趙志龍，王剛，張宏亨

寶雞市中心醫(yī)院腫瘤外科，陜西寶雞 721000

近年來，中國(guó)惡性腫瘤的發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重危害著人類的生命與健康，作為八大常見腫瘤之一的食管癌，在所有惡性腫瘤中的病死率居第6位，中國(guó)主要的高發(fā)地區(qū)為山西及河南。食管癌具有起病隱匿、惡性程度高、預(yù)后差、生存率低等特點(diǎn)。因此，尋找一種特異性表達(dá)于食管鱗狀細(xì)胞癌的分子標(biāo)志物，對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌的早期診斷、靶向治療及預(yù)后判斷尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)，鈉尿肽受體 A（natriuretic peptide receptor A，NPRA）在多種人類腫瘤細(xì)胞株中均高表達(dá)，參與前列腺癌、肺癌、黑色素瘤等的發(fā)生、發(fā)展，發(fā)揮著癌基因的作用，但其在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)情況目前尚不明確。本研究探討了NPRA在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)情況及其對(duì)食管癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2011年2月至2015年11月寶雞市中心醫(yī)院收治的食管鱗狀細(xì)胞癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)術(shù)后病理檢查證實(shí)為食管鱗狀細(xì)胞癌；術(shù)前無化療、放療及免疫治療史；臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入119例食管鱗狀細(xì)胞癌患者。其中，男85例，女34例；年齡為49～72歲，中位年齡為64歲；TNM分期：I期40例，Ⅱ期47例，Ⅲ期32例；組織學(xué)分化程度：G級(jí)37例，G級(jí)53例，G級(jí)29例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移53例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移66例。收集患者的食管鱗狀細(xì)胞癌組織119例和癌旁組織91例。其中，癌旁組織為距食管鱗狀細(xì)胞癌組織邊緣2 cm以上的食管組織，病理證實(shí)無腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)，無明顯炎癥，無明顯細(xì)胞增生等病變，其所呈現(xiàn)的為正常組織表現(xiàn)。

1.2 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)NPRA的表達(dá)及結(jié)果判定

取食管鱗狀細(xì)胞癌組織和癌旁組織標(biāo)本，采用甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，制備4 μm切片，采用免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)（streptavidin-perosidase，SP）法進(jìn)行染色，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。NPRA兔抗人多克隆抗體購自美國(guó)Santa公司，NPRA抗體稀釋濃度為1∶200。采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）作為陰性對(duì)照。SP試劑盒與二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色劑均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。NPRA陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中，呈黃色顆粒。隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，陽性細(xì)胞百分比評(píng)分：0%～24%為1分，25%～49%為2分，50%～74%為3分，≥75%為4分；染色強(qiáng)度評(píng)分：無色為0分，棕黃色1分，褐色為2分。陽性細(xì)胞百分比評(píng)分與染色強(qiáng)度評(píng)分相乘，0～3分為低表達(dá)，4～8分為高表達(dá)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

食管癌細(xì)胞株Eca109、TE-1以及正常食管上皮細(xì)胞株Het-1A均由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。將細(xì)胞置于含10%胎牛血清 、100 μg/ml鏈霉素和 100 U/ml青霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。定期換液，使用2.5 g/L胰蛋白酶[含0.2 g/L乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）]離散細(xì)胞并用于傳代。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)NPRA的表達(dá)情況

將接近長(zhǎng)滿瓶底的單層貼壁細(xì)胞用PBS輕緩洗滌2次，加入含苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）的RIPA細(xì)胞裂解液，冰浴30 min，將細(xì)胞刮下置入EP管中，4℃、12 000 r/min離心15 min，取上清，置于超微量紫外分光光度計(jì)中，定量測(cè)定總蛋白濃度。取50 μg蛋白，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）后，半干法轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。將轉(zhuǎn)好的蛋白印跡膜在室溫下用50 g/L脫脂牛奶封閉1.5 h，應(yīng)用脫脂牛奶稀釋的一抗4℃孵育過夜，PBST洗膜10 min，共4次，應(yīng)用PBST稀釋的二抗室溫孵育1.5 h，洗膜10 min，共3次，電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）檢測(cè)，X 光片顯影，掃描圖像，分析結(jié)果。使用Image J軟件分析條帶灰度值，以β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）為內(nèi)參，設(shè)定3個(gè)復(fù)孔，NPRA蛋白表達(dá)水平為NPRA蛋白條帶灰度值/βactin蛋白條帶灰度值。

1.5 NPRA 沉默序列的設(shè)計(jì)

采用短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）沉默食管癌細(xì)胞株Eca109細(xì)胞中NPRA基因表達(dá)。根據(jù)GenBank中提供的NPRA mRNA序列，提交并委托上海吉?jiǎng)P生物有限公司設(shè)計(jì)并合成針對(duì)NPRA基因的沉默序列3條（sh-NPRA21897、sh-NPRA21898、sh-NPRA21899），并附1條NC序列作為陰性對(duì)照。分別將其轉(zhuǎn)染至食管癌細(xì)胞株Eca109中，作為sh-NPRA21897組、sh-NPRA21898組、sh-NPRA21899組及sh-NPRA-NC組。

1.6 Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)食管癌細(xì)胞株Eca109的遷移和侵襲能力

在Transwell小室中進(jìn)行細(xì)胞遷移和侵襲試驗(yàn)，sh-NPRA21897組、sh-NPRA21898組、sh-NPRA21899組及sh-NPRA-NC組食管癌細(xì)胞株Eca109成功轉(zhuǎn)染后，放入Transwell小室的上室，底部加入血清以誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行遷移。然后培養(yǎng)8 h或24 h，細(xì)胞遷移到下室后用10%甲醛溶液固定，并采用0.5%結(jié)晶紫水合物溶液進(jìn)行染色計(jì)數(shù)。

1.7 隨訪

所有患者出院后均進(jìn)行5年隨訪，隨訪方式為電話或門診隨訪，隨訪截止時(shí)間為2020年1月。統(tǒng)計(jì)患者的生存情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用

χ

檢驗(yàn)或Fisher確切概率法；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)。以

P

＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗狀細(xì)胞癌組織和癌旁組織中NPRA表達(dá)情況的比較

食管鱗狀細(xì)胞癌組織中，NPRA陽性顆粒呈棕黃色或淡黃色，主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中；癌旁組織中NPRA著色較弱甚至無色，陰性對(duì)照中未見棕黃色顆粒（圖1）。NPRA在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的高表達(dá)率為69.7%（83/119），明顯高于癌旁組織的27.5%（25/91），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

χ

=36.894，

P

＜0.01）。

圖1 NPRA 在食管鱗狀細(xì)胞癌組織、癌旁組織及陰性對(duì)照中的表達(dá)情況

2.2 不同臨床特征食管鱗狀細(xì)胞癌患者食管鱗狀細(xì)胞癌組織中NPRA 表達(dá)情況的比較

不同年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤部位的食管鱗狀細(xì)胞癌患者食管鱗狀細(xì)胞癌組織中NPRA的高表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。分化程度為G～G級(jí)、TNM分期為Ⅱ～Ⅲ期的食管鱗狀細(xì)胞癌患者食管鱗狀細(xì)胞癌組織中NPRA的高表達(dá)率分別明顯高于分化程度為G級(jí)、TNM分期為I期的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.01）。（表1）

表1 不同臨床特征食管鱗狀細(xì)胞癌患者食管鱗狀細(xì)胞癌組織中NPRA表達(dá)情況的比較（n=119）

2.3 生存情況的比較

NPRA低表達(dá)患者的5年生存情況優(yōu)于NPRA高表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

χ

=5.032，

P

=0.025）。（圖 2）

圖2 NPRA高表達(dá)（n=83）和NPRA低表達(dá)（n=36）食管鱗狀細(xì)胞癌患者的生存曲線

2.4 食管癌細(xì)胞株Eca109、TE-1以及正常食管上皮細(xì)胞株Het-1A中NPRA表達(dá)情況的比較

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，NPRA在食管癌細(xì)胞株Eca109、TE-1中的表達(dá)水平分別為（0.68±0.03）和（0.57±0.02），均高于正常食管上皮細(xì)胞株Het-1A的（0.05±0.02），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

t

=15.365、13.893，

P

＜0.05）；而食管癌細(xì)胞株Eca109、TE-1中NPRA的表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。（圖3）

圖3 Western blot 檢測(cè)食管癌細(xì)胞株Eca109、TE-1以及正常食管上皮細(xì)胞株Het-1A中NPRA的表達(dá)情況

2.5 不同組別食管癌細(xì)胞株Eca109中NPRA表達(dá)情況的比較

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，sh-NPRA21897組、sh-NPRA21898組、sh-NPRA21899組中NPRA的表達(dá)水平分別為（0.08±0.03）、（0.06±0.02）、（0.09±0.03），均低于sh-NPRA-NC組的（0.78±0.02），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

t

=32.135、35.362、28.733，

P

＜0.05）。（圖4）

圖4 Western blot 檢測(cè)不同組別食管癌細(xì)胞株Eca109中NPRA的表達(dá)情況

2.6 NPRA 對(duì)食管癌細(xì)胞株Eca109細(xì)胞遷移和侵襲的影響

使用未加基質(zhì)膠的Transwell小室測(cè)定細(xì)胞的遷移能力，加基質(zhì)膠的Transwell小室測(cè)定細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)果顯示，sh-NPRA21897組、sh-NPRA21898組、sh-NPRA21899組細(xì)胞的遷移數(shù)目和侵襲數(shù)目均明顯低于sh-NPRA-NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.01）。（表2、圖5）

表2 不同組別食管癌-細(xì)胞株Eca109中細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)目的比較（個(gè)，x±s）

圖5 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同組別食管癌細(xì)胞株Eca109的遷移和侵襲情況（結(jié)晶紫染色，×200）

3 討論

NPRA是鈉尿肽受體家族中的一員，主要通過與心房鈉尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）和腦鈉尿肽（brain natriuretic peptide，BNP）結(jié)合來發(fā)揮其病理生理作用。文獻(xiàn)檢索后發(fā)現(xiàn)，NPRA在心血管系統(tǒng)中的研究較多，作用較為明確，其對(duì)舒張血管、抑制心肌纖維化、維持心血管穩(wěn)定具有顯著作用。隨著對(duì)NPRA研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)NPRA亦參與了機(jī)體的免疫和炎癥反應(yīng)，在肺癌、前列腺癌等多種惡性實(shí)體腫瘤組織與細(xì)胞中均顯著高表達(dá)，參與了腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程，但其具體作用機(jī)制尚不明確。對(duì)其信號(hào)通路的研究發(fā)現(xiàn)，通過產(chǎn)生第二信使環(huán)磷酸鳥苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）和活化型依賴cGMP的蛋白激酶（cGMP-dependent protein kinase，PKG），活化的PKG反過來激活離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子，共同影響細(xì)胞的增殖和凋亡過程。NPRA在腫瘤中的特異性表達(dá)有望成為腫瘤診斷與預(yù)后預(yù)測(cè)的分子標(biāo)志或治療靶點(diǎn)。

NPRA在人類多種惡性腫瘤組織或細(xì)胞中高表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，食管鱗狀細(xì)胞癌組織中，NPRA陽性顆粒呈棕黃色或淡黃色，主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中。NPRA在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的高表達(dá)率為69.7%，明顯高于癌旁組織的27.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.01）。該結(jié)果與Wang等在前列腺癌中的研究結(jié)果一致，NPRA在前列腺癌組織和高級(jí)上皮內(nèi)瘤變組織中的表達(dá)水平明顯高于正常前列腺組織和良性前列腺增生組織；NPRA在前列腺癌中主要定位在細(xì)胞質(zhì)，但在多數(shù)良性前列腺增生和輕度上皮內(nèi)瘤變的細(xì)胞質(zhì)中NPRA染色卻非常少，而主要表達(dá)在這類細(xì)胞的細(xì)胞核中，提示

NPRA

在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有促癌作用，發(fā)揮著癌基因的功能。前列腺癌中NPRA高表達(dá)可能與炎癥因子白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6、巨噬細(xì)胞抑制因子（macrophage inhibition factor，MIF）有關(guān)，Wang等也通過基因敲除技術(shù)證明了這點(diǎn)，并推測(cè)NPRA可能是MIF的上游調(diào)控因子，其可能通過MIF調(diào)控IL-6的表達(dá)，從而發(fā)揮促癌作用，但其具體的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

本研究對(duì)患者的臨床特征及生存情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，分化程度為G～G級(jí)、TNM分期為Ⅱ～Ⅲ期的食管鱗狀細(xì)胞癌患者食管鱗狀細(xì)胞癌組織中NPRA的高表達(dá)率分別明顯高于分化程度為G級(jí)、TNM分期為I期的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。NPRA低表達(dá)患者的5年生存情況優(yōu)于NPRA高表達(dá)患者。Zhang等在胃癌細(xì)胞和組織中研究NPRA的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，沉默NPRA的表達(dá)后，電壓門控鉀離子通道蛋白KCNQ1的表達(dá)明顯降低，同時(shí)在一定程度上抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，而對(duì)其預(yù)后生存的研究發(fā)現(xiàn)NPRA蛋白高表達(dá)提示著更差的預(yù)后。

Kong等在研究NPRA基因敲除小鼠的生物學(xué)性狀時(shí)發(fā)現(xiàn)，與正常小鼠相比，NPRA基因敲除小鼠支氣管灌洗液中 IL-4、IL-5、IL-6 等促炎因子水平明顯降低，具有更嚴(yán)重的氣道阻塞癥狀和杯狀細(xì)胞化生等；核因子κB（nuclear factor of kappa B，NF-κB）已被證實(shí)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，可能在腫瘤晚期階段通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮作用，如在肝癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞系中均發(fā)現(xiàn)了NF-κB處于活化狀態(tài)。在NPRA基因敲除小鼠中，可以觀察到NF-κB活性降低，促炎因子減少，提示NPRA的表達(dá)與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，其可能是通過抑制腫瘤相關(guān)炎癥反應(yīng)而間接對(duì)腫瘤生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用。研究提示，在敲除NPRA基因的小鼠心肌纖維中，基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）2與MMP9的表達(dá)量明顯增加了3～5倍，同時(shí)NF-κb的信號(hào)也增強(qiáng)了4倍。本研究結(jié)果顯示，NPRA基因敲除后可以明顯降低食管癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，之后將對(duì)其下游分子進(jìn)一步研究，分析NPRA是否與腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移相關(guān)因子MMP2和MMP9相關(guān)。

基因治療是目前腫瘤治療的一個(gè)熱點(diǎn)，尋找有助于腫瘤早期診斷、靶向治療、預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物顯得尤為重要。本研究通過細(xì)胞及組織學(xué)層面推測(cè)NPRA在食管鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)揮著癌基因的作用，且其高表達(dá)與腫瘤的TNM分期、分化程度以及預(yù)后密切相關(guān)，并可促進(jìn)食管癌細(xì)胞的侵襲與遷移，至于哪些基因在食管鱗狀細(xì)胞癌中被NPRA調(diào)控，還有待后續(xù)對(duì)其上下游調(diào)控因子進(jìn)一步研究。