王 瑞，韋孜娜，呂 敏，楊彥豪，黃黎明，韋秀穎，盧天和，黃光華，楊慧贊*

紅螯螯蝦()卵黃蛋白原未知功能結構域(DUF1943)的原核表達及純化鑒定

王 瑞1，韋孜娜1，呂 敏1，楊彥豪1，黃黎明1，韋秀穎2，盧天和1，黃光華1，楊慧贊1*

(1. 廣西壯族自治區(qū)水產科學研究院，南寧 530021; 2. 廣西大學動物科學技術學院，南寧 530005)

通過外源表達并純化得到紅螯螯蝦()卵黃蛋白原(Vitellogenin,Vg)的DUF1943結構域片段，為開展其后續(xù)相關功能及機制研究奠定基礎。根據GenBank數(shù)據庫中公布的紅螯螯蝦卵基因序列(登錄號AF306784.1)，查找到DUF1943結構域的氨基酸序列(617—918aa)，對其理化性質與基本結構等進行了理論評估，結合大腸桿菌密碼子偏好對其進行了序列改造和密碼子優(yōu)化，采用全基因合成的方法得到了的基因片段，將其連接到Pet28a(+)內構建了Pet28a(+)-的融合表達載體，探索了該融合載體在大腸桿菌系統(tǒng)中的最佳表達參數(shù)，采用溶解法和上柱層析法對收獲到的蛋白包涵體進行復性。全基因合成方法制備得到的目的基因為921 bp，成功構建了Pet28a(+)-的融合表達載體，誘導Pet28a(+)-表達的最佳條件為：當單克隆菌液OD600達到0.6 時，添加0.5 mmol·L-1的誘導劑IPTG，置于37 ℃條件下培養(yǎng)4 h。表達的DUF1943多肽以包涵體形式為主，在SDS-PAGE膠的35 kDa附近呈現(xiàn)特異性條帶，收集包涵體進行破碎，經2 mol·L-1鹽酸胍溶解和Ni-NTA層析后最終收獲到的活性蛋白濃度為0.6 mg·mL-1。成功構建了Pet28a(+)-原核表達載體并優(yōu)化了表達系統(tǒng)及蛋白復性方案，獲得了DUF1943活性多肽，為進一步研究其生物功能及應用奠定了基礎。

卵黃蛋白原；基因；原核表達；純化；復性

卵黃發(fā)生是指各種卵黃物質的形成及其在卵母細胞中的積累，是卵母細胞發(fā)育成熟的必要前提，也是雌性甲殼動物生殖周期的決定性時期[1]。卵黃是由母體供應的，含有多種營養(yǎng)性物質成分，為蝦類正在發(fā)育的早期胚胎和幼體提供所必需的能量物質。因此，卵黃的產生對于蝦類的早期生長發(fā)育有著關鍵性的作用。Abdu等[2]分別提純和鑒定了斑節(jié)對蝦()、中國對蝦()和羅氏沼蝦()的卵黃蛋白（yolk protein），均為一種雌性的高密度脂蛋白(HDL)。Oberd?rste證明了卵黃蛋白是胚胎發(fā)育的營養(yǎng)源[3]。

卵黃蛋白原(vitellogenin，Vg)是卵黃蛋白的前體，最初是Pan等[4]用于描述雌性昆蟲血液中一種特殊淋巴蛋白，后來逐漸成為一些魚類、禽類等性成熟的雌性脊椎動物的特異性血清蛋白的代名詞[5-8]。卵生動物在雌激素誘導作用下，于卵巢以外的不同組織中(如海膽體腔細胞；魚類、鳥類肝臟；甲殼動物濾泡細胞等)表達和合成卵黃蛋白原，經循環(huán)系統(tǒng)分泌運送到卵巢組織，在受體介導的內吞作用進入卵細胞，準確地表達了卵細胞的正常發(fā)育，為早期發(fā)育的胚胎組織提供了所需的脂肪、氨基酸、碳水化合物、磷和硫、維生素等功能性營養(yǎng)物質，促進卵細胞的生長分化[9-14]。對卵黃蛋白原的結構研究表明，卵黃原蛋白編碼的3個結構域，它們分別是位于N端功能序列的結構域(vitellogenin-N)、位于C端的蛋白成分結構域(von Willebrand factor type D domain, vWD)以及富含磷酸化的結構域(domain of unknow function, DUF1943, DUF1944)[15-16]。這些結構域的分子結構在不同物種中，具有一定的保守性[17]。紅螯螯蝦()俗稱澳洲淡水龍蝦，是水產養(yǎng)殖業(yè)極具潛力的淡水經濟蝦類之一。卵黃發(fā)生過程中，消化酶和同工酶對卵黃的水解作用使其為紅螯螯蝦胚胎發(fā)育提供了重要的結構和營養(yǎng)性物質保障。近年來，對甲殼動物消化酶和同工酶的結構及功能研究多集中在幼體和成體的發(fā)育階段[18-19]。而對于Vg的研究多集中在蛋白整體功能上，而具體針對其結構域的功能研究較少。結構決定功能，Vg蛋白結構域的差異正是其種間特異性的基礎，因此對Vg蛋白的結構域進行獨立的研究有利于更深入地認識和發(fā)現(xiàn)其功能和作用機制。

本研究根據紅螯螯蝦的Vg序列上的DUF1943結構域序列進行理論評估，結合大腸桿菌密碼子的偏好性，對目的序列進行優(yōu)化設計，采用全基因合成的方法克隆出了Vg的序列，并成功構建了Pet28a(+)-原核表達載體，誘導其在大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21(DE3)中表達，進而純化獲得DUF1943蛋白，為進一步研究DUF1943的生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌BL21(DE3)為本實驗室保存。質粒Pet28a(+)、LB肉湯瓊脂培養(yǎng)基、非預染蛋白Marker、預染蛋白Marker、非干擾型蛋白質濃度測定試劑盒、TMB顯色試劑盒、IPTG均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；DNA聚合酶、限制性內切酶、T4連接酶均購自Promega公司；其他試劑為進口或國產。

緩沖液A為pH 8.0的PBS；緩沖液B為8 mol·L-1Urea, 50 mmol·L-1Tris-HCl和300 mmol·L-1NaCl的混合液，pH 8.0；緩沖液C為50 mmol·L-1Tris，300 mmol·L-1NaCl，0.2 mmol·L-1PMSF和0.1% Triton X-100，pH 8.0；Binding buffer為50 mmol·L-1Tris，300 mmol·L-1NaCl，pH 8.0；Washing buffer為50 mmol·L-1Tris，300 mmol·L-1NaCl和20/50 mmol·L-1Imidazole，pH 8.0；Elution buffer為50 mmol·L-1Tris，300 mmol·L-1NaCl 和500 mmol·L-1Imidazole，pH 8.0。

JY88-II超聲波細胞破碎儀(天津津立儀器設備科技發(fā)展有限公司)；HZQ-F280全溫度振蕩培養(yǎng)箱(常州銳品精密儀器有限公司)；GL-21M高速冷凍離心機(湖南湘儀離心機儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 DUF1943生物信息學分析 登錄NCBI數(shù)據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ipg/?term=AF306784.1)查找到紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)基因的mRNA序列(登錄號：AF306784.1)，定位到其中DUF1943(617—918aa)結構域的基因序列，利用ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)查找序列的開放閱讀框并翻譯其編碼的氨基酸序列，將翻譯的氨基酸序利用ExPAsy數(shù)據庫(https://www.expasy.org/)的在線工具：ProtParam tool、ProtScale和InterProscan及TMHMM (http:// www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對DUF1943的親水性、信號肽、跨膜域、基本結構等生物學信息進行分析和理論評估。利用在線平臺Cell-PLoc-2 (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)選擇真核生物系統(tǒng)(Euk-mPLoc2.0)對紅螯螯蝦DUF1943編碼的蛋白進行亞細胞定位；NetPhos 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos-2.0)分析其磷酸化位點，借助SignalP 5.0在線服務器(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，選擇真核生物類型(Eukaryotes)進行蛋白常規(guī)的分泌通路(Sec/secretory)和I型信號肽酶(SPaseI)，即真核生物僅含有的Sec/SPI信號肽進行預測。最后，采用在線工具SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/ npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)分析蛋白的二級結構。

1.2.2 Pet28a(+) -重組表達載體的構建

根據序列的評估結果以及大腸桿菌的密碼子偏好性，利用在線分析系統(tǒng)OPTIMIZER (http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/")和DNA Works (https://hpcwebapps.cit.nih.gov/dnaworks/)對(617—918aa)序列進行密碼子優(yōu)化和序列改造，設計出目的片段的全基因合成方案委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。全基因合成的策略是將優(yōu)化后的目的片段分割成42段帶有重疊序列的寡核苷酸片段(即Oligos引物，其外側首尾引物分別為：F: 5′-GACACAAATACTCTC-3′；R: 5′- GTGTCTTACGG-3′,下劃線是H I和l的酶切位點)，先將合成的42段寡核苷酸混合到一個體系中，通過第1輪PCR反應中多個熱循環(huán)和退火實現(xiàn)目的片段的全長序列拼接，再利用首尾引物，通過第2輪PCR進一步擴增和富集全長目的基因。PCR反應采用的是高溫聚合酶，第一輪重疊延伸PCR反應體系為50 μL：42對引物mix 0.5 μL×42，共22.0 μL(引物濃度為1 OD溶于400 μL ddH2O)，dNTP(25 mmol·L-1)1.0 μL，10×Buffer 5.0 μL，0.4 μL(5 U·μL-1)，補充ddH2O至50 μL。PCR反應程序為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性22 s，50 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，20循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。以第1輪PCR產物為模板進行第2輪PCR擴增，反應體系為50 μL：首尾引物各2 μL(引物濃度同上)，第1輪PCR產物1.0 μL，dNTP(25 mmol·L-1)1.0 μL，10×Buffer 5.0 μL，0.4 μL(5 U·μL-1)，補充ddH2O至50 μL。PCR反應程序為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性22 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸60 s，24個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。對最后一輪PCR產物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測并對特異性條帶進行純化回收。

選取pET28a作為表達載體，根據引物設計的酶切位點，利用H I和l對PCR反應后純化回收得到的目的片段和質粒載體Pet28a(+)分別進行雙酶切。酶切體系為50 μL：純化的目的片段1.0 μg, 10×FD buffer 5.0 μL,H I 1.0 μL(10 U·μL-1)，l 1.0 μL(10 U·μL-1), 補充ddH2O至50 μL。載體Pet28a(+)的酶切體系為50 μL：Pet28a(+) 1.0 μg, 10×FD buffer 5.0 μL,H I1.0 μL(10 U·μL-1),l 1.0 μL(10 U·μL-1)補充ddH2O 至50 μL。將上述兩個體系分別放入37 ℃恒溫水浴鍋中反應2 h。對酶切產物分別進行電泳檢測，并對目的產物進行純化回收。

將酶切后純化回收的目的基因片段和Pet28a(+)載體進行連接，連接體系為20 μL：目的片段的酶切產物8 μL，載體Pet28a(+)的酶切產物 4 μL，10×T4 DNA ligase buffer 2.0 μL，T4 DNAigase 1 μL (5 U·μL-1)，補充ddH2O 至20 μL。將上述連接混合液放入16 ℃的PCR儀內反應1 h以上，轉入Top10感受態(tài)細胞內，均勻涂布到含有卡拉霉素的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜，篩選出陽性克隆，提取質粒，再次進行酶切驗證，反應體系為：質粒100 ng，10×FD buffer 1.0 μL，H I 1.0 μL(10 U·μL-1),l 1.0 μL(10 U·μL-1), 補充ddH2O 至10 μL，置于37 ℃恒溫水浴鍋中消化2 h。取5.0 μL消化產物進行電泳分析。經電泳分析正確后，將陽性克隆接種到含卡拉霉素的LB肉湯中，250 r·min-1，培養(yǎng)過夜，菌液送往北京華大(BGI)公司測序分析。測序采用的引物是Pet28a(+)載體上的T7啟動子和終止子的通用引物序列(上游測序引物為：5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′，下游測序引物為：5′- GCTAGTTATTGCTCAGCGGG-3′)。

1.2.3 DUF1943蛋白的誘導表達 經電泳和測序驗證后，將構建成功的重組質粒命名為 Pet28a(+)-，挑取陽性克隆轉入到大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21(λDE3)，熱激后涂布在含有卡拉霉素的LB平板上37 ℃培養(yǎng)過夜；挑取單克隆菌落接種到含有卡拉霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃進行活化培養(yǎng)；當菌液OD600達到 0.6 時，添加一定濃度的誘導劑IPTG，分別于16 ℃以及20 ℃條件下培養(yǎng)16 h，37 ℃條件下培養(yǎng)4 h，設置未添加誘導劑的為陰性對照；取菌液經12 000 r·min-1離心5 min，棄上清，收集菌體沉淀；向其中加入PBS(pH 7.4)使其懸浮，利用超聲破碎儀使其充分溶解，離心，棄上清，向沉淀中加入緩沖液A(8 mol·L-1Urea, 50 mmol·L-1Tris-HCl, 300 mmol·L-1NaCl, pH 8.0)進行溶解，再次離心，向上清和沉淀中分別加入等體積的2×Loading buffer煮沸，上樣，進行10% SDS-PAGE電泳，由考馬斯亮藍(R250)染色的深淺程度來來確定蛋白表達情況，進而確定誘導表達所需的最佳的IPTG濃度、誘導溫度以及誘導時間。最后，以最佳的誘導條件進行大量表達，菌液在4 ℃下經3 000 r·min-1離心10 min后，收集菌體沉淀。

1.2.4 DUF1943重組蛋白的純化 向收集到的菌體中加入緩沖液B(8 mol·L-1Urea，50 mmol·L-1Tris，300 mmol·L-1NaCl，0.1% Triton X-100，pH 8.0) 4 ℃靜置30 min，置于冰上進行200 W的多次間歇性超聲破碎，見菌液澄清后，再行4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min，收集上清粗蛋白(包涵體)，加入2 mol·L-1的鹽酸胍對其進行溶解，接著取 5 mL 的Ni-NTA柱子，用5倍柱床體積的 Binding buffer 清洗平衡柱子，流速 5 mL·min-1；將粗蛋白與平衡后的柱填料孵育1 h；將孵育后的產物上柱進行提純和復性，收集流出；首先用Binding buffer 清洗平衡柱子；接著用Washing buffer 洗柱子，并收集流出液；最后用Elution buffer 再次洗脫，收集流出液，對粗蛋白、洗雜流出液、洗脫流出液分別處理，進行10% SDS-PAGE和R250染色分析。將純度較好的6個組分分別加入到緩沖液C(50 mmol·L-1Tris，300 mmol·L-1NaCl，0.1% SKL，pH 8.5)進行透析，透析結束后用PEG20000濃縮，0.45 μm濾膜過濾后分裝為1 mL·tube-1，–80 ℃保存。

1.2.5 DUF1943蛋白的鑒定 對復性且純化后的目的蛋白進行制樣，經SDS-PAGE電泳后，在200 mA恒定電流及低溫條件下磚模(PVDF) 2 h，再用5% 脫脂奶粉的TBST封閉2 h后，將兔抗His-Tag單抗進行1 : 2 000稀釋，HRP標記的羊抗兔IgG抗體進行1 : 5 000稀釋，常溫下孵育過夜，洗膜3次，將TMB顯色液滴加到PVDF膜上進行顯色，拍照分析，進行Western Blot特異性驗證。最后，采用非干擾型蛋白定量試劑盒測定最終純化產物的濃度。

2 結果與分析

2.1 DUF1943結構域的生物學信息

2.1.1 DUF1943結構域的基本理化性質 DUF1943結構域的的相對分子質量W為37 445.7，理論等電點pI為6.85，負電荷殘基(Asp+Glu)總數(shù)為36，正電荷殘基(Arg+Lys)總數(shù)為31，說明DUF1943結構域為帶正電的蛋白。蛋白共計5 201個原子，分子式為: C1673H2562N454O498S14，不穩(wěn)定系數(shù)為37.57，小于40，表明DUF1943結構域為穩(wěn)定型蛋白。

圖1 DUF1943蛋白的疏水性分析

Figure 1 Analysis of the hydrophobicity of DUF1943 protein

圖2 DUF1943蛋白跨膜區(qū)預測分析

Figure 2 Prediction and analysis of transmembrane region of DUF1943 protein

2.1.2 DUF1943蛋白疏水性及跨膜區(qū)分析基因編碼蛋白由336個氨基酸組成，其脂肪指數(shù)為76.37，親水性平均值(grand average of hydropathicity, GRAVY)為- 0.285，結合Protscale的在線評估表明：序列中含有較多的親水性氨基酸，親水性區(qū)段主要為：1～9、11～22、29～40、52～61、70～82、91～99、102～121、122～132、151～163、172～180、190～193、210～220、222～231、238～245、255～260、262～282和289～302(圖1)，序列親水性較好。疏水性氨基酸Ala、Cys、Ile、Leu、Met、Phe和Val分別占編碼的1.80%、2.50%、4.50%、3.80%、1.90%、2.80%和4.20%。跨膜區(qū)分析結果顯示(圖2)，DUF1943蛋白無典型的跨膜區(qū)，DUF1943蛋白的302個氨基酸均位于細胞膜表面，降低了跨膜區(qū)疏水性氨基酸對蛋白折疊的影響，易于表達和純化。

2.1.3 DUF1943蛋白的抗原性分析 采用Protean模塊中的的Jameson-Wolf方法結合預測DUF1943蛋白的抗原指數(shù)，發(fā)現(xiàn)DUF1943蛋白序列具有豐富且分布均勻的抗原表位位點，其中抗原指數(shù)較高的區(qū)段為：1～9、70～88、90～115、122～135、171～182、188～217、223～229、238～245、262～280和288～299(圖3)，并且這些區(qū)段具有強的表面可及性和親水性位點，因此利用該蛋白制備抗體具有較強的可行性。

圖3 DUF1943蛋白的抗原性分析

Figure 3 Antigenicity analysis of DUF1943 protein

M: 10 kb DNA Marker; S: DUF1943基因的PCR產物。

Figure 4 PCR amplification ofgene

M: 10 kb DNA Marker; 1: pET-28a-雙酶切產物。

圖5重組質粒的雙酶切鑒定

Figure 5 Double enzyme digestion identification of pET- 28a-

2.2 pET28a-DUF1943重組表達載體的鑒定

全基因合成所得的PCR產物經1.2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示在1 000 bp附近出現(xiàn)了特異性的目的條帶，符合基因序列的預期大小(圖4)。將合成的基因，連接到載體Pet28a(+)上，得到的重組質粒，經H I和l雙酶切后，電泳檢測結果顯示如(圖5)所示，酶切產物為兩條大小約為5 300 bp和1 000 bp的片段，其條帶大小與Pet28a(+)和基因的實際大小一致，初步斷定目的基因已成功接入載體，Pet28a(+)-重組質粒構建成功。

M：Protein Marker；1：誘導前總蛋白；2：20 ℃上清；3：20 ℃沉淀；4：37 ℃上清；5：37 ℃沉淀。

Figure 6 Expression of the DUF1943 protein in

M: Protein Marker;1:上樣；2：流出；3和4：20 mmol·L-1 Imidazole 洗脫組分；5和6：50 mmol·L-1 Imidazole 洗脫組分；7：500 mmol·L-1 Imidazole 洗脫組分。

Figure 7 SDS-PAGE analysis of the purified products by fusion protein nickel agarose affinity chromatography

對篩選出的陽性克隆進行增菌培育，菌液經測序分析，結果與NCBI上公布的紅螯螯蝦的Vitellogenin:AAG17936.1的相似性(identity)為100%，說明本次全基因合成并克隆轉化所得的序列就是紅螯螯蝦Vg上的序列片段?？梢源_認Pet28a(+)-重組質粒構建成功。

2.3 DUF1943蛋白的表達鑒定

將重組質粒Pet28a(+)-轉化大腸桿菌B21感受態(tài)細胞后,經IPTG誘導，進行SDS-PAGE電泳。結果(圖6)顯示，泳道5與其他泳道相比，出現(xiàn)了一條大小約35 kDa的特異性蛋白條帶，大小與目的蛋白(37.4 kDa)預期一致。說明重組蛋白Pet28a(+)-在菌體內主要以包涵體的形式表達，且誘導其表達的最佳條件為：37 ℃培養(yǎng)4 h。

2.4 DUF1943蛋白的分離及純化

將超聲破菌、重懸后進行SDS-PAGE電泳檢測，結果(圖7)顯示，各泳道在35 kDa附近都出現(xiàn)了一條明顯的特異性條帶，其大小與目的蛋白(37.4 kDa)一致。泳道3、4、5、6和7是采用不同濃度的洗脫液進一步純化后的產物，與泳道1、2所示的未經洗脫的粗蛋白條帶相比，條帶更清晰，雜帶更少。其中又以第5泳道的條帶最清晰，純度最高，說明50 mmol·L-1Imidazole為最佳的洗脫條件。

M: Protein Marker (Cat..No.C600525); 1: Pet28a(+)-純化產物。

圖8 純化產物SDS-PAGE分析

Figure 8 SDS-PAGE analysis of the purified products

M：Protein Marker;1:融合目的蛋白。

Figure 9 Analysis of expressed recombinant DUF1943 by Western Blot

表1 Pet28a(+)-DUF1943蛋白濃度測定

注：待測樣品體積為10 μL。

2.5 DUF1943蛋白的驗證

收集最佳條件下大量表達的重組蛋白Pet28a(+)-，采用50 mmol·L-1的Imidazole洗脫液層析，得到的最終純化產物經SDS-PAGE電泳分析。結果(圖8)顯示，在35 kDa附近出現(xiàn)一條清晰的目的條帶，大小與預期結果一致?？纱_定純化得到的即為目的蛋白。

為進一步驗證最終純化所得目的蛋白的特異性，對其進行Western Blot試驗，并采用TMB進行顯色，同樣在35 kDa附近的相應位置出現(xiàn)了明顯的特異性條帶，再次表明該蛋白為目的蛋白（圖9）。

圖10 BSA標準曲線

Figure 10 The standard curve of BSA

2.6 DUF1943蛋白濃度鑒定

采用非干擾型蛋白定量試劑盒測定最終純化蛋白的濃度，結果如表1和圖10所示。將表1所測定的融合蛋白OD值代入標準曲線所得的回歸方程，計算出融合蛋白Pet28a(+)-的濃度為0.60 mg·mL-1。

3 討論與結論

研究發(fā)現(xiàn)卵黃蛋白原的DUF1943、DUF1944和VWD結構域都能夠與革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌結合，并能與其表面的病原相關分子模式LTA和LPS相結合[20]。Sun等研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚的Vg2具有明顯的抑菌作用，但是其DUF1943、DUF1944 和VWD結構域卻不能夠直接抑制細菌生長，而是作為模式識別受體與病原的相關分子模式相結合[21]。吳彪的研究發(fā)現(xiàn)蝦夷扇貝的DUF1943能結合大腸桿菌和金黃色葡萄球菌及其表面的LTA和LPS，但是不能抑制細菌的生長，同樣證明DUF1943作為模式識別受體發(fā)揮免疫學功能[22]。本研究先對紅螯螯蝦的進行了生信分析，重點評估了其編碼肽段的抗原性進行了分析，發(fā)現(xiàn)其氨基酸序列區(qū)段具有較強的表面可及性以及較多的親水性位點，表明DUF1943結構域可以作為一種高效的免疫原。而紅螯螯蝦DUF1943是否具有相應的免疫學作用，還需進一步的探研。制備DUF1943肽段正是為后續(xù)開展其相關功能及機制研究奠定基礎。

用原核表達系統(tǒng)制備DUF1943結構域肽段的第一步，也是最關鍵的一步是目的基因的合成。重疊區(qū)擴增法（PCR-based accurate synthesis, PAS）僅需要2個步驟就能精準合成出在大腸桿菌宿主體內高效表達的目的基因，其錯配率≤1/1 000 bp，適用于GC含量高，重復序列和二結構復雜的基因序列合成[23]。該方法首先通過對目的基因序列的理論評估，再根據大腸桿菌密碼子的兼并性和偏好性，對序列中的大腸桿菌使用頻率低的密碼子和稀有密碼子進行改造，使基因編碼序列更符合大腸桿菌的密碼子偏好。優(yōu)化G+C的含量，添加或刪除限制性內切酶位點，改變RNA二級結構，設計出優(yōu)化的目的基因序列，對序列進行拆分，最終利用重疊區(qū)PCR擴增得到目的基因。高見等根據大腸桿菌偏愛密碼子，利用Synthetic Gene Designer軟件對L2E7全基因進行密碼子優(yōu)化,誘導其在大腸桿菌pET9a體內高效表達，目的蛋白占全菌的60%左右[24]。夏曉玲等根據大腸桿菌密碼子偏好，利用GenScript rare codon analysis軟件對十二指腸基因進行密碼子優(yōu)化，通過全基因合成方法合成的目的基因在大腸桿菌體內獲得了較高的表達，且以可溶形式存在[25]。本研究先對紅螯螯蝦序列進行理論評估，根據大腸桿菌的密碼子偏好，對紅螯螯蝦野生型序列進行的改造和優(yōu)化，探索了誘導大腸桿菌表達DUF1943多肽的最優(yōu)條件，最終獲得了高效的DUF1943多肽以包涵體形式存在。包涵體經2 mol·L-1的鹽酸胍溶解，Ni-NTA層析柱純化及復性，最后透析去除變性劑，促進多肽折疊，恢復其活性。這是首次采用全基因合成方法對紅螯螯蝦Vg的DUF1943結構域進行高效的異源表達。

本研究利用全基因合成的方法合成了DUF1943結構域的片段序列，成功構建了Pet28a（+）-融合表達載體，探明了誘導大腸桿菌高效表達DUF1943多肽的最佳條件為：當單克隆菌液OD600達0.6時，添加0.6 mmol·L-1的誘導劑IPTG，置于37 ℃條件下培養(yǎng)4 h，蛋白的表達量最高。表達獲得的DUF1943多肽以包涵體形式為主，經純化和復性最終得到高純度活性DUF1943多肽，為后續(xù)開展其具體生物學功能及實際應用奠定了基礎。

[1] 蔡生力, 劉紅.十足目甲殼動物卵黃蛋白原的生化特性及生物合成[J]. 水產學報, 2017, 41(1): 150-158.

[2] ABDU U, YEHEZKEL G, SAGI A. Oocyte development and polypeptide dynamics during ovarian maturation in the red-claw crayfish[J]. Invertebr Reprod Dev, 2000, 37(1): 75-83.

[3] OBERD?RSTER E, RICE C D, IRWIN L K. Purification of vitellin from grass shrimp, generation of monoclonal antibodies, and validation for the detection of lipovitellin in Crustacea[J]. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol, 2000, 127(2): 199-207.

[4] PAN M L, BELL W J, TELFER W H. Vitellogenic blood protein synthesis by insect fat body[J]. Science, 1969, 165(3891): 393-394.

[5] URIST M R, SCHJEIDE A O. The partition of calcium and protein in the blood of oviparous vertebrates during estrus[J]. J Gen Physiol, 1961, 44: 743-756.

[6] RIDGWAY U. A serological detected serum factor associated with maturity in English sole,, and Pacific halibut,[J]. Fish Bull - Natl Ocean Atmos Adm, 1967, 66: 47-58.

[7] BAILEY R E. The effect of estradiol on serum calcium, phosphorus, and protein of goldfish[J]. J Exp Zool, 1957, 136(3): 455-469.

[8] LASKOWSKI M. über das Vorkommen des Serumvitellins im Blute der Wirbeltiere[J]. Biochem Zbl,1936, 284：318-321.

[9] VEERANA M, KUBERA A, NGERNSIRI L. Analysis of the vitellogenin gene of rice moth,stainton[J]. Arch Insect Biochem Physiol, 2014, 87(3): 126-147.

[10] ZHAO F, MORANDIN C, JIANG K, et al. Molecular evolution of bumble bee vitellogenin and vitellogenin-like genes[J]. Ecol Evol, 2021, 11(13): 8983-8992.

[11] MAZANKO M S, MAKARENKO M S, CHISTYAKOV V A, et al. Probiotic intake increases the expression of vitellogenin genes in laying hens[J]. Probiotics Antimicrob Proteins, 2019, 11(4): 1324-1329.

[12] KANG B J, JUNG J H, LEE J M, et al. Structural and expression analyses of two vitellogenin genes in the carp,[J]. Comp Biochem Physiol Part B: Biochem Mol Biol, 2007, 148(4): 445-453.

[13] XUE R, WANG X, XU S, et al. Expression profile and localization of vitellogenin mRNA and protein during ovarian development in turbot ()[J]. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol, 2018, 226: 53-63.

[14] FINN R N, FYHN H J. Requirement for amino acids in ontogeny of fish[J]. Aquac Res, 2010, 41(5): 684-716.

[15] SUN C, HU L L, LIU S S, et al. Functional analysis of domain of unknown function (DUF) 1943, DUF1944 and von Willebrand factor type D domain (VWD) in vitellogenin2 in zebrafish[J]. Dev Comp Immunol, 2013, 41(4): 469-476.

[16] SHEN Y, CHEN Y Z, LOU Y H, et al. Vitellogenin and vitellogenin-like genes in the brown planthopper[J]. Front Physiol, 2019, 10: 1181.

[17] WATTS M, PANKHURST N W, PRYCE A, et al. Vitellogenin isolation, purification and antigenic cross-reactivity in three teleost species[J]. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol, 2003, 134(3): 467-476.

[18] 楊樹浩, 馮藝, 陳建酬, 等. 不同比例的生物飼料對羅氏沼蝦生長、消化酶和免疫酶活性的影響[J]. 飼料工業(yè), 2018, 39(2): 18-25.

[19] 羅文, 趙云龍, 姚俊杰, 等. 紅螯螯蝦胚胎發(fā)育期主要消化酶和同工酶的活性變化[J]. 動物學雜志, 2006, 41(1): 12-18.

[20] 李兆杰. 魚類卵黃蛋白原的免疫功能研究[D]. 青島: 中國海洋大學, 2009.

[21] SUN C, HU L L, LIU S S, et al. Functional analysis of domain of unknown function (DUF) 1943, DUF1944 and von Willebrand factor type D domain (VWD) in vitellogenin2 in zebrafish[J]. Dev Comp Immunol, 2013, 41(4): 469-476.

[22] 吳彪. 蝦夷扇貝卵黃蛋白原基因克隆、表達和免疫功能研究[D]. 青島: 中國海洋大學, 2014.

[23] 段桂華, 沈姍姍, 諸葛宇征. 改良重疊區(qū)擴增法構建Rac1相關質粒[J]. 生物技術通報, 2013(6): 177-182.

[24] 高見, 趙莉, 任皎, 等. 密碼子優(yōu)化的HPV16 L2E7基因在大腸桿菌中高效表達[J]. 中國醫(yī)學科學院學報, 2007, 29(5): 579-583.

[25] 夏曉玲, 俞敏, 孫煒. 十二指腸鉤蟲ASP-2基因密碼子優(yōu)化及在大腸桿菌中高效表達[J]. 南京醫(yī)科大學學報(自然科學版), 2014, 34(5): 627-633.

Prokaryotic expression and purification of the domain of unknown function of vitellogenin (DUF1943) in

WANG Rui1, WEI Zina1, LYU Min1, YANG Yanhao1, HUANG Liming1,WEI Xiuying2, LU Tianhe1, HUANG Guanghua1, YANG Huizan1

(1. Guangxi Academy of Fishery Sciences, Nanning 530021; 2. College of Animal Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530005)

The aim of this study was to obtain the domain of unknown function of vitellogenin () fromby exogenous expression and then purification, so as to provide the material basis for further research on its related function and mechanism. According to thegene sequence (Accession No. AF306784.1) ofpublished in GenBank database, thegene ofwas found. The protein sequence of DUF1943 domain (617 - 918aa) was analyzed. The physico-chemical properties and basic structure of DUF1943 were evaluated theoretically. The codon ofwas modified and optimized according to the evaluation results, combined with the codon preference of. The optimized gene fragment ofdomain was obtained by whole gene synthesis method, and then it was connected into Pet28a (+) to construct the fusion expression vector of Pet28a(+)-. The optimal expression parameters of the fusion vector insystem were explored. The protein inclusion bodies were renatured by dissolution and upper column chromatography. The results of electrophoresis and sequencing analysis showed that the optimized target gene ofwas 921 bp, and the fusion expression vector ofwas constructed successfully. The optimal induction conditions for the high expression of the fusion vector inBL21 were as follows: when the OD600of monoclone reached 0.6, 0.5 mmol·L-1IPTG was added and cultured at 37 ℃ for 4 h; the expression of DUF1943 protein was mainly in the form of inclusion bodies, which showed a specific band near 35 kDa on SDS-PAGE. The inclusion bodies were broken and collected. After dissolution with 2 mol·L-1guanidine hydrochloride and Ni-NTA chromatography, the final concentration of active protein was 0.6 mg·mL-1. The prokaryotic expression vector Pet28a(+)-was successfully constructed, the expression system and renaturation scheme were optimized, and the target protein of DUF1943 was obtained, which would lay a foundation for the further study of the biological function and application of DUF1943 domain of Vg.

;; prokaryotic expression; purification; renaturation

S966.12; Q78

A

1672-352X (2021)06-0940-07

10.13610/j.cnki.1672-352x.20220106.021

2022-1-7 7:30:57

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20220106.1254.042.html

2021-02-01

廣西科技重大專項課題(桂科AA17204095-5)，廣西自然科學基金項目(2019GXNSFAA185036)，廣西重點研發(fā)項目(桂科AB18221068)和廣西科技重大專項(桂科AA17204094-7)共同資助。

王 瑞，博士，副研究員。E-mail：raywongxx@163.com

通信作者:楊慧贊，博士，高級工程師。E-mail：yhzyang@163.com