楊艷榮 鄭先雷 李洪洋

肺癌多源于支氣管黏膜上皮，其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占80%～85%[1]。大量研究指出，大部分非小細(xì)胞肺癌患者查出時已處于中晚期，5年生存率較低。目前對肺癌的發(fā)病機(jī)制尚不明確，有研究認(rèn)為肺癌與多種癌基因激活和抑癌基因的失活有關(guān)[2-3]。絲/蘇氨酸蛋白激酶1(serine/threoninekinase1，AKT1)處于多條信號通路的重要交叉點，在細(xì)胞周期調(diào)控以及細(xì)胞代謝、凋亡方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。有研究指出，AKT1在多種人類腫瘤中存在表達(dá)或活性失調(diào)[4]。本文旨在探討AKT1表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)病理學(xué)特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取本院2015年1月至2016年12月經(jīng)病理學(xué)檢查證實的NSCLC患者90例，分別取其癌組織、癌旁組織為NSCLC組和癌旁組。NSCLC患者，男性57例、女性33例，年齡44～79歲，平均(64.1±10.4)歲，腫瘤分化程度：高分化30例、中分化36例、低分化24例；TNM分期：Ⅰ期22例、Ⅱ期39例、Ⅲ期20例、Ⅳ期9例；病理學(xué)類型：腺癌73例、鱗癌17例。

1.2 納入排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ①NSCLC的診斷以手術(shù)后病理學(xué)、纖維支氣管鏡鏡取癌組織活檢作為診斷依據(jù)；②患者在獲取標(biāo)本前無放化療病史；③均為原發(fā)性肺癌；④納入研究對象的各項資料完整。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①合并其他部位惡性腫瘤；②血液系統(tǒng)疾??；③因其他疾病接受了免疫治療；④具有放化療病史。

1.3 免疫組化檢測方法

采用免疫組織化學(xué)染色法檢測標(biāo)本中絲/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)表達(dá)的情況，具體步驟如下：將切片使用二甲苯脫蠟與梯度乙醇水化進(jìn)行處理，將3%雙氧水封閉于內(nèi)源性過氧化物酶，并在室溫條件下靜置15 min。將3%牛血清清蛋白封閉1 h并分別滴加特異性一抗、二抗孵育，經(jīng)PBS沖洗3次，行DAB顯色處理，用自來水沖洗后，使用蘇木精復(fù)染。采用梯度酒精脫水干燥、二甲苯透明再用中性樹膠封固。脫色后顯微鏡下進(jìn)一步觀察處理。同時設(shè)計空白為對照，采用PBS代替一抗，其他操作步驟與上相同。

1.4 免疫組化結(jié)果判定

AKT1蛋白的陽性著色表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中，根據(jù)著色程度分為：0分是無色、1分是淡黃色、2分是棕黃色、3分是褐色、黑色；根據(jù)陽性細(xì)胞比例分為：1分是陽性細(xì)胞數(shù)目所占比例≤10%、2分是陽性細(xì)胞所占比例>10%～50%、3分是陽性細(xì)胞數(shù)占比>50%～75%、4分是陽性細(xì)胞數(shù)所占比例>75%。2種積分相乘總分≤3分為陰性、>3分為陽性?？偡帧?分采用“-”表達(dá)；總分>3～5分之間采用“+”表達(dá)；總分>5～9分之間采用“++”表達(dá)；總分>9分采用“+++”表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 2組標(biāo)本中的AKT1蛋白陽性表達(dá)率比較

NSCLC組標(biāo)本中的AKT1蛋白陽性表達(dá)率為58.89%(53/90)，癌旁組為11.11%(10/90)，2組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=27.946，P<0.05)，見表1。

表1 2組標(biāo)本中的AKT1蛋白陽性表達(dá)情況比較/例

2.2 NSCLC組織中的AKT1蛋白表達(dá)與患者臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性

在NSCLC組標(biāo)本中，高分化及中分化、TNM分期(Ⅰ期+Ⅱ期)、未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC組中AKT1蛋白陽性表達(dá)率低于低分化、TNM分期(Ⅲ期和Ⅳ期)及發(fā)生淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移NSCLC組織(P<0.05)，不同年齡、性別、病灶大小及病理學(xué)類型的NSCLC組織中AKT1蛋白陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；見表2。

表2 NSCLC組織中的AKT1蛋白表達(dá)與患者臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性(例，%)

2.3 NSCLC組織中的AKT1蛋白表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

NSCLC組標(biāo)本中的AKT1蛋白陽性表達(dá)與陰性表達(dá)患者的1年、2年生存率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，AKT1蛋白陽性表達(dá)患者的3年生存率(13.21%)顯著低于AKT1蛋白陰性表達(dá)患者(37.84%)(P<0.05)；見表3。

表3 NSCLC組織中的AKT1蛋白表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系(例，%)

3 討論

肺癌在全球內(nèi)發(fā)病率較高，是病死率增長最快的惡性腫瘤之一。肺癌根據(jù)病理學(xué)類型可分為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)與小細(xì)胞肺癌(SCLC)，NSCLC的發(fā)病因素尚不明確，目前認(rèn)為其發(fā)病是多因素、多基因共同參與的結(jié)果[5]。轉(zhuǎn)移是腫瘤惡化的主要原因，也是一個多種基因結(jié)構(gòu)、功能異常參與的多步驟的復(fù)雜變化過程[6]。肺癌的發(fā)病有極為繁雜的機(jī)理，其中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對肺癌的發(fā)生發(fā)展起著至關(guān)重要的作用。PI3K/AKT 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是體內(nèi)與細(xì)胞增殖凋亡密切相關(guān)的信號通路，也是癌細(xì)胞存活的首要通路[7]。李笑等[8]研究顯示，PI3K/AKT 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的失調(diào)對肺癌的形成和發(fā)展具有重要的作用。

絲/蘇氨酸蛋白激酶(serine-threonine kinase，AKT)是一種胞漿信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，在細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞代謝和凋亡方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[9]。近年來，對AKT的不斷研究發(fā)現(xiàn)AKT可以通過磷酸化其下游的多種作用底物，影響下游不同因子活化狀態(tài)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、增殖以及轉(zhuǎn)移。Manuse等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤組織中都存在 AKT 的過度表達(dá)和活化。AKT分為3種同分異構(gòu)體：AKT1、AKT2 和 AKT3，其中AKT1、AKT2分布較為廣泛，在多種組織中均有表達(dá)。AKT1 是 AKT 基因的主要亞型之一，能受多種激活劑調(diào)節(jié)活化。AKT1基因擴(kuò)增在諸多腫瘤組織內(nèi)均存在，其過量表達(dá)和活化在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。Larsoncasey等[11]研究發(fā)現(xiàn)，AKT1基因在人胃癌中表達(dá)增加，并且促進(jìn)人類胃癌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的侵襲能力。此外，Ooms等[12]研究發(fā)現(xiàn)，AKT1在乳腺癌中存在過度活化或表達(dá)，在乳腺癌的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用。目前對AKT1與肺癌的研究較多，已有研究發(fā)現(xiàn)[13-14]，抑制 PI3K/AKT 通路能增強(qiáng)小細(xì)胞肺癌的化療敏感性，表明PI3K/AKT 通路可能在肺癌的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。AKT1 蛋白作為 AKT 的一個亞型，可能在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[11]。本研究應(yīng)用免疫組化法檢測AKT1在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)情況，分析其與非小細(xì)胞肺癌臨床病理分期及預(yù)后的關(guān)系，旨在探索AKT1能否成為非小細(xì)胞肺癌防治及預(yù)后評估的新靶點。本研究結(jié)果顯示，NSCLC組標(biāo)本中的AKT1蛋白陽性表達(dá)率(58.89%)顯著高于癌旁組的11.11%(P<0.05)；提示AKT1可能在肺癌的發(fā)生發(fā)展中有重要作用。許多腫瘤都存在多種生長因子的表達(dá)，AKT1 蛋白作為 AKT 的一個亞型可以控制眾多的下游信號傳遞，王嘉等[15]研究認(rèn)為非小細(xì)胞肺癌癌組織中磷酸化 AKT 蛋白表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)。結(jié)合本研究結(jié)果，提示AKT1作為一種癌基因參與了NSCLC的發(fā)生發(fā)展過程，因此阻斷 AKT 信號傳導(dǎo)通路有可能成為癌癥治療新的靶點。此外，高分化及中分化、TNM分期(Ⅰ期+Ⅱ期)、未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC組中AKT1蛋白陽性表達(dá)率低于低分化、TNM分期(Ⅲ期和Ⅳ期)及發(fā)生淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移NSCLC組織，表明AKT1蛋白表達(dá)越高提示NSCLC分化程度越低、惡性程度越高。而值得注意的是，在對本組資料的分析中發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌中腫瘤的直徑與AKT的表達(dá)率無明顯相關(guān)性，但AKT1陽性表達(dá)的患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生率較高，而且TNM分期也相對較晚。提示在非小細(xì)胞肺癌中，AKT1的惡性生物學(xué)行為主要是促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生，而AKT1陽性表達(dá)的患者TNM分期較晚很可能與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。Nakanishi等[16]研究發(fā)現(xiàn)，AKT1能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的非停泊性生長，在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中，脫落遷徙的腫瘤細(xì)胞離開原有基質(zhì)的支持，不利于腫瘤細(xì)胞的存活。而AKT1能夠改變腫瘤細(xì)胞對生長環(huán)境的適應(yīng)性，在離開基質(zhì)支持后發(fā)生非停泊性生長，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷徙及定植。此外，AKT1能夠通過對KT/mTOR/p70s6信號途徑的調(diào)節(jié)增加腫瘤細(xì)胞的游走及遷徙能力，而且能夠促進(jìn)淋巴管的生成，促進(jìn)轉(zhuǎn)移的發(fā)生[17]。對患者預(yù)后的分析發(fā)現(xiàn)，AKT1表達(dá)陽性的患者，3年生存率明顯降低，考慮其與AKT1引起的腫瘤細(xì)胞高侵襲性的惡性生物學(xué)行為有關(guān)。

綜上所述，NSCLC患者癌組織中的AKT1蛋白表達(dá)上調(diào)，與腫瘤的高侵襲性及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后的關(guān)系十分密切，提示在非小細(xì)胞肺癌中，AKT1主要通過增加惡性腫瘤細(xì)胞的遷徙轉(zhuǎn)移能力影響患者的預(yù)后。臨床中AKT1陽性的非小細(xì)胞肺癌可能面臨更高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，其可能為非小細(xì)胞肺癌手術(shù)方案的選擇及化療提供一定的參考價值。