曹龍龍，謝建偉，李平，鄭朝輝，黃昌明

福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院胃外科，福州 350001

胃癌是一種嚴(yán)重的公共健康問(wèn)題。據(jù)報(bào)道，全世界每年胃癌發(fā)病數(shù)量超過(guò)951 600例，現(xiàn)已成為第三大腫瘤相關(guān)死亡病因。胃癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，預(yù)后差，病死率高。盡管胃癌的綜合治療措施不斷完善，但仍未能獲得滿意效果。近年來(lái)，對(duì)免疫檢查點(diǎn)的阻斷已進(jìn)行了積極研究，并已為多種惡性腫瘤（如轉(zhuǎn)移性黑色素瘤和非小細(xì)胞肺癌）帶來(lái)了巨大的臨床獲益。但是，研究發(fā)現(xiàn)多種腫瘤類型中只有不到40%的病例對(duì)程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PDCD1，也稱PD-1）/程序性死亡受體配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也稱PD-L1）阻斷有反應(yīng)，并且據(jù)報(bào)道腫瘤對(duì)免疫療法有主要或次要抵抗力。細(xì)胞周期蛋白依賴蛋白激酶5（cyclin-dependent protein kinase 5，CDK5）屬于周期蛋白依賴蛋白激酶（CDK）家族成員。既往研究顯示，CDK5除了參與神經(jīng)細(xì)胞的調(diào)控外，還參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展及凋亡過(guò)程。最近研究顯示，CDK5的缺失可通過(guò)干擾PD-L1的表達(dá)而參與腫瘤免疫逃逸。然而，關(guān)于CDK5是否影響腫瘤免疫浸潤(rùn)細(xì)胞的類型和數(shù)目尚不清楚。本研究收集36例胃癌患者的胃癌石蠟組織，并通過(guò)生物信息學(xué)分析，探討CDK5表達(dá)是否影響胃癌免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

從公共數(shù)據(jù)庫(kù)癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA；https://portal.gdc.cancer.gov/）及基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression Omnibus，GEO；https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/）中獲取胃癌患者高通量測(cè)序數(shù)據(jù)集。TCGA數(shù)據(jù)集中納入包含完整臨床資料的358例胃癌組織（T）及22例癌旁組織（N）。GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中選取包含胃癌組織和癌旁組織或健康者胃黏膜組織（H）、組織樣本共大于50例且已發(fā)表相關(guān)文獻(xiàn)或文獻(xiàn)引用次數(shù)大于3次的數(shù)據(jù)集，本研究共納入4個(gè)GEO數(shù)據(jù)集：GSE66229（T為300例，N為100例）、GSE122401（T為80例，N為80例）、GSE54129（T為111例，H為21例）、GSE13911（T為38例，N為31例）。同時(shí)，選取2015年2—6月于福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院診斷為胃癌的36例患者，所有患者均接受根治性手術(shù)，且病歷資料齊全。根據(jù)CDK5表達(dá)水平將36例胃癌患者分為CDK5低表達(dá)組22例和CDK5高表達(dá)組14例。CDK5低表達(dá)組中，男14例，女8例；平均年齡（59.6±4.2）歲；腫瘤部位：胃底部7例，胃體部4例，胃竇部10例，混合型1例；平均腫瘤大?。?.6±0.8）cm；TNM分期：I期1例，Ⅱ期8例，Ⅲ期13例。CDK5高表達(dá)組中，男8例，女6例；平均年齡（60.7±3.8）歲；腫瘤部位：胃底部3例，胃體部5例，胃竇部6例，混合型0例；平均腫瘤大?。?.9±0.6）cm；TNM分期：I期 2例，Ⅱ期 6例，Ⅲ期 6例。兩組患者各基線特征比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者知情同意并簽署知情同意書(shū)，同意將其信息存儲(chǔ)在醫(yī)院數(shù)據(jù)庫(kù)中并用于研究。

1.2 免疫組織化學(xué)染色

將36例患者經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋的腫瘤組織切片（厚度為4 μm）用CDK5或CD8進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。將載玻片在65℃烘烤2 h，用二甲苯脫蠟，然后在梯度酒精中水化。使用檸檬酸緩沖溶液通過(guò)高壓方法對(duì)載玻片進(jìn)行抗原修復(fù)。內(nèi)源過(guò)氧化物酶用3% HO滅活，用1%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）進(jìn)行孵育，以阻斷非特異性結(jié)合。隨后，將載玻片與抗CDK5抗體（1∶200稀釋）或抗CD8抗體（1∶100稀釋）在4℃孵育過(guò)夜。正常山羊血清作為陰性對(duì)照。用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌后，將組織切片與二抗在室溫下孵育20 min，然后用二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）染色。最后，將載玻片用蘇木精復(fù)染色，脫水，并蓋上蓋玻片。對(duì)CDK5染色切片評(píng)分：根據(jù)染色強(qiáng)度分為0分（無(wú)染色）、1分（弱染色，淺黃色）、2分（中等染色，黃棕色）、3分（強(qiáng)染色，棕色）；根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的比例分為0分（≤5%陽(yáng)性細(xì)胞）、1分（6%～25%陽(yáng)性細(xì)胞）、2分（26%～50%陽(yáng)性細(xì)胞）、3分（≥51%陽(yáng)性細(xì)胞）。兩項(xiàng)得分相乘結(jié)果≥4分為高表達(dá)，反之為低表達(dá)。本研究中，根據(jù)CDK5表達(dá)水平將36例胃癌患者分為CDK5低表達(dá)組22例和CDK5高表達(dá)組14例。對(duì)CD8染色切片評(píng)分：評(píng)估腫瘤中心每高倍鏡視野的CD8T淋巴細(xì)胞數(shù)，統(tǒng)計(jì)5個(gè)視野中CD8T淋巴細(xì)胞的平均數(shù)。

1.3 基因富集分析

1.4 CIBERSORT免疫細(xì)胞組分評(píng)估

通過(guò)CIBERSORT（https：//cibersort.stanford.edu/）的22種免疫細(xì)胞類型基因標(biāo)簽（通過(guò)估計(jì)相對(duì)表達(dá)鑒定細(xì)胞類型）計(jì)算基因表達(dá)數(shù)據(jù)集的絕對(duì)免疫細(xì)胞評(píng)分（模型設(shè)為絕對(duì)，排列等于100，禁用RNA-Seq數(shù)據(jù)的分位數(shù)歸一化）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 胃癌相關(guān)免疫信號(hào)通路及免疫細(xì)胞浸潤(rùn)

采用GSEA評(píng)估公共數(shù)據(jù)庫(kù)中胃癌相關(guān)信號(hào)通路激活情況。相較于癌旁組織，細(xì)胞周期相關(guān)基因集（E2F_targets、G2M_checkpoint等）及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）基因集在胃癌中的標(biāo)準(zhǔn)化富集分?jǐn)?shù)（normalized enrichment score，NES）最高。而負(fù)性調(diào)控KRAS通路的基因集（Kras_signaling_dn）及脂肪酸代謝基因集在癌旁組織中顯著富集。此外，代表同種異體移植物排斥反應(yīng)的基因集在5個(gè)胃癌數(shù)據(jù)集中均顯著富集，提示機(jī)體免疫反應(yīng)在胃癌進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。為進(jìn)一步評(píng)估胃癌的免疫微環(huán)境，本研究收集了11個(gè)免疫相關(guān)基因集進(jìn)行富集分析，結(jié)果顯示所有免疫相關(guān)基因集均在胃癌中顯著富集（圖1）。采用ssGSEA評(píng)估顯示，周圍炎癥基因集在胃癌組織中評(píng)分明顯高于癌旁組織（P＜0.01）。采用CIBERSORT軟件對(duì)TCGA樣本進(jìn)行免疫細(xì)胞組分評(píng)估，發(fā)現(xiàn)癌旁組織中記憶B細(xì)胞浸潤(rùn)高于腫瘤組織（P=0.039），而腫瘤組織中巨噬細(xì)胞M型、M型及M型數(shù)目均明顯多于癌旁組織（P＜0.01）。

圖1 胃癌免疫相關(guān)基因集的富集情況

2.2 CDK5相關(guān)的免疫信號(hào)通路

采用GSEA分析胃癌公共數(shù)據(jù)庫(kù)中與CDK5相關(guān)的免疫基因集。相較于CDK5低表達(dá)患者，周圍炎癥基因集等免疫增強(qiáng)基因集在CDK5高表達(dá)患者中顯著富集（圖2A）。且在周圍炎癥基因集中，與免疫密切相關(guān)的基因ⅡA型磷脂酶A2（phospholipase A2 groupⅡA，PLA2G2A）、趨化因子配體 10（C-X-C motif chemokine ligand 10，CXCL10）及腫瘤壞死因子受體超家族成員12A（tumor necrosis factor receptor superfamily member 12A，TNFRSF12A）等在兩組患者中差異最顯著[Log2（FC）＞1，圖2B]。對(duì)11個(gè)免疫相關(guān)基因集采用ssGSEA分析進(jìn)一步顯示，周圍炎癥基因集及抗原提呈細(xì)胞共刺激基因集在CDK5高表達(dá)患者中評(píng)分均明顯高于CDK5低表達(dá)患者（P＜0.01）。上述結(jié)果表明，CDK5高表達(dá)的胃癌組織可能引起機(jī)體更強(qiáng)的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖2 GSEA分析CDK5高表達(dá)組與低表達(dá)組中周圍炎癥基因集的富集情況

2.3 CDK5與免疫相關(guān)基因及免疫浸潤(rùn)細(xì)胞的相關(guān)性

根據(jù)既往文獻(xiàn)報(bào)道，發(fā)現(xiàn)包括CD274、PD-L2、PD-1、CD80、CD86、毒性 T 淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白 4（cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4，CTLA4）、主要組織相容性復(fù)合物I型-C（major histocompatibility complex，classI，C，HLA-C）、CD247及γ干擾素（interferon-gamma，IFN-γ）在內(nèi)的9個(gè)基因直接參與腫瘤免疫逃逸。采用公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步評(píng)估CDK5與9個(gè)重要免疫相關(guān)基因之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示CDK5表達(dá)與CD274、PD-L2及IFNG等免疫相關(guān)基因表達(dá)呈正相關(guān)（圖3）。對(duì)TCGA數(shù)據(jù)集中的CDK5表達(dá)水平與免疫細(xì)胞組分進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，CDK5與活化記憶CD4T淋巴細(xì)胞和CD8T淋巴細(xì)胞均呈正相關(guān)（r=0.28、0.12），而與靜息記憶CD4T淋巴細(xì)胞和幼稚B淋巴細(xì)胞均呈負(fù)相關(guān)（r=-0.28、-0.24）。

圖3 不同數(shù)據(jù)集中CDK5與免疫相關(guān)基因的相關(guān)性

2.4 生存分析

收集GSE66229數(shù)據(jù)集中300例胃癌患者的測(cè)序數(shù)據(jù)及預(yù)后資料并進(jìn)行生存分析。結(jié)果顯示，CDK5、CD274低表達(dá)的患者總生存率（overall survival，OS）均明顯低于高表達(dá)患者（CDK5：HR=0.52，95%CI=0.17～1.60，P＜0.01；CD274：HR=0.24，95%CI=0.07～0.80，P＜0.01）。（圖4）

圖4 GSE66229數(shù)據(jù)集中不同CDK5、CD274表達(dá)情況患者的生存曲線

2.5 CDK5表達(dá)與CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性

采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)36例胃癌組織中CDK5和CD8的表達(dá)情況（圖5）。根據(jù)CDK5評(píng)分將患者分為CDK5高表達(dá)組（14例）和CDK5低表達(dá)組（22例），并評(píng)估兩組患者每高倍鏡視野CD8T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，CDK5高表達(dá)組患者CD8T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)目為（43.07±4.57），明顯多于CDK5低表達(dá)組的（24.27±2.64），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.824，P＜0.01）。

圖5 胃癌組織中CDK5與CD8的表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)染色，×200）

3 討論

胃癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，在亞洲地區(qū)發(fā)病率極高。早期胃癌病情隱匿，確診時(shí)往往已處于晚期，故預(yù)后差，病死率高。盡管胃癌的綜合治療措施不斷完善，但仍未能獲得滿意效果。少數(shù)早期胃癌患者有可能通過(guò)手術(shù)切除而治愈，而進(jìn)展期胃癌患者通過(guò)圍手術(shù)期化療及手術(shù)切除的綜合治療方案取得了一定療效。但仍有相當(dāng)一部分進(jìn)展期胃癌患者對(duì)化療藥物不敏感，削弱了手術(shù)帶來(lái)的生存獲益。盡管腫瘤治療手段不斷發(fā)展，但總體進(jìn)展期胃癌的療效有限，預(yù)后較差，亟需新的治療手段。

CDK5基因位于7號(hào)染色體長(zhǎng)臂3區(qū)6帶（7q36）上，其編碼分子量為33 kD的絲/蘇氨酸蛋白激酶，屬于CDK家族成員。最早關(guān)于CDK5功能的報(bào)道主要集中于神經(jīng)元的有絲分裂中。隨著人們對(duì)CDK5功能的深入研究，發(fā)現(xiàn)除了參與神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育外，CDK5還參與多種腫瘤生物學(xué)行為，包括致癌作用及抑癌作用。

近年來(lái)，隨著腫瘤學(xué)、免疫學(xué)以及分子生物學(xué)等相關(guān)學(xué)科理論和技術(shù)的快速發(fā)展，以及對(duì)機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答和腫瘤免疫逃逸機(jī)制的深入了解，腫瘤免疫治療的新策略已得到進(jìn)一步的研究，腫瘤免疫療法引起了廣泛重視。本研究通過(guò)對(duì)TCGA及GEO公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行通路富集分析，提示腫瘤免疫逃逸機(jī)制在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。PD-L1和PD-1是抗腫瘤免疫中的關(guān)鍵分子，大約30%的腫瘤對(duì)免疫檢測(cè)點(diǎn)抑制劑起作用。Sun等研究結(jié)果顯示，102例胃癌組織中PD-L1陽(yáng)性表達(dá)率為42.2%，且PD-L1高表達(dá)的患者預(yù)后普遍較差。然而，Kim等研究結(jié)果顯示，PD-L1高表達(dá)患者預(yù)后比低表達(dá)患者更好，這與本研究采用芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)后分析的結(jié)果一致。產(chǎn)生這些差異的原因可能與患者例數(shù)及腫瘤異質(zhì)性有關(guān)。

CDK5在腫瘤的免疫逃逸中也起著至關(guān)重要的作用。Dorand等的研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)CDK5表達(dá)可以減少PD-L1表達(dá)從而遏制腫瘤免疫逃逸，提示CDK5可能成為腫瘤免疫治療的潛在靶點(diǎn)。本研究對(duì)公共數(shù)據(jù)集采用GSEA分析，發(fā)現(xiàn)免疫增強(qiáng)基因集及抗原提呈細(xì)胞相關(guān)基因集在CDK5高表達(dá)患者中顯著富集。富集的基因集中包含趨化因子家族成員（如CXCL9、CXCL10等）和腫瘤壞死因子受體超家族成員（如TNFRSF12A等），提示CDK5可能通過(guò)調(diào)控趨化因子或腫瘤壞死因子而參與免疫調(diào)控過(guò)程。為進(jìn)一步評(píng)估胃癌中CDK5與腫瘤免疫逃逸的關(guān)系，本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)法評(píng)估CDK5表達(dá)水平與CD8T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況的關(guān)系，結(jié)果顯示CDK5高表達(dá)組患者的CD8T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)目明顯多于CDK5低表達(dá)組患者，提示高表達(dá)CDK5的胃癌組織可能引起機(jī)體更強(qiáng)的殺傷性T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。這可能是CDK5高表達(dá)患者預(yù)后通常較好的原因。

面對(duì)異質(zhì)性較高且腫瘤微環(huán)境復(fù)雜的胃癌，基于免疫檢測(cè)點(diǎn)抑制劑的研究為胃癌治療提供了新策略。CDK5對(duì)PD-L1等免疫分子及殺傷性T淋巴細(xì)胞的影響及作用機(jī)制有待于更加深入的基礎(chǔ)研究證實(shí)。有理由相信，隨著相關(guān)基礎(chǔ)與臨床研究的逐漸成熟，免疫檢測(cè)點(diǎn)抑制劑將會(huì)被廣泛應(yīng)用于晚期胃癌的治療中，為更多晚期胃癌患者帶來(lái)更好的生存獲益。