賈熙超，楊淑珂，孫紅煒，徐曉輝，李凡，路興波

(1. 山東省農業(yè)科學院植物保護研究所，山東 濟南 250100; 2. 山東師范大學生命科學學院，山東 濟南 250014)

棉花(GossypiumhirsutumL.)[1]是全球重要的作物，中國的棉產量居世界前列[2]。山東的產棉量位居全國第二，種植面積占全國的15%。作為主要的經濟作物，棉花是農民和地方政府財政收入的重要來源，為當?shù)氐陌l(fā)展提供了強有力的支持[3]。

棉花枯萎病的病原菌是一種尖鐮孢菌萎蔫?；蚚Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum(Atk.) Snyder et Hansen]，屬鐮刀菌屬，其侵染的絕大部分是野生植物[4]。由其分泌的鐮刀菌酸是一種特異性毒素，該毒素具有耐高溫、耐稀釋、耐儲藏和快速致病的能力，可同時破壞植物的碳、氮循環(huán)系統(tǒng)，并且能夠使葉綠素的合成受阻，從而影響光合效率。該病原菌通過侵染棉花的維管束等部位，導致導管的阻塞從而影響水分以及養(yǎng)分的運輸，并最終抑制棉花的新陳代謝系統(tǒng)，進而使其葉片脫落、枯死[5]。

多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)在很早以前被歸類為芽孢桿菌屬(Bacillus)，直到1994年才被重新分類為類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)。它屬于促進植物生長的根際細菌(PGPR)，能夠產生許多有益的生物活性物質，包括具有廣譜抗菌活性的抗菌素多粘菌素fusaricidins和抗微生物蛋白質，以促進植物生長[6]。

目前，國際以及國內對棉花枯萎病的防治主要還是采用化學農藥，防治效果并不理想，還會帶來環(huán)境污染、病原菌耐藥性等問題[7]。相比于化學農藥，生物防治具有專一性強、環(huán)境友好的特點。

本試驗從山東省棉花枯萎病的病田中采集根際土壤，并篩選其中的生防菌，對抑菌效果較好的菌株進行鑒定，并對其抑菌機理進行初步探究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株 病原菌株：尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)，由山東棉花研究中心惠贈。

抑菌譜用真菌：瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)、終極腐霉(Pythiumultimum)、灰葡萄孢(Botrytiscinerea)、離蠕孢菌(Bipolarissorokiniana)、禾谷鐮刀菌(F.graminearum)、子囊菌(Ascomycetesp.)，均由山東省農業(yè)科學院植物保護研究所病理室惠贈。

抑菌譜用細菌：金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、沙門氏菌(Salmonella)、弧菌(Vibrio)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，本實驗室保存。

1.1.2 土樣 采集山東省東營市(10份)、聊城市(8份)、濟寧市(14份)、德州市(6份)、濟南市(9份)等棉田中發(fā)生枯萎病且生長健壯植株根際土壤(距地表10～20 cm)。

1.1.3 培養(yǎng)基 PDA液體培養(yǎng)基：去皮土豆200 g，可溶性葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然，121℃高壓蒸汽滅菌25 min。固體培養(yǎng)基中加入15 g瓊脂。

LB液體培養(yǎng)基：酵母抽提物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，蒸餾水 1 000 mL，pH自然，121℃高壓蒸汽滅菌25 min。固體培養(yǎng)基中加入15 g 瓊脂。

NA液體培養(yǎng)基：牛肉浸膏3 g，胰蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然，121℃ 0.1 MPa滅菌30 min。固體培養(yǎng)基中加入15 g 瓊脂。

幾丁質酶鑒定培養(yǎng)基：膠體狀幾丁質10 g，KCl 0.2 g，NH4H2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，去離子水1 000 mL，瓊脂20 g，pH自然，121℃高壓蒸汽滅菌25 min。

蛋白酶鑒定培養(yǎng)基：脫脂奶粉15 g，瓊脂20 g，去離子水1 000 mL，121℃高壓蒸汽滅菌25 min。

果膠酶鑒定培養(yǎng)基[8]：酵母提取物5 g，CaCl2·2H2O 0.5 g，瓊脂8 g，聚果膠酸鈉10 g，蒸餾水1 000 mL，NaOH(1 mol/L) 9 mL，0.2%溴百里酚藍12.5 mL。為讓聚果膠酸鈉充分溶解，必須盡可能地攪拌培養(yǎng)基，用熱水溶解各組成成分，121℃高壓滅菌不超過5 min，倒平板。

纖維素酶鑒定培養(yǎng)基[9]：(NH4)2SO40.2 g，MgSO40.05 g，KH2PO40.1 g，NaCl 0.05 g，纖維素粉2 g，剛果紅0.02 g，瓊脂2 g，去離子水100 mL，pH自然，121℃高壓蒸汽滅菌25 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 生防菌株的篩選 采用稀釋涂布法[10]：準確稱取棉花根際土樣10 g于加有90 mL蒸餾水的250 mL錐形瓶中，放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中180 r/min振蕩20 min制備土壤懸液，之后靜置沉淀10 min。吸取1 mL土壤懸液上清，加入到9 mL蒸餾水中渦旋振蕩直至均勻，此為10-1，按照同樣的方法制備10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的稀釋液。取不同稀釋濃度的菌懸液200 μL，均勻涂布于固體NA培養(yǎng)基中，每個濃度3個重復。將涂布好的平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

將長出的單菌落點接到中央接種有尖孢鐮刀菌的PDA平板上，進行對峙培養(yǎng)，對具有抑菌效果的菌株進行菌種保藏。

1.2.2 生理生化特征及分子生物學鑒定 將菌株在LB液體培養(yǎng)基中活化，取1 mL菌懸液至盛有50 mL LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中(250 mL)，30℃、180 r/min進行培養(yǎng)，每隔2 h取樣一次，測定其在600 nm下的光吸收值[11]。

將篩選的生防菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，28℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600為1.28，取1 mL注入到含有50 mL LB的液體培養(yǎng)基中，分別置于25、28、31、34、37、40、43℃條件下，200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，測其OD600。根據OD值大小判定最適生長溫度。

對生防菌株進行淀粉水解試驗、甲基紅試驗、檸檬酸鹽利用試驗、明膠液化試驗、接觸酶試驗、吲哚試驗、V-P試驗，以及NaCl耐受性試驗，鑒定其生理生化特征。

將生防菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至菌懸液渾濁，收集菌體。用細菌基因組提取試劑盒提取菌體總DNA，利用通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′進行PCR擴增。擴增體系(20 μL)：Mix 10 μL，ddH2O 7 μL，引物27F 1 μL，引物1492R 1 μL，DNA 1 μL。PCR擴增程序：95℃ 3 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存。將PCR產物在1%瓊脂糖凝膠中進行電泳，用回收試劑盒回收目的條帶，送至鉑尚生物技術(上海)有限公司進行測序。將反饋回來的16S rDNA數(shù)據與NCBI數(shù)據庫中的序列進行比對，并用MEGA 6.0軟件的NJ算法構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.2.3 生防菌株抑菌譜的測定 采用平板對峙法：在PDA固體培養(yǎng)基中央接種直徑為1 cm的待測病原菌絲塊；同時，在距離菌絲塊2 cm的四周接種生防菌株，28℃恒溫培養(yǎng)4～5 d，觀察并測量抑菌圈大小。

1.2.4 生防菌株抑菌物質檢測 (1)揮發(fā)性物質檢測：于PDA平板中心接種尖孢鐮刀菌菌絲塊，分別在LB、PDA和NA平板上劃線接種生防菌株，將兩個培養(yǎng)皿口對口對接，并用封口膜封上，30℃條件下培養(yǎng)3 d，同時設置不接生防菌株的空白對照。培養(yǎng)時尖孢鐮刀菌平板在上方，生防菌株平板在下方[12]。

(2)幾丁質酶檢測：將生防菌株在NA固體培養(yǎng)基上進行活化，將活化好的單菌落點接到幾丁質酶鑒定培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)6 d，檢測透明圈的有無[13]。

(3)蛋白酶檢測：將菌株在NA固體培養(yǎng)基上進行活化，然后用接種環(huán)挑取單菌落到蛋白酶鑒定培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)48 h，檢查透明圈的有無[14]。

(4)果膠酶檢測：在果膠酶鑒定培養(yǎng)基上接種生防菌株，培養(yǎng)3 d，觀察培養(yǎng)基有無凹陷，凹陷則說明菌株產生了果膠酶。

(5)纖維素酶檢測：挑取活化后的生防菌單菌落到纖維素酶鑒定培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)5 d，查看是否產生水解圈。

1.2.5 菌株JNJX-2發(fā)酵上清液對病原菌孢子、菌絲的影響 (1)對孢子萌發(fā)的影響：將病原菌活化后接入PDA液體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)5 d，得到的菌懸液用3層紗布過濾，制成孢子懸浮液，無菌水調整孢子濃度到1×107個/mL。選用PDA液體培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基，按照1%的接種量進行接種，28℃、180 r/min連續(xù)培養(yǎng)5 d。將菌懸液在4℃、8 000 r/min條件下離心25 min，得發(fā)酵上清液。取100 μL孢子液與等量的JNJX-2發(fā)酵上清液混勻，28℃保溫培養(yǎng)，每隔12 h在顯微鏡下計數(shù)，檢查孢子的萌發(fā)情況[15]，蒸餾水處理做空白對照。

萌發(fā)率(%)=已萌發(fā)孢子數(shù)/(已萌發(fā)孢子數(shù)+未萌發(fā)孢子數(shù))×100。

(2)對菌絲的抑制作用：將尖孢鐮刀菌接種到PDA固體培養(yǎng)基上，在其四周接種生防菌株，28℃培養(yǎng)3 d。顯微鏡下觀察抑菌圈處菌絲的變化，同時設置不接種生防菌為空白對照。

1.2.6 抑菌粗提物的制備 將發(fā)酵上清液與乙酸乙酯等體積加入分液漏斗中，搖晃均勻，然后靜置沉淀過夜。重復萃取3次，合并萃取液，用旋轉蒸發(fā)儀在40℃條件下進行旋蒸，旋瓶轉速調節(jié)為87 r/min，真空泵壓力為-0.095 MPa，冷凝水溫度調節(jié)為4℃。期間不斷調節(jié)旋瓶與水面的高度，防止爆沸。旋瓶底部的粗提物用甲醇進行溶解、提取，最后收集粗提物到離心管。

1.2.7 粗提物的性質測定 將尖孢鐮刀菌孢子液調整到1×107個/mL，取200 μL注入到PDA平板并用滅菌棉簽涂抹均勻，之后對平板打孔供對峙使用。每個處理重復3次。

(1)熱穩(wěn)定性：將粗提物分別在60、80、100、121℃條件下處理25 min，使用平板對峙法進行抑菌試驗。

(2)紫外線穩(wěn)定性：將粗提物分別在紫外燈下照射4、6、8、10、12 h，取處理后的粗提物進行平板對峙。

(3)蛋白酶穩(wěn)定性：將粗提物分別與胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶混勻，使酶的最終濃度為1 mg/mL，水浴鍋中溫浴1～2 h，之后進行抑菌試驗。

(4)不同pH條件下的穩(wěn)定性：使用HCl與NaOH將粗提物的pH調整為4、5、6、7、8、9、10，于室溫下靜置一段時間，注入PDA平板進行對峙，觀察抑菌活性大小。

抑菌活性(%)=處理后的抑菌圈半徑/無處理的抑菌圈半徑×100。

1.3 數(shù)據處理與分析

采用DPS軟件進行數(shù)據處理，并用Duncan’s新復極差法進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 菌株的形態(tài)學特征

菌株JNJX-2在固體PDA培養(yǎng)基上單菌落呈圓形，不透明，淡黃色，菌落表面隆起，邊沿較為整齊(圖1)。

圖1 菌株JNJX-2的單菌落形態(tài)

2.2 菌株生理生化特征

2.2.1 生長曲線的測定 菌株JNJX-2在4～12 h進入對數(shù)生長期，此時菌株高速生長；12 h以后進入穩(wěn)定期；20 h以后進入衰退期(圖2)。因此要獲取最有活力的菌株，應選在4～12 h之間。

圖2 菌株JNJX-2的生長曲線

2.2.2 最適生長溫度的測定 菌株JNJX-2的菌懸液隨著溫度的上升，光吸值先上升后下降，37℃下OD600值最大(圖3)，即菌懸液的濃度最大，說明37℃是菌株的最適培養(yǎng)溫度。

圖3 菌株JNJX-2的最適生長溫度

2.2.3 生理生化指標 菌株JNJX-2的各項生理生化指標(表1)與多粘類芽孢桿菌在淀粉水解試驗、甲基紅試驗、檸檬酸鹽試驗、明膠液化試驗、接觸酶試驗、吲哚試驗、V-P試驗結果[16]一致，只有NaCl耐受性不同。

表1 菌株JNJX-2的生理生化特征

2.3 生防菌株16S rDNA的序列分析

將擴增片段在1%瓊脂糖凝膠中進行電泳，檢測結果顯示(圖4)，目的片段在1 400 bp左右，符合預期大小。

M: DL 4500 DNA Marker。

在NCBI的GenBank數(shù)據庫中將16S rDNA基因序列進行BLAST比對，利用MEGA 6.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育進化樹構建，結果(圖5)顯示，菌株JNJX-2與多粘類芽孢桿菌在同一分支上。

通過生理生化特征與分子生物學方法，鑒定菌株JNJX-2為多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)。

2.4 菌株JNJX-2的抑菌譜

菌株JNJX-2對病原真菌的抑菌效果如圖6所示。對灰葡萄孢和離蠕孢菌的抑制效果最好，抑菌半徑都達到0.75 cm；對瓜果腐霉和終極腐霉沒有抑菌效果(表2)。在與常見病原細菌的對峙中，JNJX-2對金黃色葡萄球菌的抑制效果最好，抑菌半徑達到0.85 cm；對銅綠假單胞菌和弧菌沒有抑制作用。綜上所述，多粘類芽孢桿菌JNJX-2是一株抑菌譜較為廣泛的生防菌。

Paenibacillus polymyxa: 多粘類芽孢桿菌; Brevibacillus fulvus: 黃褐色短芽孢桿菌; Brevibacillus limnophilus: 嗜湖短芽孢桿菌; Sporolactobacillus terrae: 土乳芽孢桿菌; Amphibacillus xylanus: 木雙歧桿菌; Aneurinibacillus migulanus: 米氏硫胺素芽孢桿菌; Aneurinibacillus thermoaerophilus: 嗜熱厭氧桿菌; Halobacillus profundi: 深鹽桿菌; Bacillus licheniformis: 地衣芽孢桿菌; Bacillus subtilis: 枯草芽孢桿菌; Bacillus anthracis: 炭疽桿菌; Bacillus cereus: 蠟樣芽孢桿菌。

圖6 菌株JNJX-2對不同植物病原真菌的抑制效果

表2 菌株JNJX-2對不同病原菌的抑制效果

2.5 菌株JNJX-2抑菌物質測定

2.5.1 揮發(fā)性抑菌物質測定 在不同培養(yǎng)基上接種多粘類芽孢桿菌JNJX-2，上層PDA平板中的尖孢鐮刀菌都正常生長，與不接菌的空白對照沒有任何區(qū)別(圖7)，說明菌株JNJX-2不能產生可以抑菌的揮發(fā)性物質。

圖7 菌株JNJX-2在不同培養(yǎng)基下產揮發(fā)性抑菌物質測定

2.5.2 水解酶檢測 如圖8所示，在幾丁質酶鑒定培養(yǎng)基、蛋白酶鑒定培養(yǎng)基、果膠酶鑒定培養(yǎng)基、纖維素酶鑒定培養(yǎng)基中均產生了透明水解圈，說明菌株JNJX-2可以產生幾丁質酶、蛋白酶、果膠酶以及纖維素酶。

A: 幾丁質酶鑒定培養(yǎng)基; B: 蛋白酶鑒定培養(yǎng)基; C: 果膠酶鑒定培養(yǎng)基; D: 纖維素酶鑒定培養(yǎng)基。

2.6 發(fā)酵上清液對尖孢鐮刀菌孢子的影響

經過菌株JNJX-2發(fā)酵上清液處理過的病原菌孢子表現(xiàn)為輪廓模糊，芽孢壁破碎不完整，而且不萌發(fā)(圖9A)。對照組孢子則出現(xiàn)孢子管，孢子輪廓也較清晰(圖9B)。通過發(fā)酵上清液處理后的尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)率降低，60 h的萌發(fā)率為52.67%，遠遠低于對照組的93.00%(圖10)。

A: 上清液中的尖孢鐮刀菌孢子; B: 正常尖孢鐮刀菌孢子。

2.7 菌株JNJX-2對尖孢鐮刀菌菌絲的抑制情況

由圖11可以看出，與正常菌絲相比，產生抑菌圈部分的菌絲生長受到抑制，發(fā)生不規(guī)則卷曲，并且菌絲細短、生長雜亂，易于斷裂，原生質發(fā)生凝集，菌絲頭部膨大、分節(jié)，出現(xiàn)溶菌現(xiàn)象。正常菌絲表面光滑，細長不溶斷，表現(xiàn)出很好的生長趨勢。

圖10 菌株JNJX-2的發(fā)酵上清液對尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)率的影響

2.8 萃取旋蒸法制備抑菌粗提物

將菌株JNJX-2的發(fā)酵上清液進行萃取、旋蒸，得到黃色油狀粗提物。將得到的粗提物過0.22 μm的細菌過濾器，得粗提物濾液。將粗提物濾液、粗提物、粗提物的抽提試劑甲醇及無菌水分別加入PDA固體培養(yǎng)基中，觀察抑菌效果，如圖12所示。粗提物與粗提物濾液具有相同的抑菌效果，說明粗提物內的有效成分可以穿過0.22 μm的細菌過濾器，其應該是一種小分子化合物；甲醇沒有抑菌效果，說明甲醇不會對粗提物產生影響。

A: 對峙圖; B: 抑菌圈邊緣處菌絲; C: 正常菌絲。

A: 甲醇; B: 粗提物; C: 粗提物濾液; CK: 無菌水。

2.9 粗提物的性質

如圖13所示，粗提物經不同溫度處理后，抑菌活性基本保持不變，說明粗提物具有一定的耐熱性。經不同時間紫外線照射后，粗提物的抑菌活性基本沒有變化(圖14)，說明紫外線的照射并不能影響粗提物的抑菌活性。與對照CK相比，使用胰蛋白酶、胃蛋白酶以及蛋白酶K處理過的粗提物的抑菌活性并沒有受到影響(圖15)，說明粗提物中沒有蛋白類的有效成分，而是其他物質在發(fā)揮作用。不同pH條件會對粗提物產生不同的影響(圖16)，當pH為7時活性最高；堿性環(huán)境對粗提物的影響大于酸性環(huán)境。說明粗提物具有一定的耐酸能力，但耐堿性較弱。

圖13 溫度對粗提物抑菌活性的影響

圖14 紫外線照射對粗提物抑菌活性的影響

圖15 不同蛋白酶對粗提物抑菌活性的影響

圖16 不同pH值對粗提物抑菌活性的影響

3 討論與結論

棉花枯萎病作為常見的土傳真菌病害，其在土壤中的存活時間較長，對棉花產量構成了嚴重威脅。利用生防菌防治棉花枯萎病，可以有效減少化學農藥的使用，是一種極具應用潛力的防治方法[17]。

本試驗從棉花根際土中篩選出一株對棉花枯萎病具有良好防效的生防菌株JNJX-2，鑒定為多粘類芽孢桿菌。該菌對植物病原真菌灰葡萄孢和離蠕孢菌的防效較好；對細菌中金黃色葡萄球菌的防效較好，大腸桿菌及沙門氏菌次之。JNJX-2菌株能夠分泌溶解病原真菌細胞壁的酶類，這與相關文獻上報道的芽孢桿菌可以產生幾丁質酶、β-1, 3-葡聚糖酶的結論相吻合[18，19]。有報道表明，芽孢桿菌是通過抑制病原菌絲和孢子發(fā)揮作用的，抑菌物質使菌絲發(fā)生溶斷、原生質溢出、孢子壁破碎，病原菌因此無法再侵染宿主植物[20]。通過萃取與旋轉蒸發(fā)相結合的方法，從其發(fā)酵液的萃取液中分離出具有較強抑菌能力的粗提物，該物質色澤發(fā)黃，伴有刺鼻氣味。粗提物對溫度、紫外線、水解酶類都不敏感，對酸性環(huán)境的耐受性好于堿性環(huán)境，與韋巧婕[21]的研究結果相似。

多粘類芽孢桿菌可以產生多種抗菌脂肽，且在芽孢桿菌中最具代表性，是自然界抗菌素的天然寶庫。其分泌的活性物質不僅對許多細菌和真菌有抑制活性，還能提高植物的抗病能力，促進植物生長，提高產量，并能產生多肽類抗菌物質。傳統(tǒng)農藥的使用極易導致致病菌產生抗藥性，造成惡性循環(huán)，降低農藥效率，因此高效安全的微生物農藥具有十分廣闊的應用前景。