蘭的促生效果，以及對(duì)其養(yǎng)分含量和土壤性質(zhì)改良方面的影響，以為綠肥作物二月蘭專用菌劑的生產(chǎn)和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，pH 7.0 ~ 7.2。Ashby無氮培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，KH2PO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.2 g，CaCO35 g，CaSO4·2H2O 0.1 g，pH 6.8 ~ 7.0。無機(jī)鹽培養(yǎng)基：(NH4)2SO42 g，NaH2PO40.5 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl2·2H2O 0.1 g，pH 7.0 ~ 7.2。各培養(yǎng)基配置時(shí)均用蒸餾水定容至1 000 ml，121℃滅菌20 min，固體培養(yǎng)基在此配方基礎(chǔ)上加18 g瓊脂。

1.1.3 供試菌株 為比較篩選菌株的固氮能力和產(chǎn)IAA能力，選擇本實(shí)驗(yàn)室已篩選獲得的成團(tuán)泛菌CDL29[20]()、附著劍菌R[21]()以及購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心的固氮微生物圓褐固氮菌YH[22](，菌株編號(hào)為ACCC10006)、巴西固氮螺菌B[23](，菌株編號(hào)為ACCC10104)進(jìn)行對(duì)比。

1.2 固氮菌的篩選及功能測(cè)定

稱取10 g土樣，將其置于裝有適量玻璃珠和90 ml無菌水的250 ml三角瓶中，30℃、180 r/min振蕩20 min，靜置10 min，得到土壤懸浮液。采用梯度稀釋法稀釋至10–6后，吸取0.1 ml涂布在Ashby固體培養(yǎng)基上，平板置于30℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)24 h后，將不同類型典型單個(gè)菌落挑出，經(jīng)平板多次純化后，4℃保存在Ashby固體培養(yǎng)基斜面待用。

固氮酶活性的測(cè)定：采用乙炔還原法[24]。將篩選的固氮菌及對(duì)比菌株分別接入LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后用離心法收集菌細(xì)胞；再用無氮液體培養(yǎng)基重懸菌體，制成108CFU/ml的固氮菌懸液，作為待接種菌液；接種制好的固氮菌懸液于裝有2 ml無氮液體培養(yǎng)基的青霉素小瓶中，30℃培養(yǎng)24 h；用密封性好的注射器先從培養(yǎng)有菌的青霉素小瓶抽取1 ml空氣，再注入1 ml乙炔，用膠布密封針眼；繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取100 μl氣樣在氣相色譜儀上測(cè)定乙烯峰值。

采用Agilent 7890A氣相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，其工作條件設(shè)置為：前進(jìn)樣口溫度200℃，前檢測(cè)器(FID)溫度250℃，分離比5∶1，載體流速1 ml/min，氫氣流速30 ml/min，空氣流速300 ml/min，尾吹氣(氮?dú)?流速26 ml/min；柱溫為梯度升溫：32 ℃保持1 min，32 ~ 70℃升溫速度為30 ℃/min，70℃保持5 min，70 ~ 160 ℃升溫速度為10 ℃/min，160 ℃保持15 min。乙炔還原活性計(jì)算公式為：乙炔還原活性ARA(C2H4，nmol/(h·ml))=(實(shí)際C2H4× 峰面積標(biāo)注氣含量× 青霉素瓶容積)/(標(biāo)準(zhǔn)氣峰面積× 進(jìn)樣量× 培養(yǎng)時(shí)間× 樣品量)。

產(chǎn)IAA功能測(cè)定：將分離純化后的細(xì)菌及對(duì)比菌株，接種于含有L-色氨酸(100 mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中，180 r/min、30℃條件下?lián)u床培養(yǎng)1 d。吸取2 ml菌液于離心管，10 000 r/min離心10 min，取1.5 ml上清液并加入等體積Salkowski比色液(50 ml 35% HClO4+ 1 ml 0.5 mol/L FeCl3)于5 ml離心管中，避光靜置30 min，測(cè)定其OD530值。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算單位體積發(fā)酵液中IAA的含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制采用分析純的IAA梯度稀釋制備。

1.3 N3菌株的生理生化及16S rDNA序列分析

1.3.1 形態(tài)及生理生化特征測(cè)定 接種固氮菌N3于Ashby固體培養(yǎng)基平板上，觀察菌落、菌體形態(tài)[25]。參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》測(cè)定相關(guān)生理生化特征[26]。

由受力分析可知，只要有傾角產(chǎn)生，便會(huì)有水平方向的水平分力，也會(huì)由此產(chǎn)生一個(gè)加速度，也就是說無人機(jī)俯仰的速度會(huì)越來越大，如果向下速度過大會(huì)導(dǎo)致無人機(jī)無法及時(shí)拉升從而墜落損壞，因此俯仰運(yùn)動(dòng)一般不能產(chǎn)生較大傾角[19]。

1.3.2 16S rDNA 測(cè)序與系統(tǒng)學(xué)分析 常規(guī)方法培養(yǎng)菌株，SDS-CTAB法提取細(xì)菌基因組總DNA，作為擴(kuò)增模板，采用16S rDNA通用引物27f(5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492r(5'-TAC-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1.5 kb。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，進(jìn)入熱循環(huán)，94 ℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸10 min，共30個(gè)循環(huán)。DNA測(cè)序由南京思普金生物科技有限公司完成，再將所得序列在NCBI進(jìn)行比對(duì)，使用MEGA 5.1軟件以NJ法建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 二月蘭溫室促生試驗(yàn)

1.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將篩選出的固氮能力強(qiáng)的菌株N3和產(chǎn)IAA能力強(qiáng)的菌株CDL29分別接種于LB液體培養(yǎng)基，30℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h后，在無菌條件下將菌液倒入已滅菌的離心管中，8 000 r/min離心5 min，去掉上清液，再用無菌水重懸菌體，制成菌懸液。

取山東泰安種植花生的土壤3 kg裝盆，每盆種植15顆二月蘭，二月蘭種子首先用3% 雙氧水進(jìn)行表面消毒20 min，再用無菌水沖洗。菌液接種量按108CFU/g土接入，復(fù)合處理中兩株菌比例為1∶1，對(duì)照為接種等量無菌水，每個(gè)處理設(shè)4個(gè)重復(fù)，控制含水量至田間最大持水量的80%。種植4個(gè)月后，每盆采集長(zhǎng)勢(shì)一致的二月蘭3株測(cè)定生物量、養(yǎng)分含量和根系形態(tài)及活力指標(biāo)，同時(shí)采集土壤樣品，測(cè)定土壤養(yǎng)分含量、微生物生物量碳和氮(MBC、MBN)含量及固氮酶活性。

1.4.2 指標(biāo)測(cè)定 植株根系指標(biāo)測(cè)定：根系掃描儀(LA1600+scanner，Canada)掃描二月蘭根系形態(tài)，獲取根系圖像(Winrhizo2003b，Canada)進(jìn)行相關(guān)根系指標(biāo)分析。二月蘭根系活力測(cè)定采用TTC法。

植株養(yǎng)分含量測(cè)定：H2SO4-H2O2消煮法，植株氮含量采用凱氏定氮法，磷含量采用鉬藍(lán)比色法，鉀含量采用火焰光度計(jì)法。

土壤理化和生物學(xué)性質(zhì)測(cè)定：pH采用無CO2水浸提pH計(jì)法(土水質(zhì)量比1∶2.5)測(cè)定；有機(jī)質(zhì)含量采用重鉻酸鉀容量法測(cè)定；全氮含量采用半微量開氏法測(cè)定；全磷含量采用HClO4-H2SO4法測(cè)定；有效磷含量采用0.5 mol/L NaHCO3法測(cè)定；速效鉀含量采用NH4OAc浸提，火焰光度計(jì)法測(cè)定；土壤NH4+-N、NO– 3-N采用2 mol/L KCl溶液浸提，流動(dòng)分析儀( SEAL Auto Analyzer3，德國(guó)) 測(cè)定；土壤MBC、MBN采用氯仿熏蒸-硫酸鉀浸提法，K2CrO7外加熱法測(cè)定MBC含量，半微量凱氏定氮法測(cè)定MBN含量。

土壤固氮酶活性測(cè)定；采用乙炔還原法，取盆栽土樣15 g于100 ml血清瓶中，加入0.1 mol/L葡萄糖液2 ml，搖勻，塞上異丁基膠塞，加鋁蓋密封。用注射器從瓶中抽出5 ml空氣再注入等體積乙炔氣體，密封針眼，28℃培養(yǎng)2 d。培養(yǎng)結(jié)束后，取500 μl氣樣在氣相色譜儀上測(cè)定乙烯峰值(測(cè)定儀器和參數(shù)設(shè)置與菌株固氮酶活性測(cè)定一致)。乙炔還原活性計(jì)算公式為：

乙炔還原活性ARA(C2H4，μmol/(h·g))=

式中：為乙烯峰高/乙炔峰高；為絕對(duì)溫度；為測(cè)定時(shí)的氣溫；為測(cè)定時(shí)的大氣壓；760為標(biāo)準(zhǔn)大氣壓(汞柱)；為注入乙炔的量(ml)；22.4為1 g分子氣體在絕對(duì)溫度和標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下的體積；為測(cè)定樣品的干重(g)，為注入乙炔后的反應(yīng)時(shí)間(h)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 2007軟件處理數(shù)據(jù)，并運(yùn)用SPSS 20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，對(duì)其顯著性差異(<0.05)用LSD和Duncan’s 檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 固氮菌的篩選及功能測(cè)定

本研究從供試土壤中分離得到3株具有固氮能力的菌株，分別命名為N1、N2、N3。對(duì)菌株固氮酶活性和產(chǎn)IAA能力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖1所示，菌株N3固氮能力最強(qiáng)，固氮酶活性達(dá)C2H428.33 nmol/(h·ml)，與其他菌株間差異達(dá)到顯著水平。菌株成團(tuán)泛菌(CDL29)產(chǎn)IAA能力最強(qiáng)，培養(yǎng)24 h時(shí)IAA產(chǎn)生量達(dá)15.76 mg/L。

2.2 固氮菌N3的鑒定

2.2.1 形態(tài)及生理生化特征測(cè)定 篩選出的固氮菌株N3，如圖2所示，在無氮培養(yǎng)基上形成的菌落較小，為白色隆起，邊緣整齊，表面光滑濕潤(rùn)，不透明，不規(guī)則桿狀排列。該菌生理生化特性是：革蘭氏陽(yáng)性，兼性好氧，化能異氧，接觸酶陽(yáng)性，VP試驗(yàn)陰性，淀粉水解陽(yáng)性，明膠水解陽(yáng)性，硝酸鹽還原陰性。

2.2.2 16S rDNA序列分析及菌種初步鑒定 經(jīng)16S r DNA序列分析和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)在線比對(duì)，結(jié)果顯示，N3與的同源性達(dá)100%，序列登入號(hào)為MK391574。用MEGA 5.1軟件以NJ法建立系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，N3與(MF187637.1)同源性最高，結(jié)合形態(tài)以及生理生化特征鑒定菌株N3為巨大芽孢桿菌屬()。

2.3 植物促生菌接種二月蘭溫室促生試驗(yàn)

2.3.1 接種植物促生菌對(duì)二月蘭生長(zhǎng)的影響 由表1可知，與CK相比，各接種植物促生菌處理二月蘭地上部和地下部鮮重、株高和莖粗都增加，表明接種植物促生菌能促進(jìn)二月蘭的生長(zhǎng)。接種菌株N3處理二月蘭地上部和地下部鮮重、株高和莖粗顯著增加且數(shù)值最大，說明接種固氮菌株N3處理對(duì)二月蘭的促生效果好于接種產(chǎn)IAA菌株CDL29處理和復(fù)合菌株接種處理。

二月蘭接種植物促生菌后，根系生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)：根系總長(zhǎng)、表面積、體積以及根尖數(shù)都有顯著性提高，特別是N3處理，接種固氮菌株N3后二月蘭根系總長(zhǎng)、表面積、體積、根尖數(shù)較CK分別提高1.27倍、1.28倍、1.48倍、1.11倍(表1)。

此外，接種植物促生菌能顯著提高二月蘭根系活力，其中以接種固氮菌株N3處理最高，達(dá)0.16 mg/(g·h)，但接種菌株CDL29處理和復(fù)合接種N3+CDL29處理間沒有顯著差異(圖4)。

由表2可知，與CK相比，各接種植物促生菌處理二月蘭植株地上和地下部氮、磷、鉀養(yǎng)分含量有所增加，表明接種植物促生菌對(duì)二月蘭植株的養(yǎng)分含量有一定的積累作用。單一接種固氮菌株N3處理能顯著提高二月蘭地上部氮、磷和地下部氮、鉀的含量，相比CK，增幅分別為33.03%、55.56% 和29.87%、51.11%。單一接種產(chǎn)IAA菌株CDL29處理以及復(fù)合接種處理也有促進(jìn)二月蘭養(yǎng)分含量的趨勢(shì)，但并不顯著。

表1 不同處理對(duì)二月蘭生長(zhǎng)發(fā)育的影響

注：同列不同小寫字母表示處理間差異顯著(<0.05)，下同。

2.3.2 接種植物促生菌對(duì)二月蘭盆栽土性質(zhì)的影響 由表3可知，接種植物促生菌對(duì)土壤pH影響不大，但能夠提高土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷和速效養(yǎng)分含量。單一接種固氮菌株N3處理能顯著提高土壤全氮、NH+ 4-N和NO– 3-N含量，較CK分別提高了0.21倍、1.21倍和1.01倍。

接種植物促生菌均有效提高土壤MBC和MBN含量，單一接種固氮菌株N3處理提升效果最佳，土壤MBC和MBN含量達(dá)272.93 μg/g和91.55 μg/g(圖5)，復(fù)合菌株接種處理土壤MBC和MBN提升效果不如單一接種處理。

表2 不同處理對(duì)二月蘭植株養(yǎng)分含量的影響(g/kg)

表3 接種植物促生菌對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

由圖6可知，與CK相比，單一接種產(chǎn)IAA菌株CDL29處理并不影響土壤固氮酶活性，而單一接種固氮菌株N3處理能夠顯著提高土壤固氮酶活性，達(dá)C2H444.97 nmol/(g·h)，與CK相比提升了1.35倍。

3 討論

接種植物促生菌對(duì)二月蘭有一定的促生作用，且不同植物促生菌對(duì)二月蘭的促生效果不同，接種固氮菌株N3對(duì)二月蘭的促生效果好于產(chǎn)IAA菌株CDL29和復(fù)合菌株接種處理，較不接菌處理二月蘭地上部鮮重、株高和植株地上部氮、磷、鉀養(yǎng)分含量分別顯著提高了227.66%、56.12%、33.03%、55.56% 和31.94%。這與本實(shí)驗(yàn)室徐文思等[27]篩選獲得的產(chǎn)IAA菌株JX15和姜瑛等[28]篩選的固氮解磷菌株JX14接種花生盆栽試驗(yàn)結(jié)果“產(chǎn)IAA菌和固氮菌對(duì)花生具有很好的促生作用，能夠顯著促進(jìn)花生生物量和株高的增加，且兩者對(duì)花生的促生效果不同”一致。由于土壤供氮是綠肥作物生長(zhǎng)的重要限制因子，特別對(duì)于非豆科植物二月蘭，接種固氮菌株對(duì)土壤固氮微生物發(fā)揮重要的作用[29]。

接種植物促生菌對(duì)二月蘭根系生長(zhǎng)發(fā)育有較好的促生作用，根系總長(zhǎng)、表面積、體積以及根尖數(shù)和根系活力都顯著增加，且二月蘭植株地上和地下部氮、磷、鉀含量都有增加的趨勢(shì)。李冰等[30]研究表明，小麥幼苗接種植物根際促生菌后，對(duì)小麥根的總長(zhǎng)度、總表面積、根尖數(shù)有明顯促生作用，且這些指標(biāo)與小麥根干重、株高和莖干重顯著相關(guān)。鄭文波等[31]研究表明，接種產(chǎn)IAA、解磷菌株ZH5能提高花生根系的根長(zhǎng)、根表面積、根體積和根尖數(shù)，說明菌株ZH5對(duì)花生根系生長(zhǎng)發(fā)育有較好的促進(jìn)作用，進(jìn)而提高花生植株全磷養(yǎng)分含量。根的生長(zhǎng)情況和活力水平直接影響地上部的生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)狀況及產(chǎn)量水平。接種植物促生菌處理二月蘭根系具有更多的分支并且更長(zhǎng)更粗，增加了對(duì)養(yǎng)分的接觸面。此外，根系活力的增加促進(jìn)了二月蘭對(duì)土壤中營(yíng)養(yǎng)元素的吸收，進(jìn)而提高了其地上部鮮重、株高以及氮、磷、鉀養(yǎng)分含量。

土壤微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，其量的變化是評(píng)價(jià)土壤肥力高低的重要依據(jù)[32]。土壤固氮酶活性在一定程度上能夠反映土壤固氮微生物固氮酶作用能力及強(qiáng)弱。接種固氮菌株N3，能提高土壤脲酶活性，并且可以提高細(xì)菌總代謝活性[33]，通過固氮作用，將空氣中游離態(tài)的氮素直接轉(zhuǎn)變?yōu)楹衔颷34]，能顯著提高土壤全氮、NH+ 4-N和NO– 3-N含量。王慧橋等[35]研究表明，不同自生固氮菌均能提高玉米土壤有效氮含量，活化的養(yǎng)分更有利于二月蘭的生長(zhǎng)和吸收利用。本試驗(yàn)表明，接種植物促生菌對(duì)土壤pH影響不大，但能夠提高土壤有機(jī)質(zhì)、全磷、有效磷和速效鉀含量。接種植物促生菌均有效提高土壤MBC和MBN的含量，接種固氮菌株N3處理提升效果最佳，這與固氮菌株N3分離篩選于本試驗(yàn)所用土壤，屬于土著微生物，相比產(chǎn)IAA菌株CDL29具有更好的適應(yīng)性，更有利于功能的發(fā)揮有關(guān)。復(fù)合接種相比單一接種可能存在資源的競(jìng)爭(zhēng)，從而提升效果不如單一接種處理。接種固氮菌株N3后，土壤固氮酶活性最高，這與固氮菌株N3有較強(qiáng)的固氮酶活性直接相關(guān)，同時(shí)土著固氮菌株N3的強(qiáng)適應(yīng)能力及定殖能力也是原因之一。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)篩選出了1株固氮能力較強(qiáng)的菌株N3，固氮酶活性達(dá)C2H428.33 nmol/(h·ml)，通過細(xì)菌形態(tài)和生理生化特征以及16S rDNA基因序列分析，鑒定為巨大芽孢桿菌屬()。將該菌接種于二月蘭能有效促進(jìn)其生物量的增加、根系發(fā)育，提高二月蘭氮、磷、鉀養(yǎng)分的積累，同時(shí)有效提高土壤速效養(yǎng)分、有機(jī)質(zhì)、MBC和MBN含量及固氮酶活性。接種產(chǎn)IAA菌CDL29同樣能夠促進(jìn)二月蘭生長(zhǎng)，但在二月蘭養(yǎng)分積累和土壤性質(zhì)改良效果上不如接種固氮菌N3。復(fù)合接種兩株菌效果低于單一菌株處理，可見菌株之間的競(jìng)爭(zhēng)可能會(huì)影響效果的發(fā)揮。

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Isolation and Characterization of Bacillus Nitrogen-Fixing Bacteria and Its Growth- Promotion on

WEI Zhimin, SUN Bin, FANG Cheng, DAI Ziwen, LIU Manqiang, JIAO Jiaguo, HU Feng, LI Huixin, XU Li*

(College of Resources and Environmental Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

A strain N3 with strong nitrogen fixation ability was selected from the farmland soil in Taian, Shandong Province and was identified asbased on the morphological, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA gene sequences analysis. Its nitrogenase activity was up to C2H428.33 nmol/(h·ml). Four treatments were set to explore the inoculation effect of different plant growth-promoting bacterium on the growth of, including single or double inoculation of strain N3 or IAA (indole-3-acetic acid)-producing stainCDL29, plant without any inoculation set as the control treatment (CK). The pot experiment ofwas conducted under greenhouse conditions. The results showed that all plant growth-promoting bacteria promoted the growth of, and the treatment with single inoculation of nitrogen-fixing strain N3 was the best. At the same time, nitrogen and phosphorus contents in the shoots ofnitrogen and potassium contents in the roots ofwere significantly increased by the single inoculation of nitrogen-fixing strain N3, which were increased by 33.03%, 55.56% and 29.87%, 51.11% respectively compared with CK. Other treatments also promoted nutrient contents in, but the trends were not statistic significant. The contents of soil organic matter, total nitrogen and available nutrients were significantly increased by single inoculation of nitrogen-fixing strain N3. The contents of soil microbial carbon(MBC) and microbial nitrogen(MBN) were increased by the inoculation of different plant probiotics, single inoculation of nitrogen-fixing strain N3 had the best effect, followed by the single inoculation of IAA-producing stain CDL29 and compound inoculation. In addition, inoculation of nitrogen-fixing strain N3 significantly increased soil nitrogenase activity, while inoculation of CDL29 had no significant effect on soil nitrogenase activity. As a conclusion, the single inoculation of nitrogen-fixing strain N3 could significantly promote the growth, nutrient contents inand also improve the physicochemical and biological properties of the soil.

Plant growth-promoting bacterium; Nitrogen fixation; IAA;

S154.1

A

10.13758/j.cnki.tr.2021.01.009

魏志敏, 孫斌, 方成, 等. 固氮芽孢桿菌N3的篩選鑒定及其對(duì)二月蘭的促生效果. 土壤, 2021, 53(1): 64–71.

國(guó)家綠肥產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS-22-G-10)、公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)(201503121)和江蘇省優(yōu)勢(shì)學(xué)科項(xiàng)目資助。

(xuli602@njau.edu.cn)

魏志敏(1994—)，男，江西南昌人，碩士研究生，主要從事植物促生菌的篩選及其對(duì)綠肥的促生研究。E-mail：2017103026@njau.edu.cn