吳彬，陶娟，佟萌，聶琛

大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院乳腺甲狀腺外科，遼寧 大連 116001

甲狀腺乳頭狀癌（papillary carcinoma of thyroid，PTC）是甲狀腺癌的高發(fā)類型，約占甲狀腺癌的85%，但其發(fā)病機(jī)制目前仍未完全明確。盡管PTC的診療手段不斷發(fā)展，但由于PTC患者易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，預(yù)后依然很差。自噬是細(xì)胞適應(yīng)內(nèi)外部環(huán)境變化的能動(dòng)過(guò)程，細(xì)胞內(nèi)部分胞質(zhì)、蛋白質(zhì)和變性壞死的細(xì)胞器與自噬泡中的溶酶體融合形成自噬溶酶體，并降解產(chǎn)生氨基酸、核苷酸供細(xì)胞再利用的循環(huán)過(guò)程，也被稱為Ⅱ型程序性死亡，屬于細(xì)胞正常的功能，這一功能在進(jìn)化過(guò)程中高度保守。研究表明，自噬在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、成熟及死亡過(guò)程發(fā)揮著不同的作用。研究顯示，表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在多種實(shí)體腫瘤中呈異常高表達(dá)，此外，EGFR通過(guò)調(diào)節(jié)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與細(xì)胞的自噬過(guò)程。目前，自噬與EGFR是否相互作用共同促進(jìn)甲狀PTC合并頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)展尚不清楚，因此，本研究探討EGFR和自噬相關(guān)蛋白5（autophagy related protein 5，ATG5）、p62蛋白在PTC組織和頸部轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達(dá)，并探討其臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年3月至2015年2月大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院收治的PTC患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：均經(jīng)病理學(xué)檢查確診為PTC；術(shù)前均未進(jìn)行放化療和其他治療；3年隨訪資料完整。排除合并其他腫瘤的患者。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入80例PTC患者，男28例，女52例；年齡40～79歲，平均（48.32±12.23）歲；＜45歲32例，≥45歲48例；按照2009版國(guó)際抗癌聯(lián)盟TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：I～Ⅱ期39例，Ⅲ～Ⅳ期41例；腫瘤直徑：＜1 cm 35例，≥1 cm 45例；分化程度：高分化26例，中分化32例，低分化22例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例。取80例PTC患者的PTC組織及相應(yīng)的癌旁正常組織，同時(shí)取其中合并頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的45例患者的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織標(biāo)本，所有組織標(biāo)本10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 主要抗體和試劑 兔抗人EGFR多克隆抗體、兔抗人ATG5單克隆抗體，p62單克隆抗體均購(gòu)自北京奧維亞生物技術(shù)有限公司，鏈霉抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）試劑盒購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 免疫組化法檢測(cè)EGFR、ATG5和p62蛋白的表達(dá)情況 石蠟切片，置于40%乙醇中40℃水浴4 min，置于60℃烘箱中烘片，二甲苯脫蠟20 min，梯度乙醇水化，加入3% HO，室溫10 min，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。對(duì)EGFR、ATG5、p62蛋白進(jìn)行高溫高壓組織修復(fù)，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗，加入5%羊血孵育30 min。除去封閉液，加入一抗，4℃冰箱過(guò)夜，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，次日取出PBS沖洗；滴加二抗，室溫下孵育30 min，PBS沖洗5次，每次3 min。DAB顯色，PBS沖洗終止顯色，然后水沖洗，鹽酸乙醇分化，乙醇脫水干燥，光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.3 判定標(biāo)準(zhǔn) 光學(xué)顯微鏡下觀察制備好的切片，陽(yáng)性為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈棕黃色顆粒，由兩名病理科醫(yī)師獨(dú)立進(jìn)行評(píng)估，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野（×400），通過(guò)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞所占比例進(jìn)行評(píng)估。染色強(qiáng)度：無(wú)著色計(jì)0分，淡黃色染色計(jì)1分，棕黃或棕褐色染色計(jì)2分。陽(yáng)性細(xì)胞所占比例：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)0分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例＜25%計(jì)1分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例25%～50%計(jì)2分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例51%～75%計(jì)3分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例＞75%計(jì)4分。將染色強(qiáng)度評(píng)分和陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)分相乘，＞3分判定為陽(yáng)性，≤3分判定為陰性。

1.3 隨訪方法

PTC患者均以電話、門診等方式多所有患者進(jìn)行為期3年的隨訪，隨訪截止時(shí)間為2018年2月，總生存時(shí)間（overall survival，OS）為從手術(shù)至隨訪結(jié)束或死亡時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析；采用Graphpad prism 5軟件繪制生存曲線，生存率的比較采用Log-rank檢驗(yàn)，PTC患者預(yù)后情況的影響因素采用Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型分析；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGFR、ATG5、p62蛋白表達(dá)情況的比較

PTC組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中EGFR、p62蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率均高于癌旁正常組織，ATG5蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率均低于癌旁正常組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05），但PTC組織與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中EGFR、ATG5、p62蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。（表1）

表1 不同組織中EGFR、ATG5、p62蛋白陽(yáng)性表達(dá)率的比較[n（%）]

2.2 不同臨床特征PTC患者PTC組織中EGFR、ATG5、p62蛋白陽(yáng)性表達(dá)率的比較

不同性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度PTC患者PTC組織中ATG5蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）；不同TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況PTC患者PTC組織中ATG5蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

χ

=9.756、6.318，

P

＜0.05）。不同性別、年齡和腫瘤直徑PTC患者PTC組織中p62蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）；不同分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況PTC患者PTC組織中p62蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

χ

=7.166、6.983、4.876，

P

＜0.05）。不同性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況PTC患者PTC組織中EGFR蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征PTC患者PTC組織中EGFR、ATG5、p62蛋白陽(yáng)性表達(dá)率的比較（n=80）

2.3 EGFR、ATG5、p62蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，PTC組織中，EGFR的表達(dá)與ATG5、p62無(wú)明顯相關(guān)性（

r

=0.042、0.116，

P

＞0.05），ATG5的表達(dá)與p62呈負(fù)相關(guān)（

r

=-0.656，

P

＜0.01）；在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中，EGFR的表達(dá)與ATG5、p62無(wú)明顯相關(guān)性（

r

=0.071、0.136，

P

＞0.05）；ATG5的表達(dá)與p62呈負(fù)相關(guān)（

r

=-0.562，

P

＜0.01）。

2.4 PTC組織中EGFR、ATG5、p62蛋白的表達(dá)對(duì)PTC患者預(yù)后的影響

對(duì)80例PTC患者進(jìn)行為期3年的隨訪，病死22例，3年生存率為72.50%（58/80）。p62陽(yáng)性表達(dá)PTC患者的3年生存率為65.52%（38/58），低于陰性表達(dá)患者的90.91%（20/22），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

χ

=5.158，

P

=0.023）；EGFR和ATG5陽(yáng)性表達(dá)PTC患者的3年生存率分別為67.69%（44/65）、94.12%（16/17），與EGFR和ATG5陰性表達(dá)患者的93.33%（14/15）、66.67%（42/63）比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

χ

=2.836、3.777，

P

＞0.05）。

2.5 PTC 患者預(yù)后影響因素的Cox 風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型分析

將TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、EGFR表達(dá)情況、ATG5表達(dá)情況和p62表達(dá)情況作為自變量，以患者的預(yù)后作為因變量，納入Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型，結(jié)果顯示，TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、EGFR陽(yáng)性表達(dá)、p62陽(yáng)性表達(dá)為PTC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（

P

＜0.05），ATG5陽(yáng)性表達(dá)為PTC患者預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素（

P

＜0.05）。（表3）

表3 PTC患者預(yù)后影響因素的Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型分析

3 討論

PTC是甲狀腺惡性腫瘤中最為常見(jiàn)的類型，好發(fā)于中青年女性，且容易較早發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重威脅患者的生命安全。研究表明，多個(gè)癌基因及抑癌基因參與了PTC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，深入探討相關(guān)蛋白的表達(dá)有利于進(jìn)一步明確腫瘤的發(fā)病機(jī)制，同時(shí)可提高臨床分子診斷的準(zhǔn)確性，有助于改善患者的預(yù)后。

細(xì)胞死亡根據(jù)形態(tài)學(xué)表型不同分為I、Ⅱ、和Ⅲ共3種類型，分別指凋亡、自噬性細(xì)胞死亡和細(xì)胞壞死。自噬廣泛存在于細(xì)胞的生理活動(dòng)中，正常細(xì)胞通過(guò)自噬可以清除細(xì)胞內(nèi)廢物，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境及基因組的穩(wěn)定，同時(shí)也是一種細(xì)胞對(duì)抗?fàn)I養(yǎng)缺乏、電離輻射等不良環(huán)境的防御機(jī)制，在抑制炎性反應(yīng)或腫瘤的生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。但有研究表明，自噬活性受損傷后可促進(jìn)細(xì)胞病變和腫瘤的進(jìn)展。微環(huán)境決定了自噬在腫瘤發(fā)展中的作用，腫瘤細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白可出現(xiàn)異常表達(dá)，其異常表達(dá)成為研究腫瘤發(fā)生及抑制腫瘤發(fā)展的熱點(diǎn)。

ATG5位于人類染色體6q21，編碼276個(gè)氨基酸，在自噬相關(guān)基因ATG嚴(yán)格調(diào)控自噬的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，ATG5首先與ATG12結(jié)合，形成的ATG5-ATG12泛素樣連接系統(tǒng)連接到外膜，自噬體膜延伸，進(jìn)而形成自噬體，巨噬細(xì)胞因缺乏ATG5導(dǎo)致吞噬體不能與溶酶體相互融合。有研究表明，ATG5參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，其中胃癌、結(jié)腸癌和卵巢癌組織中因ATG5基因突變降低相應(yīng)蛋白表達(dá)量。本研究發(fā)現(xiàn)，PTC組織及轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織中ATG5的陽(yáng)性表達(dá)率低于癌旁正常組織，推測(cè)ATG5也可能參與了PTC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是評(píng)估PTC惡性程度的重要指標(biāo)，本研究結(jié)果顯示，不同TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況PTC患者PTC組織中ATG5蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示ATG5陰性表達(dá)和PTC的生物學(xué)行為可能有關(guān)，進(jìn)一步生存分析結(jié)果顯示，不同ATG5表達(dá)患者3年生存率無(wú)明顯差異，而Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型結(jié)果顯示，ATG5陽(yáng)性表達(dá)是PTC患者預(yù)后的保護(hù)因素，說(shuō)明ATG5陽(yáng)性表達(dá)與PTC患者預(yù)后存在一定關(guān)系，但只檢測(cè)ATG5不能很好的反映患者的預(yù)后情況。

p62是一種自噬底物連接蛋白，具有多個(gè)結(jié)構(gòu)域，可與泛素化修飾的待降解蛋白結(jié)合并將其運(yùn)輸至自噬泡中降解。細(xì)胞質(zhì)中p62在正常細(xì)胞自噬過(guò)程中不斷被降解，而自噬功能出現(xiàn)缺陷或失活后，會(huì)導(dǎo)致p62蛋白在細(xì)胞質(zhì)中累積，因此，p62可以作為反映細(xì)胞自噬活性的標(biāo)志性蛋白。研究表明，p62濃度增加會(huì)促進(jìn)活性氧的累積，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)和DNA損傷，此外，核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路及下游基因的表達(dá)也會(huì)受到p62積累的影響而上調(diào)促腫瘤炎性反應(yīng)。通過(guò)自噬降低細(xì)胞內(nèi)p62的水平是抑制腫瘤形成的機(jī)制之一。Beclin 1是在哺乳動(dòng)物中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)自噬過(guò)程的抑癌基因，而p62可使Beclin 1蛋白和B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）分離，釋放出Beclin 1蛋白而促進(jìn)自噬活性。本研究發(fā)現(xiàn)，PTC組織及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中p62蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率均高于癌旁正常組織，表明p62可能參與了PTC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。進(jìn)一步分析顯示，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期和分化程度為低分化的PTC患者PTC組織中p62蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于TNM分期為I～Ⅱ期和分化程度為高分化的患者，說(shuō)明p62陽(yáng)性表達(dá)能夠間接反映PTC的惡性生物學(xué)行為。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，PTC組織及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中p62的表達(dá)與ATG5呈負(fù)相關(guān)，提示二者之間存在一定的聯(lián)系，可能是因?yàn)槟[瘤組織中內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變后影響了指標(biāo)之間的相互表達(dá)。隨訪結(jié)果顯示，p62陽(yáng)性表達(dá)PTC患者的3年生存率為65.52%，低于陰性表達(dá)患者的90.91%，Cox分析結(jié)果顯示，p62陽(yáng)性表達(dá)可作為評(píng)估PTC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

EGFR是由原癌基因表達(dá)，與其配體表皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子結(jié)合后導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，通過(guò)多個(gè)信號(hào)通路影響細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡過(guò)程，此外，EGFR酪氨酸激酶能夠使Beclin 1磷酸化而抑制自噬活性，EGFR還可根據(jù)其具有的激酶非依賴活性促進(jìn)細(xì)胞存活。研究表明，EGFR在多種實(shí)體瘤中均呈高表達(dá)。本研究結(jié)果與之類似，PTC組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中EGFR陽(yáng)性表達(dá)率均高于癌旁正常組織，表明EGFR與PTC的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切；進(jìn)一步結(jié)果顯示，EGFR的表達(dá)與PTC患者的臨床特征和3年生存率均無(wú)關(guān)。鄔琳和郭金珠的研究發(fā)現(xiàn)，EGFR與宮頸癌患者臨床特征均無(wú)明顯相關(guān)性，與本研究結(jié)果類似，但也可能與納入的臨床樣本量較少有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，EGFR表達(dá)與自噬相關(guān)蛋白ATG5和p62無(wú)相關(guān)性，這可能因?yàn)樽允傻恼{(diào)節(jié)與EGFR磷酸化水平有關(guān)，而總EGFR蛋白表達(dá)水平不能反映磷酸化程度從而與自噬相關(guān)性不顯著。但本研究發(fā)現(xiàn)，EGFR也可作為PTC患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。

綜上所述，PTC組織及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中EGFR、p62的陽(yáng)性表達(dá)率較高，ATG5的陽(yáng)性表達(dá)率較低，三者可作為PTC患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，此外，ATG5和p62與PTC生物學(xué)行為有關(guān)，可能成為PTC診斷的潛在指標(biāo)。