高紅秀 鐘亞平 王 萍 王 萌 任曉艷

彌漫大B細胞淋巴瘤(Diffuse Large B-cell Lymphoma,DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphma,NHL)中的常見類型[1]，據(jù)統(tǒng)計[2]DLBCL占NHL成人患者的30%～40%。目前，DLBCL發(fā)病原因與發(fā)病機制尚不十分清晰，大多為原發(fā)性質(zhì)，也可由其他惰性淋巴瘤發(fā)展而來。DLBCL診斷后應及早給予干預治療，若不及時采取有效措施，患者的中位生存期將少于1年。近年來研究顯示，腫瘤表達多種抗原，引起患者體內(nèi)免疫應答，同時以腫瘤免疫耐受和免疫抑制等多種形式促進腫瘤發(fā)展[3]。CD20作為一種非糖基化疏水磷酸跨膜蛋白，廣泛表達于B細胞成熟的多個發(fā)育階段，有95%～98%的DLBCL患者表現(xiàn)為CD20陽性表達[4]。吲哚胺2,3-雙加氧酶(Indoleamine2,3-dioxygenase,IDO)作為1種催化色氨酸代謝的限速酶，在T細胞免疫耐受誘導和腫瘤免疫逃逸啟動中具有關鍵性作用，是免疫耐受重點環(huán)節(jié)[5]。本研究分析IDO表達對CD20+DLBCL患者RCHOP方案治療的預后的影響，旨在為DLBCL免疫治療靶點提供參考，報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

回顧性選取2015年9月至2017年2月本院經(jīng)組織活檢診斷為DLBCL的60例患者臨床資料，所有患者均通過免疫組化與流式細胞免疫表型分析檢測CD20蛋白陽性表達，其中男性36例，女性24例；年齡22～82歲，平均(61.73±17.63)歲；Hans分型：GCB型22例，非GCB型38例；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期21例，Ⅲ～Ⅳ期39例；B癥狀：有27例，無33例。

1.2 納入與排除標準

納入標準：①經(jīng)病理診斷為CD20陽性的DLBCL患者；②于本院至少完成3個周期的RCHOP 免疫化療者；③均為初治患者，診斷前未行任何相關治療者。排除標準：①化療周期數(shù)少于3個周期者；②RCHOP方案間斷使用者；③復發(fā)或難治患者；④經(jīng)病理診斷有第二腫瘤者；⑤臨床資料不全者。

1.3 免疫組化檢測

1.3.1 主要實驗試劑 一抗：IDO兔抗人單克隆抗體、CD20鼠抗人單克隆抗體分別購自Abcam 公司、北京中杉金橋公司，工作濃度均為1∶100。二抗：辣根過氧化物酶(HRP)購自丹麥Dako公司。

1.3.2 檢測方法 DLBCL組織標本均通過4%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，將石蠟組織塊行4 μm厚連續(xù)切片，于67 ℃條件下烘烤過夜，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水(100%酒精2次，90%酒精1次，80%酒精1次)；以蒸餾水清洗3次，3 min/次。 將切片浸入PH 6.0檸檬酸鹽緩沖液中，放入盛有蒸餾水的高壓鍋中，2 100 W條件下加熱至沸騰后調(diào)至1 000 W，修復3～5 min，室溫下自然冷卻，PBS液清洗 3次，3 min/次。于室溫條件下通過3%過氧化氫液孵育5～8 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。再次使用PBS液清洗3次，3 min/次。甩去PBS液，蘸去玻片組織塊周圍的多余液體，使用免疫組化筆在組織塊的周圍畫圈，每一切片滴加50 μl一抗，搖勻，使一抗基本上覆蓋所有組織，置于濕盒中，4 ℃過夜。復溫3～5 min，使用PBS液清洗3次，5 min/次，甩去PBS液。每一切片滴加二抗工作液50 μl，37 ℃條件下孵育50 min，復溫3 min，PBS緩沖液沖洗3次，5 min/次。 每一切片滴加 DAB液50～100 μl，自來水充分沖洗，蘇木精復染處理1 min，以鹽酸乙醇分化10 s，通過蒸餾水返藍，封片，鏡下觀察。

1.3.3 結(jié)果判定 每張切片由2名病理科醫(yī)師雙盲法觀察，于高倍鏡下隨機選擇5個視野，依據(jù)細胞陽性著色程度和陽性細胞數(shù)評判。 IDO陽性表達主要位于胞質(zhì)，部分位于胞核，棕黃色或棕褐色顆粒；CD20陽性信號定位于細胞膜及細胞質(zhì)。 免疫組化陽性結(jié)果采用半定量積分綜合計量法判定[6]：著色程度：無色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分；陽性細胞百分比：0～10%計0分，>10%～25%計1分，>25%～50%計2分)，>50%計3分。染色分級：以著色程度以及陽性細胞百分比乘積分級，<3分為陰性，≥3分為陽性。

1.4 治療方法

使用美羅華，劑量 375 mg/m2，靜脈滴注，每一周期第1天、第3天開始用CHOP方案，以21天為1個周期。第1天，美羅華初始劑量100 mg加入5% GS 500 ml中，靜脈滴注，速度：15～20 滴/min，0.5～1 h若無反應，滴速調(diào)整為30滴/min，約2 h滴完。之后將500 mg美羅華加入5% GS 500 ml中靜脈滴注，4～6 h滴完。用藥后的30 min，給予口服新癀片，2片/次；肌肉注射注苯海拉明，劑量為20 mg。用藥當天注意監(jiān)測血壓、心率水平，1 次/h，共10次。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件處理與分析數(shù)據(jù)，計數(shù)資料采用例數(shù)和率(%)表示，組間比較使用χ2檢驗；通過Logistic回歸分析影響CD20+DLBCL患者RCHOP方案治療預后的因素，P<0.05代表差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 IDO表達與DLBCL患者臨床病理特征的關系

非GCB型、臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、有B癥狀、化療效果為PD+SD的CD20+DLBCL患者IDO表達陽性率高于GCB型、臨床分期Ⅰ～Ⅱ期、無B癥狀、化療效果為PR+CR患者(P<0.05)。見表1。

表1 IDO表達與DLBCL患者臨床病理特征的關系(例，%)

2.2 不同 IDO表達患者無進展生存與總生存分析

隨訪3年，根據(jù)研究對象的隨訪情況，繪制3年無進展生存曲線和總生存曲線，如圖1、圖2。IDO陽性患者1年、3年無進展生存率分別為72.22%、36.11%，低于IDO陰性患者的91.67%、70.83%(P<0.05)；ID0陽性患者1年、3年總生存率分別為83.33%、50.00%，低于IDO陰性患者的95.83%、79.17%(P<0.05)。

2.3 影響CD20+DLBCL患者RCHOP方案治療預后的單因素分析

非GCB型、臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、有B癥狀、IPI評分為3～5分、IDO陽性的CD20+DLBCL患者隨訪3年死亡率高于GCB型、臨床分期Ⅰ～Ⅱ期、無B癥狀、IPI評分為0～2分、IDO陰性患者(P<0.05)。見表2。

2.4 影響CD20+ DLBCL患者RCHOP方案治療預后的多因素分析

將上述因素差異有統(tǒng)計學意義項納入多因素Logistic回歸模型，以隨訪3年生存結(jié)果作為因變量，以上述差異有統(tǒng)計學意義項作為自變量，并進行賦值：Hans分型(GCB型=0，非GCB型=1)、分期(Ⅰ～Ⅱ期=0，Ⅲ～Ⅳ期=1)、B癥狀(無=0，有=1)、IPI評分(0～2分=0，3～5分=1)、IDO(陰性=0，陽性=1)，Logisitic回歸分析顯示非GCB型、Ⅲ～Ⅳ期、有B癥狀、IPI評分為3～5分、IDO陽性是導致CD20+ DLBCL患者RCHOP方案治療不良預后的危險因素。見表3。

圖1 3年無進展生存分析

圖2 3年總生存分析

3 討論

DLBCL為常見淋巴系統(tǒng)惡性增殖性疾病，隨著免疫化療時代到來，美羅華聯(lián)合化療的RCHOP方案應運而生，有效改善了DLBCL患者預后，臨床價值較高[7]。隨著DLBCL發(fā)病機制研究的深入，人們逐漸認識到DLBCL患者生物學行為、臨床行為，可能與腫瘤及腫瘤微環(huán)境間的相互作用以及腫瘤細胞相關因子等有關[8]。近年來，較多學者針對DLBCL患者預后進行研究，并提出預后預測指標，如 Hans分型等，但臨床意義仍有一定的爭議。因此，尋找DLBCL預后指標并對這一腫瘤進行進一步分型仍是臨床面臨的重要問題。

IDO廣泛分布于哺乳動物體內(nèi)，是一種含亞鐵血紅素的單體酶，正常組織中表達較弱，在器官移植、妊娠、炎癥、腫瘤等生理或病理狀態(tài)下，IDO表達明顯增強[9]。IDO及其代謝產(chǎn)物，主要在淋巴器官T 細胞區(qū)和胸腺髓質(zhì)中表達，部分分布在免疫赦免或耐受區(qū)，特異性表達于巨噬細胞、樹突狀細胞上。腫瘤免疫耐受方面，IDO主要經(jīng)免疫應答兩個環(huán)節(jié)來調(diào)控，一方面，IDO可通過降解色氨酸，耗竭局部色氨酸，呈現(xiàn)色氨酸饑餓狀態(tài)，抑制T 細胞增殖，使其停止于G1 期；另一方面，色氨酸代謝產(chǎn)物犬尿素可誘導T細胞凋亡，喹啉酸可抑制 T細胞和NK細胞的增殖[10]。Liu DQ等[11]通過免疫組化研究證實IDO 在DLBCL患者中高表達，且IDO表達情況與RCHOP方案治療化療耐受有關。

表2 影響CD20+DLBCL患者RCHOP方案治療預后的單因素分析(例，%)

表3 影響CD20+DLBCL患者RCHOP方案治療預后的多因素分析

本研究中，以應用RCHOP方案治療的CD20+ DLBCL患者作為研究對象，通過免疫組化技術測定IDO 在DLBCL中的表達，發(fā)現(xiàn)約61.67%的DLBCL患者存在IDO陽性表達，略高于Pham KN等[12]研究結(jié)果。本研究結(jié)果顯示IDO陽性表達在DLBCL患者中非GCB型、臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、有B癥狀中更為多見，且化療效果為PD+SD患者 IDO陽性表達率更高，IDO高表達的患者生存時間較短，提示在治療過程中，通過聯(lián)合IDO抑制劑可能可以改善RCHOP方案治療IDO高表達的DLBCL的治療效果。多因素分析結(jié)果表明，GCB型、臨床分期、有無B癥狀、IPI評分、IDO表達均是影響DLBCL患者預后的獨立危險因素，IDO陽性提示患者預后較差，可以根據(jù)IDO的高表達來預測RCHO方案治療DLBCL的療效。

綜上所述，IDO高表達更常見于已經(jīng)出現(xiàn)全身癥狀(B癥狀) 、臨床分期較高、非GCB型DLBCL患者中，IDO高表達患者的近期療效較差，3年無進展生存率與總生存率均較低。IDO表達水平可以作為 DLBCL患者獨立預后因素。