王明清，龔魁杰，于麗娜，張初署，畢潔，宋昱，遲曉元，孫杰

(1. 山東省花生研究所，山東 青島 266100；2. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，山東 濟(jì)南 250100)

嘔吐毒素，又名脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol)，是一種主要由禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)、粉紅鐮刀菌(F.roseum)和擬枝鐮刀菌(F.sporotrichioide)等鐮刀菌產(chǎn)生的真菌毒素[1，2]。嘔吐毒素在被污染的小麥、玉米、大豆等糧食中廣泛存在，是食品和飼料中較常見的真菌毒素之一[3]。該毒素能通過影響免疫細(xì)胞增殖和免疫細(xì)胞因子生成從而降低機(jī)體的免疫力；還可抑制mRNA翻譯和調(diào)節(jié)蛋白激酶活性[4，5]，從而加速細(xì)胞凋亡，嚴(yán)重危害人和動(dòng)物健康。1998年嘔吐毒素被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為3類致癌物。因此，采取有效措施去除小麥、玉米等糧食和飼料中的嘔吐毒素，保障食品和飼料安全，對(duì)人和動(dòng)物健康具有重要意義。

由于嘔吐毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，導(dǎo)致該毒素很難在加熱等處理中被破壞和去除。目前常用的脫除方法主要分為物理法、化學(xué)法和生物法[6]，其中物理和化學(xué)方法脫除效果不穩(wěn)定，同時(shí)還會(huì)破壞糧食中的營養(yǎng)物質(zhì)，并且容易引入新的污染物[7]。生物法主要是利用微生物產(chǎn)生的酶降解嘔吐毒素[8]，該方法具有效率高、專一性強(qiáng)、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，受到廣泛關(guān)注，因此微生物降解已成為研究的熱點(diǎn)[9]。本試驗(yàn)從小麥田土壤中分離到一株高效降解嘔吐毒素的菌株，并對(duì)其降解特征進(jìn)行了研究，為其應(yīng)用于嘔吐毒素的脫除奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

土壤樣品采集自山東省青島市小麥地；鄰苯二甲酸二正辛酯購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品購自以色列Fermentek公司；Super GelRed熒光染料購自US Everbright Inc.；嘔吐毒素ELISA試劑盒購自北京華安麥科生物技術(shù)有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

液體初篩培養(yǎng)基[10](g/L)：0.25 g KH2PO4，0.25 g MgSO4·7H2O，0.5 g KNO3，0.5 g (NH4)2SO4，0.005 g CaCl2，0.003 g FeCl3·6H2O，2.0 g鄰苯二甲酸二正辛酯，pH 7.0，高壓滅菌15 min。

固體初篩培養(yǎng)基：初篩培養(yǎng)基加入2%瓊脂粉。

復(fù)篩培養(yǎng)基(g/L)：10 g蛋白胨，3 g牛肉膏，10 g NaCl，1 g KH2PO4，1 g葡萄糖，pH 7.0，高壓滅菌15 min。

1.3 降解嘔吐毒素菌株的初篩

取2 g土壤樣品于200 mL無菌水中，渦旋振蕩后取300 μL懸液至300 mL液體初篩培養(yǎng)基中，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)一周左右。當(dāng)培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁后，在固體初篩培養(yǎng)基進(jìn)行多次劃線純化，放置于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 降解嘔吐毒素菌株的復(fù)篩

將初篩獲得的菌株接種于復(fù)篩培養(yǎng)基，37℃搖床發(fā)酵48 h。取發(fā)酵菌液1 980 μL，加入20 μL嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品(濃度為200 mg/L)，使最終體系中嘔吐毒素含量為2 000 μg/L，以加入同樣濃度嘔吐毒素的空白發(fā)酵培養(yǎng)基作為對(duì)照。37℃孵育48 h后，采用嘔吐毒素ELISA試劑盒檢測嘔吐毒素含量。降解率計(jì)算公式為：

y(%)=(1-S/C)×100 。

式中，y是嘔吐毒素降解率，C是空白對(duì)照樣品中嘔吐毒素含量，S是處理樣品中嘔吐毒素含量。

1.5 菌種鑒定

1.5.1 生理生化特征 于37℃培養(yǎng)箱對(duì)嘔吐毒素降解率最高的菌株進(jìn)行培養(yǎng)，16 h后觀察菌落形態(tài)、色澤。觀察菌株革蘭氏染色反應(yīng)及其氧化酶、過氧化氫酶等活性。

1.5.2 細(xì)菌16S rRNA基因的擴(kuò)增及分析 取10 mL菌株發(fā)酵液，利用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取基因組DNA。采用通用引物27F和1492R[11]，利用PCR儀擴(kuò)增16S rRNA基因。取5 μL PCR產(chǎn)物上樣于1.0%瓊脂糖凝膠，電泳結(jié)束后通過凝膠成像系統(tǒng)觀察PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，片段大小合理的產(chǎn)物送測序公司測序。測序獲得的16S rRNA基因序列在EzTaxon-e server中進(jìn)行比對(duì)分析，然后用MEGA X 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[12]。

1.6 降解特性分析

對(duì)10 mL發(fā)酵菌體進(jìn)行高速離心，制備胞外上清液。無菌水沖洗菌體后，加入10 mL無菌水制備菌懸液。通過超聲破碎菌懸液，再經(jīng)高速離心和0.22 μm無菌濾膜過濾獲得胞內(nèi)液。上清液、菌懸液、胞內(nèi)液3種組分中分別加入嘔吐毒素，37℃孵育48 h，利用試劑盒檢測各組分去除嘔吐毒素的效果。

1.7 對(duì)小麥樣品中嘔吐毒素的降解

將嘔吐毒素超標(biāo)的小麥樣品經(jīng)研磨、滅菌，再經(jīng)40℃干燥至恒重，測量其嘔吐毒素的含量。取菌株發(fā)酵液，與上述嘔吐毒素超標(biāo)的小麥樣品按照5∶1(體積質(zhì)量比)混合；以添加等體積液體培養(yǎng)基的小麥樣品作為空白對(duì)照，37℃孵育48 h，測量樣品中嘔吐毒素的殘留量。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解嘔吐毒素菌株篩選

由圖1可知，菌株QD11、QD12、QD36、JJ15、ZJ4、ZJ5均能降解35%以上的嘔吐毒素，其中菌株QD36的降解率最高，為84.6%。因此選擇菌株QD36進(jìn)行下一步研究。

圖1 各菌株降解嘔吐毒素的能力

2.2 菌種鑒定

2.2.1 菌株QD36生理生化特征 菌株QD36在固體LB平板中生長較快，菌落凸起，乳白色，不透明，呈現(xiàn)皺褶(圖2)，該特征是芽孢桿菌的典型特征之一。革蘭氏染色呈陽性，具有氧化酶和過氧化氫酶活性。

圖2 菌株QD36的菌落形態(tài)

2.2.2 菌株QD36的16S rRNA基因鑒定 利用凝膠成像系統(tǒng)觀察16S rRNA基因的PCR產(chǎn)物，在約1 500 bp處獲得一條特異性擴(kuò)增條帶(圖3)。測序結(jié)果(圖4)表明菌株QD36與芽孢桿菌屬的菌株處于同一大的分支，其中與標(biāo)準(zhǔn)菌株BacillussiamensisPD-A10T聚類在一起，相似度高達(dá)99.9%。結(jié)合生理生化特征和16S rRNA基因分析結(jié)果，菌株QD36被命名為暹羅芽孢桿菌QD36(BacillussiamensisQD36)。

1, 2: 菌株QD36的16S rRNA基因; M: DL2000 DNA Marker。

2.3 菌株QD36降解特性

比較菌株QD36不同組分去除嘔吐毒素的能力，由圖5可知，上清液、菌懸液、胞內(nèi)液可分別去除84.1%、13.9%和6.5%的嘔吐毒素。該結(jié)果表明菌株QD36分泌至胞外的活性物質(zhì)主導(dǎo)嘔吐毒素的生物降解。

Bacillussiamensis: 暹羅芽孢桿菌;Bacillusvanillea: 香草芽孢桿菌;Bacillusvelezensis: 貝萊斯芽孢桿菌;Bacillusamyloliquefaciens: 解淀粉芽孢桿菌;Bacillusnakamurai: 中村芽孢桿菌;Bacillusthuringiensis: 蘇云金芽孢桿菌;Bacillusmycoides: 蕈狀芽孢桿菌;Bacilluscirculans: 環(huán)太芽孢桿菌;Bacilluscoagulans: 凝結(jié) 芽孢桿菌;Alicyclobacillusacidocaldarius: 酸熱脂環(huán)酸桿菌。

圖4菌株QD36的16SrRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹

圖5 菌株QD36各組分嘔吐毒素降解率

2.4 菌株QD36降解小麥中嘔吐毒素試驗(yàn)

以嘔吐毒素超標(biāo)的小麥樣品為研究對(duì)象，經(jīng)48 h處理后，空白對(duì)照樣品S1的嘔吐毒素含量為2 530 μg/kg，加入菌株QD36處理的樣品S2嘔吐毒素含量為456 μg/kg(圖6)，降解率為82.0%。以上結(jié)果表明，菌株QD36能顯著降解小麥樣品中的嘔吐毒素，具有去除嘔吐毒素的潛力。

S1: 空白對(duì)照; S2: 加入菌株QD36處理的樣品。

3 討論與結(jié)論

被嘔吐毒素污染的小麥、玉米等糧食和飼料嚴(yán)重危害人和動(dòng)物健康。由于物理、化學(xué)處理方法有多種缺點(diǎn)，因此生物法去除嘔吐毒素越來越受到研究人員的重視。梁含等[13]篩選了3株嘔吐毒素降解菌，分別是解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、植物乳酸菌，其中枯草芽孢桿菌和植物乳酸菌組合對(duì)麩皮發(fā)酵處理可降解71%的嘔吐毒素。李曉鳳等[14]從土壤中篩選了一株腸桿菌，可降解40.4%的嘔吐毒素。譚劍等[9]篩選到一株枯草芽孢桿菌，該菌發(fā)酵液可降解玉米漿中80%的嘔吐毒素。余祖華等[15]篩選到一株蠟樣芽孢桿菌，可降解飼料中82.68%的嘔吐毒素。付苗苗等[16]從土壤中篩選到一株膿桿菌，可降解64.6%的嘔吐毒素，起降解作用的物質(zhì)主要存在于發(fā)酵上清液中。

本研究通過初篩和復(fù)篩從青島小麥地土壤中篩選到多株降解嘔吐毒素的菌株，其中菌株QD36具有較強(qiáng)的降解能力，可降解84.6%的嘔吐毒素，相對(duì)于已報(bào)道的多株降解菌株，該菌降解效率較高；結(jié)合生理生化特征和16S rRNA基因測序結(jié)果，菌株QD36鑒定為暹羅芽孢桿菌(Bacillussiamensis)。該菌株對(duì)嘔吐毒素降解的活性物質(zhì)主要存在于上清液中，具有很好的應(yīng)用潛力。本研究為去除糧食和飼料中的嘔吐毒素提供了菌種資源。