李 祎，楊順瑛，郝東利，蘇彥華*

利用和突變體研究外源蔗糖對高銨脅迫擬南芥碳氮代謝的影響①

李 祎1,2，楊順瑛1，郝東利1，蘇彥華1*

(1土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點實驗室(中國科學(xué)院南京土壤研究所)，南京 210008；2中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

以擬南芥野生型Col-0、谷氨酰胺合成酶敲除突變體和為實驗材料，采取土培試驗，比較正常培養(yǎng)液(4 mmol/L NH4+)培養(yǎng)(CK)、正常培養(yǎng)液(4 mmol/L NH4+)下外源添加5% 蔗糖(T1)、高NH4+脅迫(20 mmol/L)(T2)以及高NH4+脅迫(20 mmol/L)下外源添加5% 蔗糖(T3)對擬南芥各株系各生理指標(biāo)的影響；通過測定地上部分的鮮重、葉綠素、游離NH4+、可溶性糖、可溶性蛋白、谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸脫氫酶(GDH)、礦質(zhì)元素含量等指標(biāo)，研究外源蔗糖對NH4+脅迫擬南芥碳氮代謝的影響。結(jié)果表明，高NH4+脅迫下，擬南芥生長受到嚴(yán)重的抑制，鮮重、GS、GDH酶活性降低，游離NH4+含量、葉綠素含量、可溶性糖和可溶性蛋白含量增加，植株的N、P、K、Ca的含量增加，Mg、Fe的含量減少，其中和在高NH4+處理下受到的抑制比Col-0更為顯著。外源添加5% 蔗糖顯著緩解了高NH4+毒害，提高了可溶性糖和可溶性蛋白含量，提高了GS和GDH的活性，降低了葉綠素和游離NH4+的含量，提高了植株體內(nèi)的N、P、K、Ca，Mg的含量，降低了植株Fe的含量，其中，外源蔗糖對和高NH4+毒害的緩解更為顯著。

蔗糖；高NH4+脅迫；擬南芥；碳代謝；氮代謝

碳氮代謝是植物最基本的代謝過程[1]。氮代謝需要依賴碳代謝為其提供碳源和能量，碳代謝也需要氮代謝為其提供酶和光合色素。碳代謝和氮代謝需要共同的還原力、ATP和碳骨架[2]，因此，兩個代謝之間存在著競爭關(guān)系。碳氮代謝的平衡對植物碳氮營養(yǎng)的分配起著至關(guān)重要的影響[3-4]。氮素主要通過NH4+-N和 NO– 3-N兩種形式進(jìn)入植株體內(nèi)[5-6]，已有研究表明，植物優(yōu)先利用NH4+，但是，一旦植物吸收了過多的NH4+，就會對植物的生長發(fā)育產(chǎn)生銨毒害[7]。Harada等[8]研究發(fā)現(xiàn)：植物吸收過量NH4+后將在植物體內(nèi)造成游離銨的過量累積，從而引起植物的生長受到抑制。在高等植物中，谷氨酰胺合成酶(GS)則是NH4+同化途徑中的限速酶，對植物的生長發(fā)育和產(chǎn)量有直接的影響[9]。在擬南芥中研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥缺陷突變體，植株的子葉氮轉(zhuǎn)化再利用步驟受到抑制，從而導(dǎo)致子葉中游離氮積累，缺陷突變體長勢受到阻礙[10]。

蔗糖不僅僅是光合作用的主要產(chǎn)物之一，還可以作為信號分子參與植物的生長發(fā)育過程[11]，如作為信號分子調(diào)節(jié)擬南芥花青素的積累[12]；此外，蔗糖還可以提高植物的抗氧化能力[13]。另外糖也能參與到植物氮同化酶的調(diào)節(jié)，可以促進(jìn)離體植物葉片中硝酸還原酶(NR)在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)[14]；外源蔗糖還可以顯著升高煙草葉片中谷氨酰胺合成酶(GS)的活性[15]。除此之外，蔗糖還可以緩解植株在高鹽脅迫下植株的生命活動?，F(xiàn)在已經(jīng)有報道，外源添加蔗糖可以增強(qiáng)小麥幼苗抗鹽性[16]；外源添加蔗糖可以對鹽脅迫下蕎麥幼苗根系的生長有緩解作用[17]。

本試驗以擬南芥的谷氨酰胺合成酶相關(guān)基因的T-DNA突變體和野生型為材料。在高NH4+脅迫下，通過外源添加蔗糖對谷氨酰胺合成酶的T-DNA缺陷體和野生型的碳氮代謝相關(guān)基因、酶活性進(jìn)行研究，探索高NH4+脅迫下，如何維持?jǐn)M南芥的碳氮代謝平衡、為減輕NH4+脅迫對作物的毒害作用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

野生型擬南芥(Columbia)為本實驗室保存(下文簡稱Col-0)。GS家族T-DNA插入突變體購自ABRC(www.arabidopsis.org)，CS721512 (下文簡稱)和Salk-003343C(下文簡稱)。

2Mix rTaq、RNAiso Plus和 PrimeScriptTMIIRT 試劑盒以及 TaKaRa購自寶生物工程(大連)有限公司。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 培養(yǎng)方法

1.2.1 培養(yǎng)基培養(yǎng) 培養(yǎng)方法參考文獻(xiàn)[18]，光照培養(yǎng)箱的溫度為 (23 ± 1) ℃，光周期為16 h光照、8 h黑暗，光照強(qiáng)度為100 μmol/(m2·s)。營養(yǎng)液成分根據(jù)Yuan等[19]修改得：2 mmol/L NH4NO3，1 mmol/L KH2PO4，1 mmol/L MgSO4，250 μmol/L K2SO4，250 μmol/L CaCl2，100 μmol/L Na-Fe-EDTA，50 μmol/L KCl，50 μmol/L H3BO3，5 μmol/L MnSO4，1 μmol/L ZnSO4，1 μmol/L CuSO4，1 μmol/L Na2MoO4，1 mmol/L MES-KOH(2-碼啉已磺酸)，1% (/) 蔗糖，0.8% (/) 瓊脂，pH 5.7。純合體擬南芥種子先用10% 的次氯酸鈉(/)和0.1% (/) SDS消毒 5 min，然后用滅菌水清洗干凈(5 次)，置4 ℃ 低溫避光保存48 h，然后播種于培養(yǎng)基(10 cm × 10 cm)，密封好。將培養(yǎng)皿直立地置于光照培養(yǎng)箱中，讓根沿瓊脂表面向下生長。

1.2.2 高NH4+脅迫下外源添加蔗糖培養(yǎng) 在培養(yǎng)基生長7 d后，挑選長勢一致的植株幼苗移植到泥炭土︰蛭石︰石英砂=3︰3︰1的土培培養(yǎng)基中接著生長，土培培養(yǎng)基在用于生長前用清水漂洗，盡可能地除去里面所含有的營養(yǎng)物質(zhì)。土培培養(yǎng)時所用光照強(qiáng)度同前文培養(yǎng)基生長，培養(yǎng)液配方也參照前文培養(yǎng)基配方，但是不含有蔗糖和瓊脂，每周每組澆灌1 L培養(yǎng)液。等苗齡21 d后，分為3組，將培養(yǎng)液配方中NH4NO3更換為NH4Cl，其余成分與之前培養(yǎng)液一致，具體處理方法如表1。

1.3 試驗方法

1.3.1和突變體純合體鑒定和的基因名稱及引物序列見表2。

采用蔗糖法[20-21]提取擬南芥基因組DNA，隨后進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR所用引物序列如表2。

反應(yīng)體系如下：模板DNA 1 μl，正向引物(10 μmol/L)0.4 μl，反向引物(10 μmol/L)0.4 μl，2 ×Mix rTaq10 μl，雙蒸水8.2 μl，總體積20 μl，混勻后進(jìn)行PCR 反應(yīng)。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃ 預(yù)變性 3 min；94 ℃ 變性30 s，60 ℃ 退火45 s，72 ℃ 延伸 90 s，30次循環(huán)；最后 72 ℃ 延伸 10 min。PCR 產(chǎn)物利用1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，所用的電泳緩沖溶液為1×TBE，電泳電壓為120 V。

表1 試驗設(shè)計

表2 擬南芥T-DNA突變體株系及引物序列

利用 TaKaRa的RNAiso Plus 試劑提取擬南芥野生型與待檢測T-DNA 插入株系葉片的 RNA。用 NanoDrop 2000超微量分光光度計測定RNA的濃度。利用 Prime-Script TMIIRT試劑盒進(jìn)行cDNA合成。利用基因的特異引物-F(5′- CATCAACCTTAACCTCTCAGACTCCA-3′)和-R(5′-GGTTTGGCCCATCAGAATCG-3′)進(jìn)行RT- PCR 檢測的表達(dá)；利用基因的特異引物F(5′-CAT-CAACCTTAACCTC TCAGACTCCA-3′)和-R(5′-GGTTTGGCC CATCAGAATCG-3′)進(jìn)行 RT- PCR 檢測的表達(dá)。ACTIN1基因作為內(nèi)參，ACTIN1引物序列為 ACTIN1-F：5′-ACACCA-GACATAGTAGCAGAA ATCAAG-3′，ACTIN1-R：5′- GAGCCTTACAACGCT ACTCTGTCTGTC- 3′。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 3 min，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，25個循環(huán)；最后 72 ℃延伸 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0% 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。

1.3.2 外源蔗糖對高NH4+脅迫下植株生理生化的影響 將外源添加蔗糖處理4周的擬南芥植株收樣，并測定其鮮重。參照文獻(xiàn)[22-23]測定葉綠素含量；采用蒽酮比色法測定可溶性糖含量；采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定可溶性蛋白含量；采用靛酚藍(lán)比色法測定游離NH4+含量。每個處理重復(fù)3次，計算平均值。

1.3.3 外源蔗糖對高NH4+脅迫下擬南芥植株的GS 和GDH酶的影響 稱取0.2 g鮮樣葉片，放入預(yù)冷的研缽中，加入 1.5 ml 預(yù)冷的提取緩沖液，添加少量石英砂在冰上研磨，勻漿收集至2.0 ml離心管中，4 ℃，16 000離心20 min。將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中用于測定相關(guān)酶活性。提取緩沖液成分：50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)，10 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L EGTA，1 mmol/L苯甲脒，1 mmol/L ε-氨基乙酸和10 μmol/L亮抑酶肽。采用Migge 等[24]方法測定谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸脫氫酶(GDH)酶活性

1.3.4 外源蔗糖對高NH4+脅迫下擬南芥植株礦質(zhì)元素的影響 用天平稱量擬南芥地上部鮮重；參照文獻(xiàn)[23]，采用凱氏定氮法測定全氮；采用H2SO4- H2O2-釩鉬黃比色法測定全磷含量；采用H2SO4-H2O2火焰原子吸收分光光度法測定全鉀含量。采用干灰化–稀HCl溶解–火焰原子吸收分光光度法，測定鈣、鎂、鐵含量。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析 采用Microsoft Excel 2010軟件和SPSS13.0軟件進(jìn)行試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計和相關(guān)性分析，采用Duncan’s檢驗法進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 gs1.1和gs1.2插入純合體的鑒定

對擬南芥和株系鑒定結(jié)果如圖1B、1D，結(jié)果顯示該和突變體有非常清晰的插入特異性擴(kuò)增條帶，產(chǎn)物大約為700 bp。然后，對兩個株系DNA 樣品利用 T- DNA 插入兩端的LP 和 RP 引物進(jìn)行了PCR 擴(kuò)增，其結(jié)果如圖 1 C、1E，野生型樣品有預(yù)測的 1 057 bp和1 105 bp大小的特異 PCR 產(chǎn)物，而和株系樣品并沒有擴(kuò)增條帶，說明和為純合的T-DNA插入。對其進(jìn)行RT-PCR發(fā)現(xiàn)，在株系中，幾乎檢測不到，表明株系在T-DNA 插入的作用下，基因完全被敲除。在株系中，幾乎檢測不到，表明株系在T-DNA 插入的作用下，基因完全被敲除。

2.2 外源蔗糖對高NH4+ 脅迫下擬南芥植株鮮重的影響

從表3可以看出，CK處理，Col-0和、3個株系的鮮重并沒有顯著差異。T1處理下，和CK相比較，3個株系的鮮重都略有增加，分別增加了2.3%、2.3% 和3.5%，并未達(dá)到顯著差異；T2處理下，3個擬南芥植株的鮮重出現(xiàn)降低，和CK相比分別降低了14.6%、24.0% 和23.0%，其中Col-0的降低幅度最小，遠(yuǎn)低于和；T3處理下，3個株系植株的鮮重和T2處理相比，有所增加，其增加的幅度依次為6.7%、10.9% 和10.5%，其中，和的增加幅度要大于Col-0；T3處理下和CK相比，3個株系的鮮重分別降低了6.8%、13.7% 和11.9%，其中，Col-0降低的幅度最??；表明蔗糖可以緩解高NH4+脅迫對擬南芥生長的抑制，但是緩解作用有限，并不能完全緩解高NH4+脅迫作用，其中外源添加蔗糖對和的效果更為明顯。

2.3 外源蔗糖對高NH4+ 脅迫下擬南芥植株游離NH4+和葉綠素含量的影響

從圖2 中可以看出，和CK相比，T1處理下，Col-0、和植株體內(nèi)的游離NH4+含量分別降低了1.7%、4.4% 和3.7%；T2處理下，和CK相比，3個株系的游離NH4+含量分別增加了35.0%、54.3% 和46.4%，其中，的游離NH4+含量增加最為明顯，其次為，Col-0的增加最少；和T2相比，T3處理下，游離NH4+含量分別降低了6.5%、12.2% 和15.1%。外源添加蔗糖可以在一定程度上減少植物體內(nèi)游離NH4+含量，對高NH4+處理下植株更為明顯，相較而言，外源添加蔗糖對高NH4+脅迫下的和的緩解能力更強(qiáng)。

表3 外源蔗糖對高NH4+ 脅迫下擬南芥鮮重影響(g/株)

注：表中同列小寫字母不同表示不同處理下同一株系間差異達(dá)<0.05顯著水平。

葉綠素含量也是反映植物體中N含量的一個重要因素，從圖2可以看出，和CK相比，T1處理植物體內(nèi)的葉綠素含量分別降低了5.2%、15.3% 和15.7%，其中，和的葉綠素含量變化更為顯著，降低幅度大于Col-0；T2處理下，植株體內(nèi)的葉綠素含量分別增加了26.3%、33.4% 和29.6%，其中的葉綠素增加最為顯著。T3處理下，和T2相比，3個株系植株體內(nèi)葉綠素含量分別減少了9.5%、13.6% 和13.1%，其中，和變化幅度高于Col-0?？梢钥闯?，外源添加蔗糖，可以在一定程度上緩解高NH4+對擬南芥植株的脅迫，其中，對和的影響更為明顯。

2.4 外源蔗糖對高NH4+ 脅迫下擬南芥植株可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響

植物中碳水化合物是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，由圖3可知，T1處理下，與CK相比，3個株系可溶性糖含量分別增加了1.6%、1.3% 和3.1%，在CK處理和T1處理下，3個株系之間無顯著性差異；T2處理下，和CK相比，3個株系可溶性糖含量分別增加18.9%、8.4% 和10.6%，其中Col-0的增加幅度明顯高于和，Col-0和、之間達(dá)到顯著性差異；和T2處理相比，T3處理下，Col-0、和的可溶性糖含量分別增加5.0%、16.4% 和17.1%，和的增幅更為顯著，Col-0和和間沒有達(dá)到顯著性差異。

和CK相比，T1處理下，Col-0、和的可溶性蛋白含量均增加，分別增加5.5%、6.5% 和5.5%，在CK處理和T1處理下，3個株系之間并無顯著性差異；T2處理下，和CK相比，3個株系的可溶性蛋白含量分別增加了19.3%、14.7% 和14.1%，Col-0和、之間并沒有達(dá)到顯著性差異。和T2處理相比，T3處理下，Col-0、和的可溶性蛋白含量分別增加14.7%、16.9% 和19.3%，和的增幅更為明顯，Col-0和、都未達(dá)到顯著性差異。

高NH4+脅迫下，擬南芥植株的可溶性糖和可溶性蛋白含量增加，添加外源蔗糖在一定程度上增加了植株體內(nèi)可溶性糖和可溶性蛋白含量，從而增加植株碳水化合物的含量，維持細(xì)胞內(nèi)滲透壓的平衡，提高植物的抗逆性，同時為氮代謝提供碳源，維持碳氮代謝。

2.5 外源蔗糖對高NH4+ 脅迫下擬南芥植株GS和GDH活性的影響

GS、GDH是氮代謝中的關(guān)鍵酶，GS是無機(jī)氮轉(zhuǎn)化為有機(jī)氮的關(guān)鍵酶，GDH是連接碳、氮代謝的關(guān)鍵點。從圖4可知，T1處理下，和CK相比，植株葉片中GS的活性增加，Col-0、和分別增加了6.1%、5.2和1.9%，Col-0和、的GS酶活性存在顯著性差異；T2處理和CK相比，3個株系GS活性分別降低了15.9%、16.5% 和18.8%，說明高NH4+脅迫降低了GS的活性，3個株系的降低幅度差異并不大；T3處理下，和T2處理相比，3個株系的GS酶活出現(xiàn)不同程度的增加，分別提高了4.7%、19.7% 和19.5%，添加外源蔗糖對和的GS酶活提高更顯著。添加外源蔗糖可以提高植株中GS的活性，促進(jìn)植物中無機(jī)氮轉(zhuǎn)化為有機(jī)氮的過程。

與CK相比，T1處理中，Col-0、和的GDH酶活分別增加了2.9%、3.6% 和3.2%，3 個株系之間并沒有顯著差異；T2處理下和CK相比，3個株系分別降低了30.6%、11.5% 和10.6%，其中，Col-0的降低幅度最為顯著，3個株系之間差異顯著；T3處理下提高了植物的GDH活性，和T2處理相比，Col-0、和分別增加了20.8%、19.7% 和19.5%，表明外源添加蔗糖在一定程度上可以提高植物中GDH酶活。

2.6 外源添加蔗糖對高NH4+ 脅迫下植株礦質(zhì)元素含量的影響

表4是外源添加蔗糖后，植物體內(nèi)礦質(zhì)元素的含量。從表4中可知，3個株系中的N、P、K、Ca的含量都呈現(xiàn)出T3>T2>T1>CK的趨勢。與CK相比，T1處理下，擬南芥中的N含量增加，3個株系分別增加了5.5%、8.8% 和15.2%；T2處理下，3個株系的N含量分別增加了32.2%、36.3% 和36.9%，與T2相比，T3處理下，N含量顯著增加了26.7%、28.6% 和27.5%。植株體內(nèi)P含量，在T1處理下比CK增加了4.4%、5.0% 和3.6%；T2處理下增加了42.8%、30.4% 和39.6%；和T2處理相比，T3處理下分別增加了24.3%、36.3% 和32.8%。植株體內(nèi)的K含量，與CK相比，T1處理下Col-0、和分別增加了6.6%、5.4% 和5.3%；T2處理下K含量增加16.9%、14.3% 和8.1%；和T2處理相比，T3處理下分別增加了7.1%、10.8% 和7.8%。植物中Ca含量，變化幅度和其他元素相比較低，與CK相比，T1處理下3個株系增加了0.06%、2.7% 和1.2%；T2處理和CK相比提高了1.2%、3.5% 和3.1%；T3處理和T2相比，增加了0.3%、2.4% 和3.4%。高NH4+脅迫下，植株的N、P、K、Ca含量都表現(xiàn)出不同程度的增加，外源添加蔗糖后，N、P、K、Ca的含量繼續(xù)不同幅度提高。

表4 外源添加蔗糖對高NH4+ 脅迫下擬南芥植株礦質(zhì)元素含量的影響(mg/g，F(xiàn)W)

注：表中同列小寫字母不同表示不同處理下同一株系間差異達(dá)<0.05顯著水平。

3個株系植株Mg含量都呈現(xiàn)出T1>CK>T3>T2的趨勢，與CK相比，T1處理分別增加了2.9%、6.0% 和4.1%，T2處理下降低了28.7%、12.8% 和20.8%；T3處理和T2相比，分別提高了10.8%、4.1% 和7.8%，高NH4+脅迫下植株中Mg含量減少，外源添加蔗糖在一定程度上提高了植株的Mg含量。3個株系植株Fe含量呈現(xiàn)出T2>T3>CK>T1的趨勢，和CK相比，T1處理下植株的Fe含量分別降低7.0%、9.5% 和9.5%，T2處理下分別增加38.1%、63.1% 和57.9%；T3處理下和T2相比減少了27.5.%、29.0% 和26.6%。高NH4+脅迫下植株的Fe含量增加，外源添加蔗糖在一定程度上減少植株的Fe含量。

3 討論

氮是植物生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)元素[25-26]，而NH4+是植物重要的氮素之一，但是高NH4+脅迫對植物的生長發(fā)育會有嚴(yán)重的抑制，而且和植株體內(nèi)的碳、氮代謝之間存在著復(fù)雜的聯(lián)系[27]。一般來說，高NH4+毒害產(chǎn)生的首要原因，是植物體內(nèi)積累了較多的自由NH4+，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了植物自身同化量[28]。有研究認(rèn)為GS是NH4+高效利用植物的綠色組織中NH4+解毒和代謝中的一個關(guān)鍵因子[29]。因此，缺乏或者基因，植株的銨同化能力受到部分抑制。而植物的鮮重可直觀地反映植株生長狀況[24, 30]，葉綠素含量也是反映植株體內(nèi)含N量的一個重要因素。李保海和施衛(wèi)明[31]在研究中發(fā)現(xiàn)，擬南芥葉綠素含量隨著外界NH4+的增加而增加，其中對NH4+敏感的株系含量增加更明顯。Raab和Terry[32]報道高NH4+能抑制甜菜葉面積的生長，增加葉綠素含量，但是單位面積的光合速率不變。羅金葵等[33]也報道，隨著NH4+濃度的增加，小白菜植株葉綠素含量升高，葉面積減少，但是光合速率并不受影響。因此初步猜測高NH4+下植株葉綠素含量增加是因為植物為了保持光合速率的不變，在葉面積減少的情況下，增加葉綠素含量用來維持光合速率。本文試驗結(jié)果也與之符合，高NH4+脅迫下擬南芥植株的鮮重減少，體內(nèi)游離NH4+積累量增多，葉綠素含量增加，、和Col-0相比，受到高NH4+毒害更為嚴(yán)重，可能是因為和缺陷突變體缺乏和基因，植株本身的同化能力就受到一定程度的抑制，因此體內(nèi)游離NH4+不能及時同化，導(dǎo)致積累過多，從而對植株生長產(chǎn)生毒害。

本試驗中，高NH4+脅迫下外源添加蔗糖可以在一定程度上緩解高NH4+對植物的毒害[31, 33-34]。CK和T1處理相比，植株的鮮重、游離NH4+含量等數(shù)值差異并不顯著，基本排除了外源添加蔗糖緩解高NH4+脅迫是因為蔗糖提供營養(yǎng)的可能性。植株在逆境條件下會通過滲透調(diào)節(jié)來適應(yīng)環(huán)境，而可溶性糖和可溶性蛋白一般會作為植株體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，充當(dāng)衡量植物抗逆性的指標(biāo)。閆素芳等[16]報道，外源蔗糖可以通過提高小麥的可溶性糖含量來提高小麥幼苗的耐鹽性；常麗麗等[35]報道外源蔗糖可以緩解高NO– 3脅迫對葉用萵苣生長的抑制，提高葉用萵苣的可溶性糖含量，降低NH4+含量。本文研究結(jié)果表明，在高NH4+處理下，擬南芥的可溶性糖和可溶性蛋白含量都出現(xiàn)增加，猜測是因為植物為了通過滲透調(diào)節(jié)緩解高NH4+脅迫，高NH4+條件下外源添加蔗糖，可以增加擬南芥植株的可溶性糖和可溶性蛋白含量，進(jìn)一步幫助植株提高滲透調(diào)節(jié)緩解高NH4+脅迫，說明外源添加蔗糖可以增加植株體內(nèi)的碳水化合物含量，從而維持細(xì)胞的滲透壓平衡，提高植株的抗逆性；另外，外源添加蔗糖還可為氮代謝提供碳源，維持植株體內(nèi)的碳、氮平衡。

GS酶是植株體內(nèi)NH4+同化過程中的一個關(guān)鍵酶[36]，在高等植物中，95% 的NH4+是通過GS/ GOGAT循環(huán)同化的。NH4+對植物GS基因表達(dá)的調(diào)節(jié)會因為植物種類、NH4+濃度及器官的不同而不同。有研究表明，外源的NH4+可以提高水稻的GS 活性[37]，而在菜豆植物體及根瘤的GS活性則會隨著外界NH4+濃度的增加而降低[38]。本試驗中，GS酶活性隨著外界NH4+的增加而降低，抑制了NH4+同化過程，外源添加蔗糖可以提高GS酶活性，在一定程度上緩解了NH4+脅迫對氮代謝的抑制。GDH是連接碳、氮代謝的關(guān)鍵酶，現(xiàn)在認(rèn)為GDH在解除氨毒過程中起主要作用[39]。在本研究結(jié)果中，和在高NH4+脅迫下GDH酶活性高于Col-0，可能是因為和在高NH4+處理下受到的抑制更大，此時GDH酶活性提高可以在一定程度上緩解NH4+毒害。外源添加蔗糖可以增加植株體內(nèi)的GDH酶活性，猜測外源蔗糖通過提高植株的GDH酶活性，來緩解高NH4+毒害，減少游離NH4+含量，從而提高植株對N的利用率。

NH4+的吸收會影響到其他陽離子的吸收，因此，高NH4+脅迫對植物的毒害癥狀還有可能和植物體內(nèi)的礦質(zhì)元素旳不足相關(guān)。有研究表明，供應(yīng)NH4+-N會顯著改善缺鐵植物的鐵營養(yǎng)[40]。氮素形態(tài)、供應(yīng)量及時間影響作物對土壤中鉀的固定與釋放，以及對鉀的吸收、轉(zhuǎn)運、循環(huán)和重新利用[41]。Zacheo等[42]研究認(rèn)為，NH4+能夠促進(jìn)向日葵根際的Ca2+的移動，當(dāng)然也可能與陰離子的吸收有關(guān)；與NO– 3-N的處理相比，NH4+-N培養(yǎng)的植株中的P含量較高，NH4+可能促進(jìn)植物P元素的吸收[43]。陳沂嶺等[44]研究發(fā)現(xiàn)NH4+增加了水稻地上部P和Fe含量。本研究結(jié)果表明，高NH4+處理下，添加外源蔗糖后，擬南芥植株的 N、P、K、Ca、Mg含量都增加，其中N、P、K含量增加比較顯著，N含量增加，表明植株利用N的能力增強(qiáng)，加快植株對N的吸收利用，一定程度上緩解了高NH4+毒害。但外源添加蔗糖不能提高植株中 Fe 的含量。已有文獻(xiàn)報道[35]，高NH4+脅迫會降低植株的含K量，本文中隨著NH4+濃度的增加，含K量也隨之增加，猜測可能是因為本文測定的是植株鮮重的含K量，高NH4+降低了植株的含水量，因此植株鮮重的含K量增加。高NH4+脅迫顯著抑制了擬南芥的生長，影響了礦質(zhì)元素在植株中的含量，外源添加蔗糖可緩解高NH4+脅迫對擬南芥生長的抑制作用，并提高了各礦質(zhì)元素的含量，說明外源添加蔗糖可通過影響礦質(zhì)元素的吸收積累，維持離子之間的平衡，減輕高NH4+脅迫對擬南芥的毒害作用。

綜上所述，NH4+脅迫顯著抑制了擬南芥植株的生長，外源添加蔗糖可以緩解高NH4+脅迫的抑制，這可能是由于外源蔗糖可以提高植株體內(nèi)碳水化合物的含量，維持細(xì)胞內(nèi)滲透壓平衡，從而提高植株的抗逆性；另外，外源蔗糖處理提高了GS和GDH的酶活性，加速氨同化作用，減少植株體內(nèi)游離NH4+含量；外源添加蔗糖處理還可以通過對礦質(zhì)元素的吸收積累，減輕高NH4+脅迫對擬南芥的毒害作用。

[1] 宋建民, 田紀(jì)春. 植物光合碳和氮代謝之間的關(guān)系及其調(diào)節(jié)[J]. 植物生理學(xué)通訊, 1998, 34(3): 230–238.

[2] 隋方功, 呂銀燕, 稻永醇二. 氮素營養(yǎng)對甜椒果實生長發(fā)育的影響[J]. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報, 2004, 10(5): 499– 503.

[3] 崔秀敏, 王秀峰. 基質(zhì)供水狀況對番茄穴盤苗碳氮代謝及生長發(fā)育的影響[J]. 園藝學(xué)報, 2004, 31(4): 477–481.

[4] 隋方功, 呂銀燕, 王運華, 等. 不同施氮量對甜椒碳、氮營養(yǎng)分配的影響[J]. 園藝學(xué)報, 2004, 31(4): 472–476.

[5] 李寶珍, 范曉榮, 徐國華. 植物吸收利用銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的分子調(diào)控[J]. 植物生理學(xué)通訊, 2009(1): 80–88.

[6] 陳琪, 劉之廣, 張民, 等. 包膜磷酸二銨配施黃腐酸提高小麥產(chǎn)量及土壤養(yǎng)分供應(yīng)強(qiáng)度[J]. 土壤學(xué)報, 2018, 55(6): 1472–1484.

[7] Serna M D, Borras R, Legaz F, et al. The influence of nitrogen concentration and ammonium/nitrate ratio on N-uptake, mineral composition and yield of citrus[J]. Plant and Soil, 1992, 147(1): 13–23.

[8] Harada T, Takaki H, Yamada Y. Effect of nitrogen sources on the chemical components in young plants[J]. Soil Science and Plant Nutrition, 1968, 14(2): 47–55.

[9] Kusano M, Tabuchi M, Fukushima A, et al. Metabolomics data reveal a crucial role of cytosolic glutamine synthetase 1;1 in coordinating metabolic balance in rice[J]. The Plant Journal, 2011, 66(3): 456–466.

[10] Guan M, M?ller I S, Schjoerring J K. Two cytosolic glutamine synthetase isoforms play specific roles for seed germination and seed yield structure in Arabidopsis[J]. Journal of Experimental Botany, 2015, 66(1): 203–212.

[11] Ho S L, Chao Y C, Tong W F, et al. Sugar coordinately and differentially regulates growth- and stress-related gene expression via a complex signal transduction network and multiple control mechanisms[J]. Plant Physiology, 2001, 125(2): 877–890.

[12] 楊少華, 王麗, 穆春, 等. 蔗糖調(diào)節(jié)擬南芥花青素的生物合成[J]. 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報, 2011, 27(4): 364–369.

[13] Cao Y Y, Yang M T, Chen S Y, et al. Exogenous sucrose influences antioxidant enzyme activities and reduces lipid peroxidation in water-stressed cucumber leaves[J]. Biologia Plantarum, 2015, 59(1): 147–153.

[14] Vincentz M, Moureaux T, Leydecker M T, et al. Regulation of nitrate and nitrite reductase expression in Nicotiana plumbaginifolia leaves by nitrogen and carbon metabolites[J]. The Plant Journal, 1993, 3(2): 315–324.

[15] Morcuende R, Krapp A, Hurry V, et al. Sucrose-feeding leads to increased rates of nitrate assimilation, increased rates of α-oxoglutarate synthesis, and increased synthesis of a wide spectrum of amino acids in tobacco leaves[J]. Planta, 1998, 206(3): 394–409.

[16] 閆素芳, 于洋, 葛青, 等. 外源蔗糖對小麥幼苗耐鹽性的影響[J]. 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2012, 20(2): 225–230.

[17] 劉麗萍, 臧小云, 袁巧云, 等. 外源蔗糖對鹽脅迫蕎麥幼苗根系生長的緩解效應(yīng)[J]. 植物生理學(xué)通訊, 2006(5): 847–850.

[18] 劉峰, 施衛(wèi)明. 擬南芥室內(nèi)水培方法的改進(jìn)[J]. 土壤, 2006, 38(1): 102–105.

[19] Yuan L X, Loqué D, Ye F H, et al. Nitrogen-dependent posttranscriptional regulation of the ammonium transporter AtAMT1;1[J]. Plant Physiology, 2007, 143(2): 732–744.

[20] Takakura K I, Nishio T. Safer DNA extraction from plant tissues using sucrose buffer and glass fiber filter[J]. Journal of Plant Research, 2012, 125(6): 805–807.

[21] Smith D S, Maxwell P W, de Boer S H. Comparison of several methods for the extraction of DNA from potatoes and potato-derived products[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53(26): 9848–9859.

[22] 李合生. 植物生理生化實驗原理與技術(shù)[M]. 北京: 高等教育出版社, 2010.

[23] 魯如坤. 土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)科技出版社, 2000.

[24] Migge A, Carrayol E, Kunz C, et al. The expression of the tobacco genes encoding plastidic glutamine synthetase or ferredoxin-dependent glutamate synthase does not depend on the rate of nitrate reduction, and is unaffected by suppression of photorespiration[J]. Journal of Experimental Botany, 1997, 48(6): 1175–1184.

[25] 程誼, 張金波, 蔡祖聰. 氣候-土壤-作物之間氮形態(tài)契合在氮肥管理中的關(guān)鍵作用[J]. 土壤學(xué)報, 2019, 56(3): 507–515.

[26] 孫海軍, 閔炬, 施衛(wèi)明, 等. 硝化抑制劑影響小麥產(chǎn)量、N2O與NH3排放的研究[J]. 土壤, 2017, 49(5): 876–881.

[27] Guo S, Bruck H, Sattelmacher B. Effects of supplied nitrogen form on growth and water uptake of Frenchbean (L) plants[J]. Plant and soil, 2002, 219: 267-275.

[28] 李春順. 高銨脅迫對小麥幼苗生長的影響及其生理基礎(chǔ)[D]. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2013.

[29] Cruz C, Bio A F M, Domínguez-Valdivia M D, et al. How does glutamine synthetase activity determine plant tolerance to ammonium?[J]. Planta, 2006, 223(5): 1068– 1080.

[30] Ni L Y. Growth of potamogeton maackianus under low-light stress in eutrophic water[J]. Journal of Freshwater Ecology, 2001, 16(2): 249–256.

[31] 李保海, 施衛(wèi)明. 擬南芥幼苗對高NH4+響應(yīng)的特征及不同生態(tài)型間的差異[J]. 土壤學(xué)報, 2007, 44(3): 508–515.

[32] Raab T K, Terry N. Nitrogen source regulation of growth and photosynthesis inL[J]. Plant Physiology, 1994, 105(4): 1159–1166.

[33] 羅金葵, 陳巍, 張攀偉, 等. 增銨對小白菜生長和葉綠素含量的影響[J]. 土壤學(xué)報, 2005, 42(4): 614–618.

[34] 匡藝, 李廷軒, 余海英. 氮素對不同氮效率小黑麥基因型葉片保護(hù)酶活性和膜脂過氧化的影響[J]. 草業(yè)學(xué)報, 2011, 20(6): 93–100.BB

[35] 常麗麗, 廖宗文, 陳日遠(yuǎn), 等. 外源蔗糖對NO– 3脅迫下葉用萵苣碳氮代謝的影響[J]. 北方園藝, 2016(1): 10–15.

[36] Miflin B J, Lea P J. Ammonia assimilation[M]//Amino Acids and Derivatives. Amsterdam: Elsevier, 1980: 169– 202.

[37] Hayakawa T, Kamachi K, Oikawa M, et al. Response of glutamine synthetase and glutamate synthase isoforms to nitrogen sources in rice cell cultures[J]. Plant and Cell Physiology, 1990, 31(8): 1071-1077.

[38] Chen W J. Expression of glutamine synthetase genes fromL. in transgenic plants[D]. PhD Thesis of Imperial College of Science and Technology, University of London, 1990.

[39] Melo-Oliveira R, Oliveira I C, Coruzzi G M. Arabidopsis mutant analysis and gene regulation define a nonredundant role for glutamate dehydrogenase in nitrogen assimila-tion[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1996, 93(10): 4718–4723.

[40] 鄒春琴, 范曉云, 石榮麗. 銨態(tài)氮和硝態(tài)氮對旱稻、水稻生長及鐵營養(yǎng)狀況的影響[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2007, 12(4): 45-49.

[41] Zhang F S, Niu J F, Zhang W F, et al. Potassium nutrition of crops under varied regimes of nitrogen supply[J]. Plant and Soil, 2010, 335(1/2): 21–34.

[42] Zaccheo P, Crippa L, di Muzio Pasta V. Ammonium nutrition as a strategy for cadmium mobilisation in the rhizosphere of sunflower[J]. Plant and Soil, 2007, 301(1/2): 325.

[43] Schittenhelm S, Menge-Hartmann U. Yield formation and plant metabolism of spring barley in response to locally injected ammonium[J]. Journal of Agronomy and Crop Science, 2006, 192(6): 434–444.

[44] 陳沂嶺, 趙學(xué)強(qiáng), 張玲玉, 等. 銨硝營養(yǎng)對水稻氮效率和礦質(zhì)養(yǎng)分吸收的影響[J]. 土壤, 2019, 51(2): 243– 250.

Effect of Exogenous Sucrose on Nitrogen and Carbon Metabolism ofUnder High NH4+Stress UsingandMutants

LI Yi1,2, YANG Shunying1, HAO Dongli1, SU Yanhua1*

(1 State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China; 2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

wild type Col-0, glutamine synthetase knockout mutantsandwere used as experimental materials, pot experiments were conducted to compare the effects of normal culture solution (4 mmol/L NH4+) (CK), the normal culture solution (4 mmol/L NH4+) plus additional 5% sucrose (T1), high NH4+stress (20 mmol/L) (T2), and high NH4+stress plus additional 5% sucrose (T3) on physiological indexes of the threelines. By measuring the fresh weight of the aerial part, chlorophyll, free NH4+, soluble sugar, soluble protein, glutamine synthetase (GS), glutamate dehydrogenase (GDH), and mineral element contents, the effects of exogenous sucrose on carbon and nitrogen metabolism inunder high NH4+stress were preliminarily studied. The results demonstrated thatgrowth was severely inhibited under high NH4+stress. The fresh weight, the activities of GS and GDH decreased, while the contents of free NH4+, chlorophyll, soluble sugar and soluble protein increased, the contents of N, P, K and Ca in the plant increased, and the contents of Mg and Fe decreased.The inhibitory effects ofandmutants under high NH4+were more significant than the wild type.Exogenous addition of 5% sucrose significantly alleviated high NH4+toxicity, with increased soluble sugar and protein contents, and enhanced the activities of GS and GDH. The contents of chlorophyll and free NH4+were reduced. The contents of N, P, K, Ca and Mg in the plant were increased while the content of Fe was reduced. The exogenous sucrose is more significant in alleviation of high NH4+toxicity ofandthan the wild type.

Sucrose; High NH4+stress;;Carbon metabolism; Nitrogen metabolism

Q945.1

A

10.13758/j.cnki.tr.2021.01.004

李祎, 楊順瑛, 郝東利, 等. 利用和突變體研究外源蔗糖對高銨脅迫擬南芥碳氮代謝的影響. 土壤, 2021, 53(1): 21–29.

國家重點研發(fā)計劃項目(2017YFD0200100，2017YFD0200103)和中國科學(xué)院南京土壤研究所“一三五”計劃和領(lǐng)域前沿項目( ISSASIP1609)資助。

(yhsu@issas.ac.cn)

李祎(1988—)，女，江蘇揚(yáng)州人，博士研究生，主要從事植物銨吸收同化的分子機(jī)制及調(diào)控研究。E-mail: liyi@issas.ac.cn