劉 濤 白 浪 高永濤

直腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，在中國(guó)的發(fā)病率也呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人類健康[1-3]。多項(xiàng)研究證實(shí)直腸癌的發(fā)生發(fā)展與癌基因、抑癌基因突變有關(guān)[4]。抑癌基因甲基化是腫瘤發(fā)生發(fā)展的常見的表觀遺傳學(xué)變化，有研究證實(shí)抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化與直腸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[5]。ADAMTS(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs,ADAMTS)是一種新型金屬蛋白酶家族，參與多種生理學(xué)和病理學(xué)過(guò)程如血管生成、癌癥發(fā)生等[6]。ADAMTS9是ADAMTS家族成員之一，作為抑癌基因抑制多種腫瘤發(fā)生發(fā)展[7]。本研究旨在探討ADAMTS9基因甲基化在直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 TRIzol(美國(guó)Invitrogen公司)、DNA提取試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)、Taq酶(日本Takara公司)、CpGenome DNA修飾試劑盒(Chemicon公司)。

1.1.2 標(biāo)本 在取得直腸癌患者或家屬知情同意后,收集2016年1月至2018年12月間于延安大學(xué)附屬醫(yī)院普通外科醫(yī)院行直腸癌根治手術(shù)切除的83例直腸癌組織及其相應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本。所有患者直腸標(biāo)本均經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)直腸腺癌，術(shù)前均未行新輔助放化療，83例直腸癌手術(shù)中，57例行腹腔鏡直腸癌根治術(shù)，26例行開腹直腸癌根治術(shù)。83例患者中，男性52例，女性31例，平均年齡(53.8±10.2)歲。

1.2 方法

1.2.1 提取直腸癌組織、癌旁組織中RNA、DNA 在液氮中將直腸癌和癌旁組織研磨至粉末狀，加入1 ml的TRIzol試劑后依次提取細(xì)胞總RNA和基因組DNA。

1.2.2 ADAMTS9 mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 利用Real Time PCR檢測(cè)ADAMTS9 mRNA表達(dá)水平，分別取上述直腸癌、癌旁組織總RNA 2 μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,采用Takara公司SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒，以β-actin為內(nèi)參,測(cè)定ADAMTS9基因的mRNA水平。ADAMTS9上游引物:5'-GGATCGTGGCTACTGACCGCAA-3'，下游引物：5'-GACGTTGACGCCGATTGCACTAA-3'。反應(yīng)體系包括:SYBR Green I Master Mix 12 μl、10 μmol/l引物各1 μl、cDNA 2 μl,加去離子水補(bǔ)足體積至25 μl。反應(yīng)條件:52 ℃ 1 min,95 ℃預(yù)變性3 min,40個(gè)循環(huán)，目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因的mRNA水平以2-ΔΔCt值表示。

1.2.3 ADAMTS9基因啟動(dòng)子甲基化分析 分別取上述直腸癌、癌旁組織總DNA，采用CpGenome修飾試劑盒進(jìn)行亞硫酸氫鈉修飾，利用巢式-甲基化特異性PCR(nest-methylation-specific PCR,MSP)進(jìn)行ADAMTS9基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平的檢測(cè)。ADAMTS9上游引物:5'-AACGTTGACGTGACCGGTACGACT-3'，下游引物:5'GGCATTGACTCAAGTCG-3'，USP上游引物:5'-TTGCAACGGCATGACC-3'，下游引物:5'-GGCATGACTTACGGTTACGCATC-3'。^MSP反應(yīng)體系如下：總RNA 1 μl，PCR buffer 2.5 μl，引物各0.5 μl，加至總體積25 μl，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 60 s，共 35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。取10 μl的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳，ChemilmagerTM5500凝膠成像處理系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 直腸癌、癌旁組織中ADAMTS9 mRNA表達(dá)水平

通過(guò)Real Time PCR 檢測(cè)ADAMTS9基因在83例直腸癌組織和配對(duì)癌旁組織中的mRNA相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果顯示直腸癌組織中ADAMTS9 mRNA相對(duì)表達(dá)水平為(23.6±8.59)，低于配對(duì)癌旁組織的(35.2±9.18)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1161，P<0.0001)，表明ADAMTS9基因可能在mRNA轉(zhuǎn)錄水平參與直腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。見圖1。

圖1 直腸癌、癌旁組織中ADAMTS9 mRNA表達(dá)水平

2.2 直腸癌、癌旁組織中ADAMTS9基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)

應(yīng)用MSP方法分析83對(duì)直腸癌組織和癌旁組織的ADAMTS9基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化狀態(tài)(圖2)，結(jié)果顯示83例直腸癌組織中ADAMTS9基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化17例，甲基化發(fā)生率20.5%，83例癌旁組織中ADAMTS9基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化發(fā)生率7.2%(6/83)，直腸癌組織與癌旁組織的ADAMTS9基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化率有顯著性差異(χ2=37.19，P<0.0001)。Logistic回歸分析顯示ADAMTS9基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的異常甲基化可增加直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=10.254,95%CI=3.395～25.631)。

圖2 ADAMTS9基因啟動(dòng)子區(qū)在直腸癌和癌旁組織中的甲基化電泳圖譜

2.3 ADAMTS9基因啟動(dòng)子甲基化與直腸癌臨床病理特征之間的相關(guān)性

通過(guò)分析直腸癌組織中ADAMTS9啟動(dòng)子區(qū)甲基化頻率與直腸癌臨床病理特征的相關(guān)性，結(jié)果表明直腸癌組織中ADAMTS9啟動(dòng)子區(qū)甲基化與腫瘤TNM分期、分化程度相關(guān)。T1、T2，高分化，Ⅰ、Ⅱ期直腸癌患者中ADAMTS9啟動(dòng)子區(qū)甲基化頻率更低，而ADAMTS9啟動(dòng)子區(qū)甲基化與直腸癌患者年齡、性別、腫瘤大小無(wú)明顯相關(guān)性，表明ADAMTS9啟動(dòng)子區(qū)甲基化與直腸癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)。見表1。

表1 ADAMTS9啟動(dòng)子區(qū)甲基化與直腸癌臨床病理特征之間的相關(guān)性(例，%)

3 討論

直腸癌是我國(guó)常見的消化道惡性腫瘤之一，近年來(lái)其發(fā)病率和死亡率均呈逐年上升趨勢(shì)，因此，研究直腸癌的發(fā)病機(jī)制具有很高的價(jià)值[8-9]。隨著對(duì)直腸癌發(fā)病機(jī)制的研究不斷深入，大量研究證實(shí)直腸癌的發(fā)生與遺傳和環(huán)境長(zhǎng)期作用密切相關(guān)，癌基因和抑癌基因的失衡是直腸癌發(fā)病的重要機(jī)制[10-11]。

越來(lái)越多的證據(jù)表明表觀遺傳異常也在直腸癌的發(fā)病中發(fā)揮作用。DNA甲基化(DNA methylation)是表觀遺傳學(xué)的重要現(xiàn)象，與基因組印記(genomic imprinting)，基因沉默(gene silencing)等表觀遺傳現(xiàn)象參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12-15]?；蚪M中DNA的甲基化模式是通過(guò)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶實(shí)現(xiàn)哺乳動(dòng)物基因表達(dá)調(diào)控的重要形式，DNA甲基化異常引起抑癌基因失活和癌基因激活是直腸癌發(fā)生的重要機(jī)制之一，DNA異常甲基化的逆轉(zhuǎn)可能有助于直腸癌的診斷和治療[16-17]。人類 ADAMTS 家族包含 19 個(gè)分泌型的多域蛋白水解酶，ADAMTS 家族成員作為腫瘤抑制基因(tumor suppressor genes,TSGs)發(fā)揮作用，有研究報(bào)道 ADAMTS家族成員的表觀遺傳學(xué)修飾參與直腸癌發(fā)病機(jī)制[18]。有研究表明，ADAMTS9在食管癌組織中表達(dá)降低，且與ADAMTS9基因的啟動(dòng)子甲基化有關(guān)[19-20]。但研究ADAMTS9基因在直腸癌中的作用較少。本研究發(fā)現(xiàn)，直腸癌組織中ADAMTS9 mRNA表達(dá)水平低于配對(duì)癌旁組織(χ2=1161，P<0.0001)，表明ADAMTS9基因可能在mRNA轉(zhuǎn)錄水平參與直腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。通過(guò)應(yīng)用MSP方法,進(jìn)一步分析ADAMTS9基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化狀態(tài)，結(jié)果直腸癌組織中ADAMTS9基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化發(fā)生率為20.5%，高于癌旁組織甲基化發(fā)生率7.2%(χ2=37.19，P<0.0001)。Logistic回歸分析顯示ADAMTS9基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的異常甲基化可增加直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。分析直腸癌組織中ADAMTS9啟動(dòng)子區(qū)甲基化頻率與直腸癌臨床病理特征的相關(guān)性，結(jié)果表明直腸癌組織中ADAMTS9啟動(dòng)子區(qū)甲基化與腫瘤TNM分期、分化程度相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)抑癌基因ADAMTS9啟動(dòng)子區(qū)甲基化不但參與了直腸癌的發(fā)生，而且與直腸癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)。上述研究結(jié)果提示ADAMTS9啟動(dòng)子區(qū)甲基化可為直腸癌的早期診斷及預(yù)后判斷提供幫助。然而，關(guān)于ADAMTS9啟動(dòng)子區(qū)甲基化如何進(jìn)一步影響直腸癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。

直腸癌的發(fā)生、發(fā)展是多個(gè)基因、多種因素綜合作用的結(jié)果，隨著對(duì)DNA甲基化和表觀遺傳學(xué)研究的深入，我們終將揭開直腸癌的發(fā)病機(jī)制。我們的研究初步證實(shí)了直腸癌組織中抑癌基因ADAMTS9啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，為后續(xù)直腸癌的表觀遺傳學(xué)研究提供了依據(jù)。