郭佩，何寧寧，夏玉軍#

1青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266071

2煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院放射科，山東 煙臺(tái) 264000

結(jié)直腸癌又稱大腸癌，是結(jié)腸癌和直腸癌的總稱，是人類最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一。在中國(guó)，隨著經(jīng)濟(jì)水平的提高以及生活方式的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率逐年上升。目前，結(jié)直腸癌的主要診斷方法包括腸鏡檢查、磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）和異常隱窩病灶（aberrant crypt foci，ACF）檢查。目前對(duì)結(jié)直腸癌的早期診斷仍然缺乏一種高敏感性的方法。腫瘤標(biāo)志物存在于組織、血液、體液和尿液中，對(duì)腫瘤的早期診斷、預(yù)后和療效評(píng)估具有重要作用。組織激肽釋放酶家族（kallikrein-related peptidase，KLK）也稱為激肽釋放酶，屬于絲氨酸蛋白酶，它們廣泛存在于機(jī)體的各個(gè)組織中，主要參與調(diào)控心血管、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)等的生理功能。KLK的異常表達(dá)與心臟病、腎病、炎癥反應(yīng)、惡性腫瘤等疾病的發(fā)生有著密切聯(lián)系，尤其是在腫瘤中，KLK異常表達(dá)提示其可作為臨床上腫瘤早期診斷的標(biāo)志物。已有研究證明，KLK5、KLK10、KLK11的異常表達(dá)與卵巢癌密切相關(guān)，KLK6的高表達(dá)與胃癌的增殖和遷移密切相關(guān)，KLK3可以作為前列腺癌診斷的生物標(biāo)志物，KLK7的高表達(dá)與結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲密切相關(guān)。雖然人們對(duì)KLK與各種惡性腫瘤的關(guān)系進(jìn)行了一些研究，但是對(duì)KLK家族基因在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系未進(jìn)行過(guò)系統(tǒng)分析。ONCOMINE數(shù)據(jù)庫(kù)是目前世界上最大的腫瘤基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)和整合數(shù)據(jù)提取平臺(tái)。TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)是目前世界上最大的腫瘤基因組信息數(shù)據(jù)庫(kù)。STRING數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)搜尋蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)之間相互作用的系統(tǒng)，以幫助研究人員更加深入地認(rèn)清相關(guān)蛋白質(zhì)的功能和其調(diào)控機(jī)制。GEO是功能基因組學(xué)的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)庫(kù)，可以查詢和下載樣本信息以及基因組的表達(dá)概況。本研究利用ONCOMINE、TCGA及GEO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，分析人KLK基因在結(jié)直腸癌中的表達(dá)和預(yù)后意義，以及KLK作為結(jié)直腸癌標(biāo)志物的可能性，為研究KLK基因在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供線索和思路，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 利用ONCOMINE數(shù)據(jù)庫(kù)提取數(shù)據(jù)

在ONCOMINE v4.5數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行注冊(cè)，獲得數(shù)據(jù)庫(kù)的使用權(quán)限。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求設(shè)定搜索條件，設(shè)定篩選條件。①Gene：KLK1-KLK15（依次檢索KLK家族的基因）；②THRESHOLD（P-VALUE）：0.01；③THRESHOLD（FOLD CHANGE）：2；④ THRESHOLD（GENE RANK）：ALL；⑤ Data Type：All。

1.2 分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中人KLK 基因在結(jié)直腸癌組織和正常結(jié)直腸組織中的表達(dá)情況

登錄TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)（版本v71），獲得人KLK基因在結(jié)直腸癌組織和正常結(jié)直腸組織中的表達(dá)數(shù)據(jù)。

1.3 分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中人KLK 基因表達(dá)及其與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系

登錄UALCAN在線分析工具（http://ualcan.path.uab.edu/index.html），選擇TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的研究，設(shè)定篩選條件。①Select Cancer Study：Colorectal cancer；②Select Genomic Profiles：Expression；③Kaplan-Meier生存曲線：Survival。然后以PDF格式導(dǎo)出。

1.4 分析GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中KLK 基因表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系

選擇GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）的GSE39582系列數(shù)據(jù)，這個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)包括585個(gè)結(jié)直腸癌樣本。此數(shù)據(jù)系列還具有分子亞型分類以及臨床生存特征等信息。下載數(shù)據(jù)庫(kù)后，利用R軟件（https://www.r-project.org/，版本：3.5.3）分析KLK基因表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系。根據(jù)基因的中位表達(dá)數(shù)，分為高表達(dá)和低表達(dá)。

1.5 從STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)中提取KLK6、KLK8和KLK10基因相關(guān)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)

進(jìn)入STRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/），設(shè)定查找條件。①基因名稱：KLK6、KLK8和KLK10；②物種：homo（人種）；③證據(jù)來(lái)源（active interaction sources）：選擇實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（Experiments）。從而得到KLK基因相關(guān)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)。

1.6 臨床組織的獲取

臨床組織樣本來(lái)自于煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院，且是在患者知情同意且簽署知情同意書(shū)的情況下取得的。研究方案得到了青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。2018年6月至2019年5月，共收集了24例組織樣本，包括20例結(jié)直腸癌組織和4例正常結(jié)直腸組織。手術(shù)之前，患者未進(jìn)行任何化療或放療。在手術(shù)切除后，組織樣本立即被冷凍在液氮中，保存于-80℃，供后續(xù)研究。

1.7 mRNA 提取和定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

根據(jù)mirVana miRNAIsolation kit（購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司）的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，從組織中提取RNA。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒[購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司]進(jìn)行cDNA的合成。采用Nanodrop測(cè)定cDNA的濃度。產(chǎn)物保存于-80℃，用于下一步的實(shí)驗(yàn)。使用試劑盒Power SYBR-Green PCR Master Mix（購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司）以及適當(dāng)?shù)囊镞M(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，采用ABI7500-fast thermocycler（購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的采集。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參，引物見(jiàn)表1。

表1 KLK和GAPDH基因的引物序列

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graphpad Prism 5及SPSS 24.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)及四分位數(shù)[

M

（

Q

，

Q

）]表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)；符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（

x-

±

s

）表示，組間比較采用

t

檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用Logrank檢驗(yàn)。采用AdobeIllustrator CS4軟件對(duì)圖片進(jìn)行整理。以

P

＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人KLK 基因在各種腫瘤類型中的表達(dá)

在ONCOMINE v4.5數(shù)據(jù)庫(kù)中共收集了包括乳腺癌、結(jié)直腸癌和肺癌等20個(gè)不同腫瘤類型的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。結(jié)果顯示，

KLK6

、

KLK8

、

KLK10

和

KLK11

基因在結(jié)直腸癌組織中具有高水平的表達(dá)，

KLK7

和

KLK12

具有相對(duì)較高的表達(dá)水平，

KLK1

和

KLK15

具有較低的表達(dá)水平。其中

KLK6

在13組數(shù)據(jù)、

KLK8

在6組數(shù)據(jù)，

KLK10

在17組數(shù)據(jù)、

KLK11

在10組數(shù)據(jù)中顯示具有高水平的表達(dá)（且基因排序超過(guò)1%）。（圖1）

圖1 ONCOMINE數(shù)據(jù)庫(kù)中人KLK 基因在各種腫瘤類型中的表達(dá)情況

2.2 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中人KLK 基因在結(jié)直腸癌組織和正常結(jié)直腸組織中的表達(dá)情況

在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取人

KLK

基因在結(jié)直腸癌組織和正常結(jié)直腸組織中的表達(dá)結(jié)果，對(duì)具有顯著性差異的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中人

KLK6

、

KLK7

、

KLK8

、

KLK10

、

KLK11

和

KLK12

基因的表達(dá)水平均明顯高于正常結(jié)直腸組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.01）。（表2）

表2 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中人KLK基因在結(jié)直腸癌組織和正常結(jié)直腸組織中的表達(dá)情況

2.3 人KLK 基因表達(dá)與結(jié)直腸癌預(yù)后的關(guān)系

為進(jìn)一步明確人

KLK

基因表達(dá)與結(jié)直腸癌預(yù)后的關(guān)系，本研究利用UALCAN在線工具分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中人

KLK

mRNA表達(dá)水平與結(jié)直腸癌預(yù)后的相關(guān)數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，

KLK

基因表達(dá)與結(jié)直腸癌預(yù)后無(wú)關(guān)。TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)包括121例具有預(yù)后信息的結(jié)直腸癌組織，進(jìn)一步選擇GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的GSE39582系列數(shù)據(jù)，此系列數(shù)據(jù)包括578例具有預(yù)后信息的結(jié)直腸癌組織。利用R軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，結(jié)果顯示，

KLK6

、

KLK8

、

KLK10

和

KLK12

基因低表達(dá)患者的預(yù)后分別優(yōu)于上述基因高表達(dá)的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

=0.0008、0.0392、0.0013、0.0203）（圖2）。

圖2 人KLK 基因高表達(dá)與低表達(dá)結(jié)直腸癌患者的生存曲線

2.4 臨床樣本中人KLK 基因在結(jié)直腸癌組織和正常結(jié)直腸組織中的表達(dá)

為進(jìn)一步驗(yàn)證

KLK

基因在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況，對(duì)臨床收集的20例結(jié)直腸癌組織和4例正常結(jié)直腸組織進(jìn)行定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)。結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中

KLK1

基因的表達(dá)水平低于正常結(jié)直腸組織，

KLK6

、

KLK7

、

KLK8

、

KLK10

和

KLK11

基因的表達(dá)水平均高于正常結(jié)直腸組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）（表3）。綜合數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果和臨床樣本驗(yàn)證的結(jié)果，

KLK6

、

KLK8

和

KLK10

基因具有很高的可能性作為結(jié)直腸癌標(biāo)志物。

表3 臨床樣本中人KLK基因在結(jié)直腸癌組織和正常結(jié)直腸組織中的表達(dá)水平

2.5 KLK6、KLK8和KLK10基因相關(guān)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)

為了進(jìn)一步明確與KLK6、KLK8和KLK10相互作用的蛋白，通過(guò)挖掘STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建KLK6、KLK8和KLK10蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果表明，KLK6和5個(gè)蛋白[YY1關(guān)聯(lián)因子2（YY1 associated factor 2，YAF2）、α-突觸核蛋白（alpha-synuclein，SNCA）、α2-巨球蛋白樣蛋白 1（alpha-2-macroglobulin like protein 1，A2ML1）、絲氨酸蛋白酶抑制劑Kazal型5（serine peptidase inhibitor Kazal type 5，SPINK5）和絲氨酸蛋白酶抑制劑Kazal 型 9（serine peptidase inhibitor Kazal type 9，SPINK9）]相關(guān)，KLK10 和 2 個(gè)蛋白（SPINK5 和KLK8）相關(guān)，KLK8和8個(gè)蛋白[SPINK5、SPINK9、KLK5、半胱天冬酶 1（caspase-1，CASP1）、半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域16（caspase recruitment domain 16，CARD16）、絲氨酸蛋白酶抑制劑B6（serine proteinase inhibitor B6，SERPINB6）、絲氨酸蛋白酶抑制劑B5（serine proteinase inhibitor B5，SERPINB5）和KLK10]相關(guān)。進(jìn)一步對(duì)KLK6、KLK8和KLK10相關(guān)的10個(gè)相互作用蛋白的生物學(xué)功能進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這些相互作用分子主要參與對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)。（圖3）

圖3 KLK6、KLK8和KLK10基因相關(guān)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

結(jié)直腸癌是臨床上一種常見(jiàn)的消化道腫瘤，對(duì)人類的健康和生命危害極大，并且經(jīng)常伴隨多種并發(fā)癥。結(jié)直腸癌的醫(yī)學(xué)研究一直是腫瘤研究的熱點(diǎn)之一。目前治療結(jié)直腸癌的主要方法是外科手術(shù)和結(jié)腸鏡治療，結(jié)直腸癌可經(jīng)手術(shù)治愈，但術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高，可達(dá)40%～50%。因此，早期發(fā)現(xiàn)是治療結(jié)直腸癌的關(guān)鍵，提前發(fā)現(xiàn)將會(huì)發(fā)生癌變的患者是醫(yī)學(xué)的研究重點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)有效的結(jié)直腸癌標(biāo)志物對(duì)了解腫瘤成因及患者預(yù)后具有關(guān)鍵作用。

20世紀(jì)90年代中期發(fā)展起來(lái)的基因組學(xué)是生物信息學(xué)的主要研究?jī)?nèi)容之一。在病理生理、疾病檢測(cè)、藥物開(kāi)發(fā)、疾病預(yù)防和功能基因組方面得到了廣泛的應(yīng)用。在腫瘤研究領(lǐng)域，利用公開(kāi)的組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)尋找腫瘤標(biāo)志物成為目前科學(xué)研究的重要手段之一。本研究通過(guò)ONCOMINE數(shù)據(jù)庫(kù)的整合分析發(fā)現(xiàn)，KLK6、KLK8、KLK10和KLK11基因在結(jié)直腸癌組織中具有高水平的表達(dá)，KLK7和KLK12基因具有相對(duì)較高的表達(dá)水平。通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)收集KLK mRNA在結(jié)直腸癌組織和正常結(jié)直腸組織中的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中人 KLK6、KLK7、KLK8、KLK10、KLK11和KLK12基因的表達(dá)水平均明顯高于正常結(jié)直腸組織（P＜0.01）。TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)雖然是目前世界上最大的腫瘤基因組信息數(shù)據(jù)庫(kù)，但是它只有121例具有預(yù)后信息的結(jié)直腸癌組織，因此，本研究進(jìn)一步選擇了GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中包括578例具有預(yù)后信息的結(jié)直腸癌組織的GSE39582系列數(shù)據(jù)進(jìn)行生存分析，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KLK6、KLK8、KLK10和KLK12基因低表達(dá)患者的預(yù)后分別優(yōu)于上述基因高表達(dá)的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。本研究還對(duì)臨床收集的結(jié)直腸癌組織和正常結(jié)直腸組織樣本中的KLK基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中KLK6、KLK7、KLK8、KLK10和KLK11基因的表達(dá)水平均高于正常結(jié)直腸組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。綜合分析，KLK6、KLK8和KLK10基因具有很大的可能性作為結(jié)直腸癌標(biāo)志物。之前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)KLK6在結(jié)直腸癌中具有較高的表達(dá)水平以及靶向KLK6作為結(jié)直腸癌治療策略的可能性。另外，本研究通過(guò)挖掘STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建了KLK6、KLK8和KLK10基因相關(guān)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)圖。通過(guò)分析相關(guān)的10個(gè)相互作用蛋白的生物學(xué)功能，進(jìn)一步證明了KLK6、KLK8和KLK10對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡具有調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)公共數(shù)據(jù)庫(kù)中腫瘤相關(guān)基因信息和預(yù)后信息深入挖掘，發(fā)現(xiàn)KLK6、KLK8和KLK10基因在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，且與結(jié)直腸癌患者的預(yù)后有關(guān)，將為進(jìn)一步闡明KLK6、KLK8和KLK10在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用奠定理論基礎(chǔ)。