田建華

(1.山西省林業(yè)和草原科學(xué)研究院，山西 太原 030012；2.國家林草沙棘工程技術(shù)研究中心，山西 太原 030012)

沙棘是一種藥食同源植物。沙棘果實(shí)富含天然維生素、油脂、脂肪酸、有機(jī)酸、黃酮類化合物、原花青素等多種生物活性物質(zhì)，在醫(yī)藥、化妝品和保健品等領(lǐng)域具有廣泛的用途。其中，原花青素的抗氧化活性極強(qiáng)，在人體內(nèi)抗氧化和清除自由基的能力是維生素E的50倍，維生素C的20倍，還具有保護(hù)血管、抗腫瘤及美容的作用。目前，常見的原花青素提取物多源于葡萄籽。劉朵花等研究表明，沙棘籽可能是更好的原花青素來源。張素華等分析測(cè)定表明，沙棘籽殼含有原花青素，且含量較高。目前，未見對(duì)沙棘原花青素測(cè)定方法評(píng)價(jià)的文獻(xiàn)，筆者采用原花青素測(cè)定的國標(biāo)方法，用于沙棘原花青素的測(cè)定并進(jìn)行方法學(xué)考察，旨在確定適用于沙棘原花青素含量的測(cè)定方法，為建立和完善沙棘原花青素的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系提供可靠的方法和試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與儀器

試驗(yàn)材料包括沙棘籽(購自山西省某沙棘飲料廠)、原花青素標(biāo)準(zhǔn)品(成都曼斯特生物科技有限公司)、HPLC≥95%(成都曼斯特生物科技有限公司)、甲醇、正丁醇、鹽酸、硫酸鐵銨。

試驗(yàn)儀器有JYL-C020E粉碎機(jī)(九陽股份有限公司)、Explorer pro分析天平(奧豪斯儀器有限公司)、SCIENTZ-12N冷凍干燥機(jī)(寧波新芝生物科技有限公司)、HH數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國宇儀器制造有限公司)、KQ-200VD型雙頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、UV3100PC紫外-可見分光光度計(jì)(美普達(dá)儀器有限公司)、SC-3610低速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 材料預(yù)處理

將沙棘籽、籽殼、籽渣分別進(jìn)行真空冷凍干燥，然后粉碎、過篩，備用。

2.2 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱定原花青素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg于容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。準(zhǔn)確量取原花青素儲(chǔ)備液0.00 mL，0.10 mL，0.25 mL，0.50 mL，1.00 mL，1.50 mL，2.00 mL，2.50 mL，分別置于10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得原花青素標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。

準(zhǔn)確吸取原花青素標(biāo)準(zhǔn)系列工作液各1 mL，置于安瓿瓶中，加入鹽酸-正丁醇溶液6 mL，硫酸鐵銨溶液0.2 mL，混勻，用封口鉗將其密封，置沸水中加熱40 min后，取出，立即置于冰水中冷卻至室溫，于546 nm波長處測(cè)吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，原花青素濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取沙棘籽樣品約50 mg于50 mL容量瓶中，加入甲醇，超聲處理20 min，冷卻至室溫。離心，過濾，回收濾液，殘?jiān)眉状枷礈?，洗液并入容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得供試品溶液。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

精密量取250 μL供試品溶液6份，加入750 μL甲醇于安瓿瓶中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法操作，以相應(yīng)試劑為空白。于546 nm波長處測(cè)定供試品溶液的吸光度，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中原花青素含量，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取250 μL供試品溶液，加入750 μL甲醇于安瓿瓶中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法操作，以相應(yīng)試劑為空白。分別于0 min，10 min，20 min，30 min，40 min，50 min，60 min，70 min，1 000 min時(shí)，測(cè)定其在546 nm波長處的吸光度。按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中原花青素含量，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2.6 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

取已知原花青素含量的沙棘籽樣品1份，按照供試品溶液制備方法操作。將供試品溶液分為3組，每組3份，置于安瓿瓶中，分別加入相當(dāng)于樣品量80%，100%，120%的標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法操作，以相應(yīng)試劑為空白。于546 nm波長處測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2.7 原花青素含量測(cè)定

按2.3所述方法制備供試品溶液。精密吸取供試品溶液1 mL，置于安瓿瓶中，然后按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作步驟執(zhí)行，以相應(yīng)試劑為空白。測(cè)定樣品吸光度，計(jì)算樣品中原花青素的含量。計(jì)算公式如下：

式中：X——試樣中原花青素的含量，%；

c——混合物中原花青素的濃度，μg/mL；

V——待測(cè)樣液總體積，mL；

V1——樣液反應(yīng)體積，mL；

V2——樣液反應(yīng)后總體積，mL；

m——樣液所代表的試樣質(zhì)量，mg.

3 結(jié)果與分析

3.1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線

按2.2所述方法，繪制原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1.

圖1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可見，用最小二乘法得到回歸方程為y=0.004 7x-0.030 1，其相關(guān)系數(shù)R2=0.992 7.表明樣品濃度在25 μg/mL～250 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

3.2 重復(fù)性試驗(yàn)

重復(fù)性試驗(yàn)中，6份供試品溶液的原花青素含量測(cè)定結(jié)果見第13頁表1.

由表1可知，樣品中原花青素平均含量為48.12%，RSD值為2.80%(n=6)，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

穩(wěn)定性試驗(yàn)中，10個(gè)時(shí)間處理下的吸光度測(cè)定結(jié)果見表2.

表1 重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果 %

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

表2結(jié)果表明，在70 min內(nèi)吸光度(A)值保持穩(wěn)定。經(jīng)過約16.7 h，測(cè)定吸光度值略有下降。因此，顯色后應(yīng)在70 min內(nèi)測(cè)定吸光度。

3.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

加標(biāo)回收率試驗(yàn)中，9個(gè)處理的測(cè)定結(jié)果見表3.

表3 加標(biāo)回收試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

由表3可見，3種不同標(biāo)準(zhǔn)品量的原花青素平均回收率分別為95.73%，100.45%，103.21%，均在95%～105%之間，且RSD值均小于2%.表明該方法在系統(tǒng)誤差范圍內(nèi)，可以作為原花青素含量的測(cè)定方法。

3.5 沙棘樣品中原花青素含量

不同沙棘樣品中原花青素的含量的測(cè)定結(jié)果見表4.

表4 不同沙棘樣品中原花青素的含量 %

由表4可知，沙棘籽中原花青素的平均含量為45.62%，脫脂籽渣的原花青素平均含量為8.15%，沙棘籽殼中原花青素的平均含量最高，達(dá)到66.01%，與前人報(bào)道的結(jié)果一致。

4 結(jié)論與討論

原花青素的測(cè)定原理是在加熱的酸性條件和鐵鹽催化作用下，C-C鍵斷裂而生成深紅色花青素離子。常見的分析檢測(cè)方法有分光光度法和高效液相色譜(HPLC)法，目前正丁醇-鹽酸-HPLC法是原花青素測(cè)定的國標(biāo)方法，但檢測(cè)成本相對(duì)較高。本試驗(yàn)采用紫外分光光度法測(cè)定原花青素的含量，方法學(xué)考察顯示該方法重復(fù)性(RSD=2.80%)和穩(wěn)定性(RSD=0.24%)好，回收率(RSD<2%)高，操作簡單方便，且檢測(cè)成本較低。用該方法測(cè)得沙棘籽和沙棘籽殼中原花青素平均含量分別為45.62%和66.01%，該方法可進(jìn)一步應(yīng)用到實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部或企業(yè)日常質(zhì)量控制等場合。