王貴芳，相昆，穆清泉，韓玉濤，張美勇，徐穎，許海峰，劉慶忠，陳新

(1.山東省果樹研究所/國家果樹種質(zhì)核桃板栗資源圃，山東 泰安 271000；2.臨沂市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東 臨沂 276012；3.臨沂市檢驗(yàn)檢測中心，山東 臨沂 276000)

核桃 (JuglansregiaL.) 為核桃科核桃屬多年生落葉喬木，是世界著名的四大干果之一，同時(shí)也是世界重要的木本油料樹種之一。核桃在中國栽培地域廣泛，歷史悠久，栽培面積大，綜合利用范圍廣。其堅(jiān)果富含氨基酸、脂肪酸及礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，具有較高的食用價(jià)值和醫(yī)療保健價(jià)值。前人研究證實(shí)核桃的保健價(jià)值主要在于核桃仁中富含豐富的不飽和脂肪酸，如亞油酸、α-亞麻酸及油酸等[1,2]。核桃中的不飽和脂肪酸在降低膽固醇、預(yù)防和緩解心腦血管疾病、糖尿病和肥胖癥方面具有重要功效[3-7]。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，生活水平不斷提升，人們更關(guān)注是否吃得健康，核桃作為一種天然營養(yǎng)保健食品，備受消費(fèi)者青睞。

國內(nèi)核桃主栽品種良莠不齊，導(dǎo)致在品質(zhì)表現(xiàn)上與發(fā)達(dá)國家如美國、法國等的核桃有一定差距，因此，選育優(yōu)質(zhì)核桃新品種成為科學(xué)家的主要育種目標(biāo)。分析研究核桃脂肪酸構(gòu)成因子及其相關(guān)性，對不同品種進(jìn)行品質(zhì)評價(jià)，可以為選育優(yōu)質(zhì)核桃新品種提供理論參考。陳振超等[8]選取7種木本油料樹種，測定了油脂相關(guān)指標(biāo)(脂肪酸組成、角鯊烯、β-谷甾醇和α-生育酚)，結(jié)果表明茶籽油棕櫚酸含量(16.22%)最高，油茶籽油的油酸含量(80.55%)最高，核桃油的亞油酸含量(59.13%)最高。駱翔等[9]以66個(gè)不同地理來源的核桃品種為試材，研究了脂肪酸含量、蛋白質(zhì)含量、產(chǎn)量相關(guān)性狀間的關(guān)系，表明脂肪酸含量與蛋白質(zhì)含量在0.01水平上顯著負(fù)相關(guān)，但并未對其脂肪酸組成進(jìn)行研究。蘇彥蘋等[10]采用索氏抽提法和氣相色譜法測定26份不同基因型新疆核桃的脂肪含量及脂肪酸組成，結(jié)果表明新疆核桃脂肪酸主要包括 C16∶0、C18∶0、C20∶0、順C18∶1n9c、C20∶1、順C18∶2n6c及αC18∶3n3，且部分基因型新疆核桃間脂肪含量差異顯著。費(fèi)昭雪和彭少兵[11]通過對陜南11份核桃外觀性狀、營養(yǎng)成分以及核桃油中脂肪酸的組成與含量進(jìn)行測定，并應(yīng)用主成分分析和聚類分析對不同產(chǎn)地的核桃油脂性狀進(jìn)行評價(jià)，結(jié)果表明不同產(chǎn)地核桃油脂的脂肪酸組成基本一致，主要含有亞油酸，其次是油酸、亞麻酸和棕櫚酸，硬脂酸含量較低；不飽和脂肪酸含量遠(yuǎn)高于飽和脂肪酸，不同樣品間各脂肪酸含量有顯著差異。

本研究以53份核桃種質(zhì)(48個(gè)優(yōu)良單株、無性系及國內(nèi)品種，5個(gè)引進(jìn)品種)為試材，通過回歸分析、聚類分析、主成分分析研究了核桃脂肪酸組分群體水平上的表型變異、組分間的相關(guān)性、群體結(jié)構(gòu)效應(yīng)對脂肪酸組分的影響，旨在為選育脂肪含量高、脂肪酸組成及比例合理的核桃品種提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試材選取山東省果樹研究所金牛山核桃種質(zhì)資源圃的53份核桃種質(zhì)(表1)，主要為近年來國內(nèi)外育成品種和資源考察過程中收集的農(nóng)家品系。采用隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每份材料3株，株行距 3 m×4 m。 2019年9月果實(shí)成熟時(shí)，每株隨機(jī)采集發(fā)育正常的果實(shí)10個(gè)(每份種質(zhì)共30個(gè))，自然曬干，剝殼，取仁，將核仁混合裝，用于脂肪酸檢測。

1.2 脂肪酸含量測定

采用索氏抽取法提取油脂：準(zhǔn)確稱取5.00 g核仁樣品放入濾紙包中，用無水乙醚提取8 h后取出濾紙包于45℃烘箱中烘干，留取油樣用于脂肪酸含量(%)測定。

采用氣相色譜法測定脂肪酸組分及含量：取上述油樣100 μL于10 mL具塞試管中，加入1 mL甲酯化試劑(0.5 mol/L氫氧化鉀甲醇溶液)和2 mL乙醚，放置2 h；隨后加入5 mL蒸餾水將溶液分層，分離獲得有機(jī)相，備用。取1 mL有機(jī)相，使用氣相色譜，采用內(nèi)標(biāo)法測定脂肪酸組分及相對含量。標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜條件：色譜柱AB-FFAP彈性石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序：初始柱溫50℃保持1 min，之后以15 ℃/min升至200℃并保持45 min；氣化溫度為250℃；FID檢測器溫度270℃；載氣為氮?dú)?，壓?37.9 kPa；橫流模式，分流比為20∶1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

核桃脂肪酸含量變異及相關(guān)分析采用SPSS 19.0(IBM Corp.，Armonk，NY，USA)軟件。聚類分析采用R(https://cran.r-project.org/)中的“hclust”命令[12]；聚類分析熱圖的繪制采用R中的“pheatmap”包；主成分分析采用R中的“prcomp”功能[13]；樣本間t測驗(yàn)采用R中的“ggpubr”包；相關(guān)回歸分析采用R中的“l(fā)m_eqn”包。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃不同品種核仁脂肪酸組分檢測

通過對53份核桃種質(zhì)的核仁脂肪酸組分測定，共檢測到亞油酸、油酸、亞麻酸、棕櫚酸、硬脂酸、棕櫚油酸、花生烯酸7種組分，總含量可達(dá)核仁油脂總量的99%以上(表1)。其中，亞油酸、油酸、亞麻酸和棕櫚酸為核仁脂肪酸的主要構(gòu)成成分(表2)，變異幅度分別為55.93%～69.74%、10.98%～29.32%、5.81%～13.92%和4.80%～7.44%；亞油酸變異系數(shù)最小，其次為棕櫚酸，分別為0.05和0.08；油酸和亞麻酸變異系數(shù)較大，分別為0.25和0.19。棕櫚油酸和花生烯酸平均含量較少，分別僅占0.13%和0.21%，變異系數(shù)分別為0.12和0.13。綜合表2和圖1結(jié)果，群體水平上同一種植區(qū)核桃品種核仁亞油酸和棕櫚酸含量變異相對較穩(wěn)定；油酸及亞麻酸變異幅度較大，具備較大的改良空間。

表1 核桃群體核仁脂肪酸組分統(tǒng)計(jì) (%)

表2 核桃群體核仁脂肪酸組分描述性統(tǒng)計(jì)

2.2 核桃不同品種核仁脂肪酸組分相關(guān)性分析

由表3可見，棕櫚油酸與油酸顯著正相關(guān)(P<0.01)，而與亞油酸、亞麻酸、花生烯酸顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)；油酸與亞油酸、亞麻酸顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)分別達(dá)到-0.91和-0.61；花生烯酸與棕櫚酸顯著負(fù)相關(guān)，而與硬脂酸顯著正相關(guān)(P<0.01)；其余脂肪酸組分間無顯著相關(guān)性?？梢?，提高油酸含量有助于增加棕櫚油酸的含量，但抑制亞油酸和亞麻酸含量的提高?；貧w分析(圖2)表明，油酸可以分別解釋亞麻酸和亞油酸表型變異的37.0%和82.5%。綜上，改良亞油酸時(shí)應(yīng)兼顧油酸與棕櫚油酸的含量；考慮到花生烯酸、棕櫚油酸及硬脂酸占比較少，在改良核桃油脂性狀時(shí)可以優(yōu)先考慮棕櫚酸。

圖1 核桃群體的核仁脂肪酸組分表型變異

表3 核桃群體核仁脂肪酸組分間的相關(guān)性

2.3 群體結(jié)構(gòu)分析

主成分分析的目的之一就是利用原變量間具有較強(qiáng)相關(guān)性的特點(diǎn)進(jìn)行降維，用少量的因素來描述多種指標(biāo)或因素之間的關(guān)系。由圖3可見，棕櫚油酸、花生烯酸、棕櫚酸和硬脂酸聚為一類，與油酸、亞油酸及亞麻酸分開。結(jié)合表型變異信息，證實(shí)亞油酸、油酸、亞麻酸和棕櫚酸為影響種群結(jié)構(gòu)的主要因子。

基于亞油酸、油酸、亞麻酸和棕櫚酸進(jìn)行聚類，53份核桃種質(zhì)可以分為兩個(gè)亞群——group_1和group_2，group_1包含28個(gè)材料，group_2包含25個(gè)材料(圖4A)。t測驗(yàn)結(jié)果(圖4B)表明，亞油酸、油酸和亞麻酸含量在兩個(gè)亞群間存在顯著差異(P< 0.01)，棕櫚酸兩個(gè)亞群間無顯著差異。group_1的亞油酸和亞麻酸含量顯著高于group_2，但油酸含量顯著低于group_2。可見，要培育高亞油酸和亞麻酸含量的核桃新品種時(shí)可以從group_1中選取材料進(jìn)行雜交，而要選育高油酸含量的核桃新品種時(shí)可基于group_2中的材料進(jìn)行雜交。

圖2 核桃群體核仁脂肪酸組分間相關(guān)回歸分析結(jié)果

圖3 核桃群體核仁脂肪酸組分主成分分析

3 討論

本研究對53份核桃種質(zhì)的脂肪酸組分進(jìn)行測定，共檢測到亞油酸、油酸、亞麻酸、棕櫚酸、硬脂酸、棕櫚油酸及花生烯酸7種成分，總含量可達(dá)核仁油脂總量的99%以上，其中，亞油酸、油酸、亞麻酸和棕櫚酸為核桃脂肪酸組成的主要決定因子，這與費(fèi)昭雪等[11]的研究結(jié)果一致。核桃脂肪含量、脂肪酸組成及質(zhì)量分?jǐn)?shù)受產(chǎn)地等自然環(huán)境因素影響較大[14-16]，本研究結(jié)果也顯示，不同來源種質(zhì)的脂肪酸組分含量存在差異，尤其油酸和亞麻酸變異幅度較大，具備較大的改良空間，因此，在評估脂肪酸組分分子遺傳效應(yīng)，進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇育種時(shí)應(yīng)考慮環(huán)境因子的影響。核桃種質(zhì)核仁的亞油酸含量變異較穩(wěn)定，王曉燕等[17]對西藏核桃核仁的研究也得到類似結(jié)果。可見，不同種質(zhì)核桃核仁在功能性物質(zhì)合成上具有一定差異，種質(zhì)間存在著明顯的分層結(jié)構(gòu)，從而影響核仁脂肪酸組分含量的表型變異，精確解析其群體結(jié)構(gòu)特征，可為選育優(yōu)質(zhì)核桃新品種提供理論參考。

4 結(jié)論

從核桃核仁中可以檢測出亞油酸、油酸、亞麻酸、棕櫚酸、硬脂酸、棕櫚油酸及花生烯酸7種脂肪酸，其中亞油酸、油酸、亞麻酸和棕櫚酸是其脂肪酸構(gòu)成的主要決定因子；群體水平上亞油酸含量變異相對穩(wěn)定，而油酸和亞麻酸變異較大，改良潛力較大。試驗(yàn)的53份核桃種質(zhì)可聚為兩個(gè)亞群，第一亞群的亞油酸和亞麻酸含量顯著高于第二亞群，而第二亞群的油酸含量顯著高于第一亞群，且相關(guān)分析表明油酸與亞油酸、亞麻酸顯著負(fù)相關(guān)，因此，今后在選育核桃新品種時(shí)可以根據(jù)不同需求側(cè)重不同的目標(biāo)性狀。本研究結(jié)果可為選育脂肪含量高、脂肪酸組成及比例合理的核桃新品種提供一定的理論參考。

圖4 核桃群體聚類分析(A)及不同亞群間脂肪酸組分差異性分析(B)