張 聰 曹立宇

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，在我國惡性腫瘤致死率順位排名中居于第三位，多數(shù)結(jié)直腸癌患者在確診時(shí)已處于中晚期，5年生存率較低[1-2]。轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是結(jié)直腸癌患者的主要致死因素[3]。

胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白家族(Insulin-like growth factor-binding proteins)包括IGFBP1-7共7個(gè)成員，這7個(gè)成員在新陳代謝中起著至關(guān)重要的作用，例如，胰島素抑制IGFBP1這是胰島素分泌的一個(gè)標(biāo)志[4]。IGFBP5是該家族一員，在細(xì)胞生長、分化、凋亡和細(xì)胞代謝中發(fā)揮重要作用。有研究證明IGFBP5濃度與肥胖男性脂聯(lián)素濃度相關(guān)，提示IGFBP5可能參與代謝綜合征[5]。此外，IGFBP5的缺失導(dǎo)致輕度葡萄糖耐受不良和加重飲食誘導(dǎo)的肥胖[6]。并且IGFBP5參與前列腺癌、胃癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7-8]。

本研究通過分析GEPIA和Linked Omics數(shù)據(jù)庫，研究IGFBP5基因在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平與臨床參數(shù)的關(guān)系，分析IGFBP5與結(jié)直腸癌生存和預(yù)后的影響，并進(jìn)一步探討IGFBP5參與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，以期對(duì)結(jié)直腸癌的初步診斷和臨床治療提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 病例資料

GEPIA2(gepia2.cancer-pku.cn)網(wǎng)站是1個(gè)分析腫瘤和正常樣本的在線工具，其數(shù)據(jù)來源TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫，它提供了可定制的功能，比如腫瘤/正常的微分表達(dá)式分析，可提供腫瘤患者腫瘤患者的臨床參數(shù)分析和生存分析等[9]。LinkedOmics數(shù)據(jù)庫包含來自TCGA數(shù)據(jù)庫的32種癌癥類型的多組學(xué)數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)，共有11158名患者。它也是第一個(gè)集成了基于質(zhì)譜(MS)的全球蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的多組學(xué)數(shù)據(jù)庫，LinkedOmics主要有3個(gè)分析模塊，Link Finder板塊可以靈活地探索感興趣的分子或臨床屬性與所有其他屬性之間的關(guān)聯(lián)，并可進(jìn)行分析和和可視化；Link Compare板塊可輕松比較LinkFinder識(shí)別出的關(guān)聯(lián)，這在多組學(xué)和全癌分析中特別有用；Link Interpreter板塊通過路徑和網(wǎng)絡(luò)分析將已識(shí)別的關(guān)聯(lián)轉(zhuǎn)換為生物學(xué)理解[10]。ONCOMINE包含65個(gè)基因表達(dá)數(shù)據(jù)集，包括超過4700個(gè)微陣列實(shí)驗(yàn)的接近4800萬個(gè)基因表達(dá)測量值?？蓪⒋蠖鄶?shù)主要類型的癌癥與各自的正常組織以及多種癌癥亞型進(jìn)行比較，基于臨床和病理學(xué)的分析可用于探索，可以查詢所有分析中選定基因或選定分析中多個(gè)基因的數(shù)據(jù)并可視化[11]。

1.2 IGFBP5表達(dá)分析

通過查閱ONCOMINE數(shù)據(jù)庫研究IGFBP5在多種腫瘤中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：IGFBP5基因在腦與中樞神經(jīng)腫瘤、白血病、胰腺癌、肺癌和結(jié)直腸癌等多種腫瘤中表達(dá)水平上調(diào)。

使用RT-qPCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證IGFBP5基因在結(jié)直腸癌中的表達(dá)。首先使用NCBI網(wǎng)站設(shè)計(jì)IGFBP5引物，上游序列：5'--3' ACCTGAGATGAGACAGGAGTC和下游序列5'--3' GTAGAATCCTTTGCGGTCACAA，設(shè)計(jì)內(nèi)參GAPDH引物，上游序列5'--3' GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT和下游序列5'--3' GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG，退火溫度為60 ℃，按照TAKARA公司試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。38例結(jié)直腸癌組織及其配對(duì)組織來源于2014至2019年間在安徽醫(yī)科大學(xué)附屬阜陽醫(yī)院病理科做冰凍切片的剩余組織，所有病例均經(jīng)病理診斷，并經(jīng)患者及家屬知情同意。

1.3 臨床參數(shù)分析

使用LinkedOmics數(shù)據(jù)庫分析IGFBP5與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。本研究應(yīng)用LinkFinder模塊分析IGFBP5的基因表達(dá)水平與結(jié)直腸癌的臨床病理特征的關(guān)系。操作步驟為：①腫瘤類型：選擇結(jié)直腸癌；②數(shù)據(jù)類型選擇RNAseq；③數(shù)據(jù)屬性：選擇IGFBP5；④靶數(shù)據(jù)類型：選擇Clinical；⑤統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：選擇非參數(shù)檢驗(yàn)。

1.4 生存分析

使用GEPIA2數(shù)據(jù)庫分析IGFBP5表達(dá)與結(jié)直腸癌患者總生存期和無病生存期之間的關(guān)系。操作步驟為：①輸入基因名IGFBP5；②點(diǎn)擊生存分析頁面，選擇總生存期/無病生存期；③選擇腫瘤類型結(jié)直腸癌(同時(shí)選取COAD和READ)；④點(diǎn)擊plot可視化分析，GEPIA使用Log-rank檢驗(yàn)，即Mantel-Cox檢驗(yàn)，用于假設(shè)檢驗(yàn)，cox比例危險(xiǎn)比和95%置信區(qū)間信息也可以包含在生存圖中。

1.5 基因集富集分析

使用LinkedOmics數(shù)據(jù)庫分析IGFBP5與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。本研究應(yīng)用Link Interpreter板塊基于IGFBP5基因在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平進(jìn)行GO和KEGG聚類分析。操作步驟為①腫瘤類型：選擇結(jié)直腸癌；②數(shù)據(jù)類型選擇RNAseq；③數(shù)據(jù)屬性：選擇IGFBP5；④靶數(shù)據(jù)類型：選擇RNAseq；⑤統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：選擇Spearman相關(guān)性分析；⑥導(dǎo)出數(shù)據(jù)：導(dǎo)出結(jié)直腸癌中與IGFBP5表達(dá)顯著相關(guān)的前1000位基因；⑦分析：使用DAVID網(wǎng)站進(jìn)行GO和KEGG聚類分析。

1.6 IGFBP5相關(guān)基因靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

應(yīng)用Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建IGFBP5相關(guān)基因靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)使用STRING數(shù)據(jù)庫檢索IGFBP5共表達(dá)蛋白，并構(gòu)建IGFBP5分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，將二者結(jié)果取交集，得出與IGFBP5基因關(guān)聯(lián)最緊密的基因。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。應(yīng)用配對(duì)t檢驗(yàn)分析IGFBP5在結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平，使用χ2檢驗(yàn)分析IGFBP5與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性，使用Log-rank檢驗(yàn)法分析IGFBP5表達(dá)與結(jié)直腸癌患者生存之間的相關(guān)性，基因富集分析結(jié)果中認(rèn)為P<0.05且FDR(false discovery rates)<0.25的基因集為顯著富集基因集。所有數(shù)據(jù)以P<0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IGFBP5在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)水平升高

通過查閱ONCOMINE數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)IGFBP5基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、前列腺癌和淋巴瘤中表達(dá)水平升高(P<0.05)。采用RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測IGFBP5在38例結(jié)直腸癌組織及其配對(duì)組織中的表達(dá)，得到了一致的結(jié)果(P<0.05)(圖1)。

2.2 IGFBP5在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平與其臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

選擇LinkedOmics數(shù)據(jù)庫分析IGFBP5在結(jié)直腸癌中與其臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，結(jié)果顯示：IGFBP5與結(jié)直腸癌N分期(n=373)顯著相關(guān)(P=0.025)，而與腫瘤分級(jí)(n=358)、T分期(n=375)和M分期(n=306)均無顯著相關(guān)性(P>0.05)(圖2)。

2.3 IGFBP5表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的相關(guān)性分析

本研究應(yīng)用GEPIA2數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示在結(jié)直腸癌中，IGFBP5高表達(dá)組(n=135)總生存期較IGFBP5低表達(dá)組(n=135)明顯降低(P=0.014)，其中HR=1.8，P(HR)=0.016；結(jié)直腸癌中IGFBP5高表達(dá)組(n=135)無病生存期較IGFBP5低表達(dá)組(n=135)明顯降低(P=0.0082)，其中HR=1.9，P(HR)=0.0095(圖3)。

2.4 IGFBP5的功能基因集富集

在Linkedomics數(shù)據(jù)庫導(dǎo)出結(jié)直腸癌中與IGFBP5相關(guān)的前1000位相關(guān)基因，采用DAVID網(wǎng)站分析IGFBP5的分子功能和相關(guān)信號(hào)通路，GO分析結(jié)果顯示：IGFBP5在結(jié)直腸癌中與細(xì)胞黏附、血管生成和血管內(nèi)皮生長因子等多種促癌功能有關(guān)，KEGG分析結(jié)果顯示：IGFBP5基因與PI3K-Akt信號(hào)通路激活有關(guān)(表1)。

2.5 IGFBP5共表達(dá)基因分析

為獲得與富集所得生物學(xué)功能和相關(guān)信號(hào)通路相關(guān)的潛在上下游分子，我們使用Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建IGFBP5相關(guān)基因靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)使用STRING數(shù)據(jù)庫檢索IGFBP5共表達(dá)蛋白，并構(gòu)建IGFBP5分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，將二者結(jié)果取交集，結(jié)果顯示在IGFBP5共表達(dá)基因中，IGF1、IGF2、SPP1、LTBP1和FAM20C基因與IGFBP5基因關(guān)聯(lián)最緊密。

圖3 IGFBP5表達(dá)與結(jié)直腸癌患者總生存期(左)和無病生存期(右)的相關(guān)性分析

3 討論

胰島素樣生長因子5(IGFBP5)位于人類染色體2q35上，編碼含272個(gè)氨基酸殘基的多通道跨膜蛋白，分子量30.5 kDa，是體內(nèi)生長激素的1個(gè)重要調(diào)節(jié)因子[12]。有關(guān)IGFBP5的生物學(xué)功能研究較少，有研究證明IGFBP5濃度與肥胖男性脂聯(lián)素濃度相關(guān)，提示IGFBP5可能參與代謝綜合征[5]。此外，IGFBP5的缺失導(dǎo)致輕度葡萄糖耐受不良和加重飲食誘導(dǎo)的肥胖[6]。并且IGFBP5參與前列腺癌、胃癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7-8]。

近年來IGFBP5在腫瘤中的研究逐漸展開，Neuzillet等[13]研究發(fā)現(xiàn)，IGFBP5在膀胱癌中通過抑制IGF1R信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖能力和遷移能力，進(jìn)而促進(jìn)了膀胱癌的發(fā)生發(fā)展。Sun等[14]研究發(fā)現(xiàn)circPIP5K1A通過靶向miR-661/IGFBP5軸促進(jìn)卵巢癌進(jìn)展，支持其作為該疾病治療的候選靶點(diǎn)的實(shí)用性。啟動(dòng)子甲基化可引起該基因的沉默，IGFBP5基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平在胃癌中明顯高于癌旁組織，進(jìn)一步證實(shí)IGFBP5可作為胃癌的表觀遺傳學(xué)標(biāo)記物[15]。然而也有研究者發(fā)現(xiàn)，在黑色素瘤中，IGFBP5表現(xiàn)相反，抑制腫瘤細(xì)胞的生長和遷移[16]。因此，在不同的腫瘤中，由于腫瘤之間發(fā)生機(jī)制的差異性，IGFBP5可能有著不同的作用。本研究結(jié)果顯示相對(duì)于正常癌旁組織，IGFBP5在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)水平顯著性，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)IGFBP5與結(jié)直腸癌N分期呈顯著性正相關(guān)，而與T分期、M分期和腫瘤分級(jí)并無顯著相關(guān)性，即IGFBP5表達(dá)水平越高的結(jié)直腸癌患者腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移水平越高，提示IGFBP5的表達(dá)促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，可能是結(jié)直腸癌的促癌因子。生存分析也證實(shí)了IGFBP5是結(jié)直腸癌的不良預(yù)后因素，IGFBP5表達(dá)水平與結(jié)直腸癌總生存期和無病生存期具有顯著負(fù)相關(guān)性。因此IGFBP5的表達(dá)可能促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。腫瘤的發(fā)生發(fā)展影響因素及其復(fù)雜，在正常結(jié)直腸癌惡變的過程中，多伴有細(xì)胞的黏附水平降低以及血管生成水平的變化[17-18]，而PI3K-Akt信號(hào)通路抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡以及促進(jìn)增殖有關(guān)，是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中一個(gè)重要的信號(hào)通路[19-20]。本研究通過GO分析，發(fā)現(xiàn)IGFBP5的表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞黏附、血管生成和血管內(nèi)皮生長因子等多種促癌功能，提示IGFBP5可能對(duì)結(jié)直腸癌上皮細(xì)胞的惡變具有促進(jìn)作用，KEGG分析結(jié)果顯示IGFBP5表達(dá)與PI3K-Akt信號(hào)通路激活有關(guān)，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的調(diào)控。通過分子互作網(wǎng)絡(luò)分析，我們篩選出了IGF1、IGF2、SPP1、LTBP1和FAM20C等IGFBP5共表達(dá)基因，其中IGFI、IGF2是IGFBP5的重要調(diào)控因子[21]，而SPP1是PI3K-Akt信號(hào)通路上游調(diào)控因子[22]。由此可以推測IGFBP5很可能是同坐作用于SPP1，間接激活PI3K-Akt信號(hào)通路，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展。

表1 基因富集結(jié)果

本研究的創(chuàng)新之處在于利用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫中具有完整臨床資料的病例，樣本量大，結(jié)合基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證可信度高，然而不足之處也很明顯，無論是GEPIA2還是LinkedOmics數(shù)據(jù)庫提供的都是IGFBP5基因mRNA水平的表達(dá)數(shù)據(jù)，無法檢測IGFBP5在結(jié)直腸癌中的蛋白表達(dá)水平。本研究為以后IGFBP5在腫瘤中的臨床研究提供了理論基礎(chǔ)，明確IGFBP5在結(jié)直腸癌乃至整個(gè)腫瘤中所起的作用和具體分子機(jī)制尚需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，展開更深入的研究，從而為腫瘤的早期診斷、臨床治療和預(yù)后知道提供靶向新思路。