周兵奇 苗 卓 王向征

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率居惡性腫瘤的第3位。在我國結(jié)直腸癌居惡性腫瘤第4位，是導(dǎo)致死亡的主要腫瘤之一[1]。既往研究認(rèn)為，腫瘤生物學(xué)行為(如局部浸潤、新血管生成及遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等)在一定程度上受血清中腫瘤相關(guān)生物因子的調(diào)控，從而在一定程度上促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[2]。近年來伴隨著結(jié)直腸癌分子治療的不斷發(fā)展，結(jié)直腸癌分子生物學(xué)研究成為熱點(diǎn),近期研究稱血清中Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Kelch-like ECH-associated protein,Keap1)、生長分化因子-15(Growth differentiation factor 15,GDF 15)的表達(dá)能夠抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的持續(xù)增殖，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[3]。因此，本研究旨在探討Keap1、GDF 15在結(jié)直腸癌患者中的表達(dá)情況，以及其與臨床分期間的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

研究收集2017年1月至2018年12月于我院接受治療的200例結(jié)直腸癌患者為實(shí)驗(yàn)組。納入標(biāo)準(zhǔn)：① 經(jīng)手術(shù)或病理活檢確診為結(jié)直腸癌的患者；②無心肺功能不全或其他嚴(yán)重疾病；排除標(biāo)準(zhǔn)：①臨床資料不全者；②伴有其他腫瘤的患者或非結(jié)直腸癌初診的患者。200例結(jié)直腸癌患者中，男性110例，女性90例；年齡45～74歲，平均約(59.37±7.29)歲；確診為直腸癌90例，結(jié)腸癌110例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 62例(其中N1 39例；N2 23例)，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移138例；組織學(xué)分型：管狀腺癌160例，黏液腺癌40例；TNM分期：Ⅰ期 56例，Ⅱ期 44例，Ⅲ期 53例，Ⅳ期 47例。研究另收集200例結(jié)直腸息肉患者為結(jié)直腸良性病變組，男性105例，女性95例，年齡49～72歲，平均(58.67±7.44)歲。兩組患者間的性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。所有患者均在入組時(shí)詳細(xì)交代本研究目的及方法，患者表示對(duì)本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 Keap1在結(jié)直腸癌中表達(dá)的測(cè)定 手術(shù)或活檢后的組織標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋、切片，厚度為5 μm。采用免疫組化法檢測(cè)(兔抗人Keap1抗體購于美國proteintech公司，免疫組化二抗SP檢測(cè)試劑盒購于北京四正柏生物科技有限公司，Keap1抗體按1∶100稀釋)，剩下步驟嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作，封片，鏡下觀察。根據(jù)觀察結(jié)果判斷Keap1表達(dá)情況，分別為陰性(-)、陽性(+)。

1.2.2 血清中GDF 15表達(dá)情況的測(cè)定 所有入組患者均于入院后第二天早晨空腹采集靜脈血5 ml，離心后取上層血清，至于-80 ℃冰箱中保存、備用?；颊哐逯蠫DF-15水平測(cè)定采用酶聯(lián)免疫吸附法，抗體購自美國proteintech公司，試劑盒購自北京四正柏生物科技有限公司。

1.3 評(píng)價(jià)指標(biāo)

觀察兩組患者Keap1、GDF 15表達(dá)情況，比較兩組患者間及不同臨床特征結(jié)直腸癌患者Keap1、GDF 15表達(dá)差異。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

研究應(yīng)用SPSS 20.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式記錄，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)及方差分析；計(jì)數(shù)資料以率(%)的形式記錄，組間比較采用χ2檢驗(yàn)和Fish精確檢驗(yàn)。Keap1、GDF 15表達(dá)情況與臨床分期間的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。以雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者Keap1、GDF 15表達(dá)情況的比較

結(jié)直腸癌患者Keap1陽性表達(dá)率(80%)及血清中GDF 15表達(dá)水平[(1278.53±120.69)ng/l]均顯著高于結(jié)直腸良性病變組患者Keap1的陽性表達(dá)率(25%)及血清中GDF 15表達(dá)水平[(759.54±98.99)ng/l]，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 不同臨床分期結(jié)直腸癌患者Keap1、GDF 15表達(dá)情況的比較

研究發(fā)現(xiàn)伴隨著臨床T分期的進(jìn)展，結(jié)直腸癌Keap1陽性表達(dá)率卻呈逐漸減低的趨勢(shì)，各分期間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而不同N分期間結(jié)直腸癌Keap1陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。至于血清中GDF 15的表達(dá)水平，則伴隨著T、N分期的進(jìn)展而呈逐漸增高的趨勢(shì)，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。

2.3 不同病理類型結(jié)直腸癌患者Keap1、GDF 15表達(dá)情況的比較

研究發(fā)現(xiàn)不同病理類型結(jié)直腸癌患者Keap1陽性表達(dá)率均顯著高于結(jié)直腸良性病變組，但是在不同病理類型間Keap1陽性表達(dá)率無顯著差異(P>0.05)；而GDF 15在不同病理類型間表達(dá)水平有顯著差異(P<0.05)，見表2。

2.4 Keap1、GDF 15表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床分期的相關(guān)性

Spearman相關(guān)分析表明，Keap1表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床T分期有關(guān)(γ=0.327,P=0.014)；而血清中GDF 15表達(dá)水平與結(jié)直腸癌臨床T、N分期均有關(guān)(γ=0.457,P=0.002;γ=0.294,P=0.026)。

表1 不同臨床分期結(jié)直腸癌患者Keap1、GDF 15表達(dá)情況比較

表2 不同病理類型結(jié)直腸癌患者Keap1、GDF 15表達(dá)情況的比較

3 討論

直腸癌作為消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，盡管目前臨床結(jié)直腸癌治療方案眾多，但往往確診時(shí)病變的臨床分期均已是中晚期，造成結(jié)直腸癌的總有效率低，即使是手術(shù)聯(lián)合新輔助放化療等綜合治療措施的臨床緩解率亦較低[2]。隨著針對(duì)結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的進(jìn)一步研究，認(rèn)為主要原因是對(duì)結(jié)直腸癌的早期發(fā)病過程缺乏有效的血清學(xué)指標(biāo)。雖然目前臨床常用的腫瘤標(biāo)志物(癌胚抗原、糖鏈抗原蛋白125等)能夠在一定程度上能夠提示腫瘤的存在，從而提高結(jié)直腸癌的診斷率，但其特異度較低，具有明顯的局限性[3-5]。因此，尋找1種高效、簡便、特異性高的結(jié)直腸癌血清學(xué)標(biāo)志物，對(duì)于結(jié)直腸癌的診斷、治療均有重要的意義。

結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，遺傳因素、基因突變等均可能增加腫瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[6]。近年來，分子生物學(xué)水平的異常被認(rèn)為是影響惡性腫瘤發(fā)生的核心因素，相關(guān)蛋白表達(dá)異常會(huì)增加腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞正常分化或促凋亡過程明顯失常[7-8]。因此，臨床上可能通過檢測(cè)某種分子指標(biāo)而初步評(píng)估腫瘤病變的臨床分期。Keap1為近年來發(fā)現(xiàn)的分子標(biāo)志物，其主要作用是機(jī)體對(duì)抗外界氧化和化學(xué)等刺激的防御性轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，同時(shí)能夠通過與核因子E2 相關(guān)因子相互作用，活化抗氧化酶和蛋白，從而發(fā)揮抗氧化、抗炎以及抗腫瘤的作用[9-11]。本研究通過分析Keap1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)：Keap1在結(jié)直腸癌中的陽性表達(dá)率明顯升高，分析其原因可能是由于Keap1有部分抗腫瘤的作用，當(dāng)機(jī)體發(fā)生腫瘤性病變時(shí)，機(jī)體自身防御系統(tǒng)激活，導(dǎo)致Keap1陽性表達(dá)率升高。一項(xiàng)關(guān)于砷和Keap1誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)病機(jī)制研究稱，砷能夠競爭性結(jié)合于Keap1下游的靶點(diǎn)核因子E2 相關(guān)因子，導(dǎo)致下游靶點(diǎn)的過度激活，從而導(dǎo)致Keap1表達(dá)水平下降，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增長[12]。上述研究也從另一方面驗(yàn)證了Keap1對(duì)腫瘤細(xì)胞具有一定的抑制作用。而另一項(xiàng)關(guān)于Keap1與腦膠質(zhì)瘤的研究表明：Keap1的表達(dá)不僅與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)病有關(guān)，還有腫瘤的惡性程度有關(guān)，研究認(rèn)為Keap1的表達(dá)水平能夠在一定程度上反應(yīng)腦膠質(zhì)瘤的惡性程度[13]。這與本研究結(jié)果：伴隨著結(jié)直腸癌臨床T分期的進(jìn)展，Keap1陽性表達(dá)率逐漸升高一致，說明Keap1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)能夠在一定程度上反應(yīng)腫瘤的臨床分期。

另外，本研究中的GDF 15屬于轉(zhuǎn)化生長因子家族成員，當(dāng)前研究認(rèn)為GDF 15在多種情況下均會(huì)不同程度增高，但是對(duì)于其表達(dá)水平與腫瘤生物學(xué)行為、分期的研究尙無明確研究[14]。有研究認(rèn)為GDF 15作為多生物活性的細(xì)胞因子在腫瘤中扮演了多重角色，一方面抑癌基因激活GDF 15誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤發(fā)生；然而在某些腫瘤中GDF 15 的高表達(dá)又與腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及低生存率相關(guān)[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)：結(jié)直腸癌患者血清中GDF 15表達(dá)水平顯著升高，說明GDF 15可作為結(jié)直腸癌患者的一項(xiàng)血清學(xué)檢測(cè)指標(biāo)。有研究稱，結(jié)直腸癌患者血清內(nèi)GDF 15升高的原因可能為：① 首先當(dāng)前研究一致認(rèn)為GDF 15為腸道黏膜的一種內(nèi)源性保護(hù)因子；② GDF 15 對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞具有明確的抑制作用，而且抗癌藥物能夠提高該因子的表達(dá)[17]。而本研究針對(duì)血清中GDF 15表達(dá)水平與結(jié)直腸癌臨床分期間的關(guān)系進(jìn)行進(jìn)一步的分析，本研究認(rèn)為兩者間存在明確的相關(guān)關(guān)系。目前GDF 15在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中所起的作用尚無統(tǒng)一意見。既往有研究表明GDF 15能夠通過與轉(zhuǎn)化因子結(jié)合，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移，研究報(bào)道稱，血清CDF 15 表達(dá)水平與結(jié)直腸癌的進(jìn)展有著一定的相關(guān)性，研究認(rèn)為伴隨著結(jié)直腸病變的逐漸演變(由息肉-腺瘤-不典型增生-局灶性癌變-進(jìn)展期腫瘤)，患者血清中的CDF 15水平逐漸升高[18]。另外還有部分研究結(jié)果表明：血清CDF 15水平可用于術(shù)后病情評(píng)估及腫瘤復(fù)發(fā)的檢測(cè)。因此，可以認(rèn)為血清中GDF 15表達(dá)水平能夠在一定程度上促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。

綜上所述，本研究認(rèn)為Keap1、GDF 15在結(jié)直腸癌中表達(dá)明顯增高，并與臨床分期存在明確的相關(guān)性，即臨床上可以通過檢測(cè)上述指標(biāo)來評(píng)估腫瘤患者的臨床分期，為進(jìn)一步的治療決策提供幫助。