鄭 懿 李希聰 趙太坤 姜 敏

宮頸癌是婦科最常見惡性腫瘤，僅次于乳腺癌[1]。早期宮頸癌治療以手術(shù)為主，而晚期患者治療多采取放化療[2]?；煹挚筟3]導致進展期患者治療效果不佳，患者預后差、易復發(fā)。CCND1基因已被發(fā)現(xiàn)在細胞增殖分化中作用顯著，其異常高表達可促進如卵巢癌、乳腺癌的發(fā)生發(fā)展[4-5]。同時，ERK/MAPK作為廣泛研究的一類具有促癌作用的信號通路，已被報道在介導多類癌細胞增殖遷移及化療抵抗中作用突出[6]?；诖?，本研究重點關注并首次研究調(diào)控CCND1基因表達介導ERK/MAPK信號通路在宮頸癌化療敏感性的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究實驗對象選取2017年3月至2019年3月期間我院婦科收治的行手術(shù)切除的宮頸癌患者，共計60例。所有患者均經(jīng)術(shù)后病理學檢查確診為宮頸癌，術(shù)前均未接受放化療及其他治療，且均提供有完整詳細臨床資料?；颊吣挲g32～68歲，平均(47.83±8.22)歲；年齡<40歲 31例，≥40歲 29例；Ⅰ期13例，Ⅱ期16例，Ⅲ期20例，Ⅳ期11例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例；鱗癌45例，腺癌15例。術(shù)中切取適量的宮頸癌癌灶組織樣本及配對的臨近癌旁組織。采集組織一部分經(jīng)福爾馬林液固定后制石蠟包埋切片用于免疫組化檢測；另一部分癌組織和癌旁組織標本放入液氮冷凍保存，鋁箔包裹進行研磨，采用Trizol試劑反復洗滌，經(jīng)DEPC水處理后凍存收集，置于液氮中，以提取RNA行PCR檢測。本研究經(jīng)所有納入合格患者知情同意，并經(jīng)本院倫理委員會批準實施。

1.2 免疫組化檢測

組織切片常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水，3%雙氧水室溫下作用15 min，PBS沖洗15 min。山羊血清37 ℃封閉20 min后棄血清，滴加一抗兔抗人CCND1抗體，4 ℃過夜。PBS洗滌3次。二抗為羊抗兔IgG抗體，37 ℃孵育30 min。免疫組化一抗和二抗均購于abcam公司(Cambridge，MA，USA)。PBS沖洗3次后滴加SABC(博士德生物工程有限公司，武漢，中國)，37 ℃孵育30 min，后進行DAB顯色，蘇木精染色，二甲苯透明。

1.3 細胞培養(yǎng)及篩選

人宮頸癌細胞株Siha、Caski、Hela、S3均購自中國科學院腫瘤研究所。RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)懸浮細胞，接種 0.5×105/ml于 24孔板，置于5% CO2培養(yǎng)箱中溫育。視細胞生長狀況，每隔2～3 d傳代培養(yǎng)一次。合適細胞株的篩選基于CCND1表達的qRT-PCR檢測結(jié)果。

1.4 細胞分組

基于細胞篩選結(jié)果，將所述細胞轉(zhuǎn)染分組如下：Blank組，pcDNA-CCND1組(轉(zhuǎn)染CCND1過表達質(zhì)粒)，pcDNA-CCND1 NC組(轉(zhuǎn)染CCND1過表達NC質(zhì)粒)，siRNA-CCND1組(轉(zhuǎn)染siRNA-CCND1質(zhì)粒)，siRNA-CCND1 NC組(轉(zhuǎn)染siRNA-CCND1 NC質(zhì)粒)，SCH772984組(轉(zhuǎn)染SCH772984，ERK抑制劑)，Honokiol組(轉(zhuǎn)染Honokiol，ERK激動劑)，siRNA-CCND1+Honokiol組(共轉(zhuǎn)染siRNA-CCND1質(zhì)粒和Honokiol)。通過qRT-PCR檢測其轉(zhuǎn)染效率。

采用Lipofectamine Transfection Reagent 2000(Invitrogen，USA)介導細胞轉(zhuǎn)染。稀釋質(zhì)粒，制備A液；稀釋Lipofectamine 2000，制備B液；混合A液和B液，作為細胞轉(zhuǎn)染液體，每孔細胞中加入100 μl轉(zhuǎn)染液，輕輕搖勻。轉(zhuǎn)染6 h更換成完全培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h后收集細胞。

1.5 CCK8檢測順鉑耐藥性

順鉑使用前采用10%FBS制備為不同溶度的溶液(共設6個濃度0、3、6、9、12、15 μg/ml)并儲存4 ℃?zhèn)溆谩Ｈ?shù)生長期細胞接種于96孔培養(yǎng)板，調(diào)整細胞密度為2×104/ml。5%CO2培養(yǎng)箱細胞溫育6 h后，將各濃度梯度順鉑依次加入96孔板中，設3個復孔。設置空白對照。48 h后，每孔加新配10 μl CCK8試劑(上海經(jīng)科化學科技有限公司，上海，中國)，繼續(xù)孵育4 h后終止。于波長450 nm處使用酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀測定各孔吸光度值，計算細胞存活率以反映細胞的順鉑耐藥性。

1.6 qRT-PCR檢測CCND1、ERK和MAPK mRNA表達水平

轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細胞，Trizol法提取細胞總RNA。設計CCND1、ERK、MAPK和GAPDH引物，交由上海生工設計并合成。逆轉(zhuǎn)錄體系20 μl，參照TaqMan MicroRNA Assays Reverse Transcription Primer進行操作，42 ℃下逆轉(zhuǎn)錄反應30 min，85 ℃并逆轉(zhuǎn)錄酶失活反應5 s。參考參照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書，取反應液進行熒光定量PCR。程序設置為兩步法，設置95 ℃擴增1 min變性后，再設置35周期：95 ℃變性5 s，61 ℃退火延伸 30 s。目的基因以GADPH為內(nèi)參。采用相對定量法計算，用2-ΔΔCt表示各目的基因相對表達量。組織中CCND1、ERK和MAPK mRNA表達水平同上操作步驟。

1.7 Western blot檢測CCND1、ERK和MAPK蛋白表達

收集轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h后的各組宮頸癌細胞。加入RIPA裂解液，輕搖重懸后，冰上孵育30 min，4 ℃下12 000 r/min離心10 min，取上清液，即為細胞總蛋白。利用碧云天BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。取20 μg細胞總蛋白用10 % SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，隨后濕法轉(zhuǎn)膜，使用5%的脫脂奶粉封閉1.5 h。按照抗體說明書稀釋相應抗體于一抗稀釋液中。實驗所用的一抗如下：CCND1、ERK和MAPK，及兔抗人GAPDH多克隆抗體(內(nèi)參)；加入相應HRP標記的二抗羊抗兔IgG抗體，室溫反應2 h。所有抗體均購于Abcam公司(Cambridge，MA，USA)。ECL發(fā)光液顯色后曝光成像。應用Quanity One軟件進行蛋白條帶灰度分析。

1.8 流式細胞儀檢測細胞凋亡變化

細胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集細胞，0.25%胰蛋白酶消化，1 500 r/min離心10 min，棄上清，加入預冷70%乙醇固定細胞，4 ℃過夜。流式細胞術(shù)過程中采用Annexin V-FITC/PI 雙標染色檢測細胞凋亡，將處理好的細胞置于5%CO2培養(yǎng)箱中室溫培養(yǎng)48 h，收集細胞，離心重懸，加入10 μl Annexin V-FITC(Abcam公司，Cambridge，MA，USA)和5 μl PI輕輕混勻，避光室溫反應15 min，加入300 μl結(jié)合緩沖液，用流式細胞儀以激發(fā)波長488 nm檢測細胞凋亡情況。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 CCND1、ERK和MAPK在宮頸癌中高表達

通過對60例宮頸癌組織及相應癌旁組織進行qRT-PCR，發(fā)現(xiàn)相比于癌旁組織，癌組織中CCND1、ERK和MAPK表達均顯著升高(P均<0.05)(圖1A)。

免疫組化檢測癌組織和癌旁組織CCND1的表達(圖1B)，CCND1蛋白定位處顯色為棕黃色或者黃褐色，主要定位于細胞質(zhì)，相比于癌旁組織(12/60，20.00%)，癌組織(47/60，78.33%)中CCND1陽性表達顯著升高(P<0.05)。

A為qRT-PCR檢測宮頸癌組織及癌旁組織CCND1、ERK和MAPK的表達；B為CCND1在癌組織和癌旁組織中表達陽性率。*為表示與癌旁組織相比，P<0.05。

2.2 CCND1對ERK/MAPK信號通路的調(diào)控關系

四組宮頸癌細胞株中Siha細胞株的CCND1表達量均最高(圖2A)。所以選擇Siha細胞株用于后續(xù)實驗。

qRT-PCR檢測Siha細胞株中CCND1對ERK/MAPK信號通路的調(diào)控關系，如圖2B、C所示。Blank組和pcDNA-CCND1 NC組、siRNA-CCND1 NC組間差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。相比Blank組，pcDNA-CCND1組CCND1、ERK、MAPK基因和蛋白表達顯著增加；而siRNA-CCND1組CCND1、ERK、MAPK基因和蛋白表達均顯著降低(P均<0.05)。而與siRNA-CCND1組相比，siRNA-CCND1+ Honokiol組CCND1表達水平降低(P<0.05)，而ERK和MAPK表達水平無顯著變化(P均>0.05)。結(jié)果提示說明CCND1過表達和沉默表達細胞轉(zhuǎn)染的成功；且提示CCND1表達可能調(diào)控ERK/MAPK的表達。

2.3 抑制ERK/MAPK信號通路激活促進細胞的凋亡和提升化療敏感性

分別采用流式細胞術(shù)和MTT實驗檢測Siha細胞株中各組細胞凋亡能力和順鉑敏感性，如圖3所示。結(jié)果顯示，與Blank組相比，Honokiol組癌細胞細胞凋亡降低，順鉑敏感性呈濃度依賴性降低(P均<0.05)；SCH772984組癌細胞細胞凋亡升高，順鉑敏感性呈濃度依賴性升高(P均<0.05)。說明抑制ERK能夠促進宮頸癌細胞的凋亡并提高宮頸癌順鉑敏感性。

A為細胞株篩選；B為相關基因表達量；C為相關蛋白表達量；*為與pcDNA-CCND1 NC組相比，P<0.05；#為與siRNA-CCND1NC組相比，P<0.05。

A為不同組別細胞凋亡；B為不同組別細胞凋亡率；C為不同順鉑濃度下細胞存活率；*為與Blank組相比，P<0.05。

2.4 沉默CCND1表達通過抑制ERK/MAPK信號通路激活促進細胞的凋亡和提升化療敏感性

基于上述結(jié)果，本實驗假設CCND1通過ERK促進細胞的凋亡和耐藥?；贛TT實驗和流式細胞術(shù)實驗結(jié)果(圖4)，Blank組、pcDNA-CCND1 NC組、siRNA-CCND1 NC組間細胞凋亡及耐藥性無顯著差異(P均>0.05)。與pcDNA-CCND1 NC組相比，pcDNA-CCND1組癌細胞凋亡率降低，順鉑敏感性呈濃度依賴性降低(P均<0.05)；與siRNA-CCND1 NC組相比，siRNA-CCND1組癌細胞凋亡率升高，順鉑敏感性呈濃度依賴性提升(P均<0.05)。而與siRNA-CCND1組相比，siRNA-CCND1+ Honokiol組癌細胞凋亡率降低，順鉑敏感性呈濃度依賴性降低(P均<0.05)，與Blank組間差異不顯著(P均>0.05)。說明CCND1能夠通過ERK促進宮頸癌細胞的凋亡并提高宮頸癌細胞化療敏感性。

注：A為不同組別細胞凋亡；B為不同組別細胞凋亡率；C為不同順鉑濃度下細胞存活率；*為與pcDNA-CCND1 NC組相比，P<0.05；#為與siRNA-CCND1 NC組相比，P<0.05。

3 討論

腫瘤的形成機制復雜，涉及多種因素的相互作用；腫瘤患者不良預后及死亡與腫瘤細胞生物學特性(如侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡)等密切相關[7]。同時，腫瘤患者化療敏感性的提高已成為提升療效的關鍵途徑之一。

本研究中，我們通過體內(nèi)乳腺癌組織實驗確認CCND1、ERK和MAPK的表達；并經(jīng)體外細胞轉(zhuǎn)染實驗，探究CCND1基因表達介導ERK/MAPK信號通路激活在宮頸癌細胞凋亡及化療敏感性方面的作用及相關聯(lián)機制。本研究通過體內(nèi)外實驗相結(jié)合，以期深入探究原癌基因沉默介導關聯(lián)信號通路在宮頸癌發(fā)生發(fā)展及診療的作用，為頸癌治療提供思路參考。

既往已有眾多研究關注ERK/MAPK信號通路激活和抑制激活在人類腫瘤中的作用[8-9]。ERK和MAPK是細胞內(nèi)一類保守絲-蘇氨酸蛋白激酶，入核后可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性，從而誘導相關基因表達。已知ERK和MAPK在胃癌、卵巢癌、肝癌等中均存在異常高表達[10-12]。同時，CCND1基因作為重要的細胞周期調(diào)節(jié)蛋白，其轉(zhuǎn)錄因子活性的激活，可導致細胞惡性轉(zhuǎn)化，進而誘導腫瘤發(fā)生發(fā)展[13]。本研究體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)：與癌旁組織相比，宮頸癌中CCND1、ERK和MAPK呈高表達，提示該基因和信號通路在宮頸癌中的促癌作用，并初步證實本文假設沉默CCND1基因表達介導ERK/MAPK信號通路激活可能抑制宮頸癌發(fā)展并提高化療敏感性。

為進一步確認CCND1基因與ERK/MAPK信號通路的關聯(lián)，本文構(gòu)建Blank組、pcDNA-CCND1組、pcDNA-CCND1 NC組、siRNA-CCND1組、siRNA-CCND1 NC組共計5個組別，發(fā)現(xiàn)沉默CCND1表達可抑制ERK/MAPK信號通路的激活。同時siRNA-CCND1+ Honokiol組別的和建議，進一步佐證CCND1沉默表達在抑制所述信號通路激活的作用，為后文作用機制探究奠定基礎。MTT實驗和流式細胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)誘導CCND1基因表達和采用SCH772984誘導ERK/MAPK信號通路激活可提升細胞凋亡率和腫瘤細胞化療敏感性；而沉默CCND1基因表達和采用Honokiol抑制ERK/MAPK信號通路激活可降低細胞凋亡率和化療敏感性。該結(jié)果分別提示：沉默CCND1基因表達和抑制ERK/MAPK信號通路激活均可發(fā)揮抑癌作用和提升化療敏感性的作用；且Honokiol干預可逆轉(zhuǎn)沉默CCND1基因表達的作用。同時，鑒于CCND1可調(diào)控ERK和MAPK的表達，筆者推測沉默CCND1基因表達在宮頸癌中的抑癌和化療敏感性作用可能與抑制該信號通路激活相關。與沉默CCND1基因表達處理相比，CCND1表達沉默結(jié)合Honokiol處理導致癌細細胞凋亡降低，順鉑耐藥性增加。證實CCND1基因沉默能夠通過抑制ERK/MAPK信號通路激活促進宮頸癌細胞的凋亡并提高細胞化療敏感性。

綜上所述，本研究首次證實CCND1基因沉默表達可能通過抑制ERK/MAPK信號通路的激活，促進宮頸癌細胞凋亡，并提高化療敏感性。本研究可為增強宮頸癌化療敏感性提供分子生物學依據(jù)，有待進一步動物實驗驗證。