盧芳,張冶,白宛鑫,盧意,吳娟,劉樹(shù)民
1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)繼續(xù)教育學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,黑龍江 哈爾濱 150040;3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)中心,黑龍江 哈爾濱 150040;4.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院,黑龍江 哈爾濱 150040
帕金森?。≒arkinson disease,PD)是一種多發(fā)于老年人的神經(jīng)退行性疾病,主要表現(xiàn)為靜止性震顫、肌肉僵直等,中晚期患者甚至出現(xiàn)神經(jīng)錯(cuò)亂等臨床癥狀,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。研究認(rèn)為,PD主要由中腦黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元丟失,黑質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)路易小體,α 突觸蛋白表達(dá)量增加所致[1]。由于PD病因復(fù)雜、機(jī)制尚未闡明,目前尚無(wú)特效藥物。
拜顫停復(fù)方為黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)劉樹(shù)民教授臨床治療PD 經(jīng)驗(yàn)方復(fù)元平顫寧精簡(jiǎn)而成,由刺五加、白芍、鉤藤的有效部位提取物組方。本課題組前期研究顯示,拜顫停復(fù)方能增加PD 模型小鼠紋狀體內(nèi)多巴胺含量[2],改善PD 模型小鼠行為學(xué)變化,且具有抗炎、抗氧化及清除自由基等作用[3-4],并優(yōu)化得到組方藥物的最佳配伍比例及片劑處方[2,5]。藥物口服入體后,活性成分經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)到達(dá)組織器官,其組織分布特征不僅與藥物本身的理化性質(zhì)有關(guān),還與藥物和組織的親和力有密切關(guān)系。筆者在查閱相關(guān)文獻(xiàn)[6-11]基礎(chǔ)上,以刺五加主要有效成分異嗪皮啶、紫丁香苷、刺五加苷E,白芍主要有效成分芍藥苷,以及鉤藤主要有效成分異鉤藤堿,作為復(fù)方拜顫停片的代表性成分,利用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UPLC-MS)研究5種成分在PD模型大鼠體內(nèi)各臟器的分布特征,為復(fù)方拜顫停片的后續(xù)研究提供依據(jù)。
API4000 液質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)Waters 公司),配有電噴霧離子源(ESI),分析軟件MassLynx4.0;Acquity TH UPLC 超高效液相色譜儀(美國(guó)Waters 公司);ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱(美國(guó)Waters 公司);KDC-160HR 高速冷凍型離心機(jī)(科大創(chuàng)新有限公司);WHL 微型渦旋混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司);ME235S 電子分析天平(德國(guó)Sartourious公司);MTN-2800 氮吹儀(Auto Science 公司)。
對(duì)照品紫丁香苷(批號(hào)110873-201012,純度94.9%)、異嗪皮啶(批號(hào)110673-201105,純度99.2%)、刺五加苷E(批號(hào)110736-201006,純度98.1%)、芍藥苷(批號(hào)110482-201009,純度97.4%)、異鉤藤堿(批號(hào)110284-201102,純度98.4%)、葛根素(批號(hào)110752-201012,純度95.5%),中國(guó)食品藥品檢定研究院。復(fù)方拜顫停片,本課題組聯(lián)合世一堂制藥廠制備,批號(hào)1905307,片重0.4 g,含異嗪皮啶0.20%、紫丁香苷0.66%、刺五加苷E 0.13%、芍藥苷7.08%、異鉤藤堿0.52%。甲醇(色譜級(jí),美國(guó)Fisher 公司),乙腈(色譜級(jí),美國(guó)Fisher 公司),甲酸(色譜級(jí),美國(guó)ROE Scientific 公司),1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP,上海德默醫(yī)藥科技有限公司,批號(hào)20141019,規(guī)格100 mg),水為娃哈哈純凈水。
SD 雄性大鼠36 只,SPF 級(jí),體質(zhì)量(200±20)g,購(gòu)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(黑)2019-0001,于屏障環(huán)境動(dòng)物室內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)條件飼養(yǎng),適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。
大鼠腹腔注射MPTP(30 mg/mL),連續(xù)7 d,制作PD 模型[12],以四肢僵直、豎毛、爬桿時(shí)間延長(zhǎng)、自主活動(dòng)減少為成模標(biāo)準(zhǔn)。隨機(jī)取30 只成模大鼠,灌胃給予復(fù)方拜顫停片926 mg/kg(根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定)。給藥前禁食過(guò)夜,自由飲水。分別于給藥后1、6、8、10、24 h 隨機(jī)取6 只大鼠處死,摘取肝、心、脾、肺、腎、小腸及腦組織,用生理鹽水洗去殘血,濾紙吸干后稱定質(zhì)量。取各組織0.5 g,按組織∶生理鹽水=1∶2(g∶mL)加入生理鹽水,手動(dòng)勻漿,得到組織勻漿樣品,-80 ℃冰箱保存,備用。
組織勻漿樣品室溫融化,15 000 r/min 離心10 min,取上清液適量,加入乙腈沉淀蛋白,15 000 r/min 離心10 min,吸取上清液,于氮吹儀下37 ℃吹干,殘?jiān)玫润w積乙腈復(fù)溶,渦旋10 min,4 ℃、15 000 r/min離心10 min,取上清液適量,進(jìn)行UPLC-MS 分析。
分別精密稱取紫丁香苷、異嗪皮啶、刺五加苷E、芍藥苷、異鉤藤堿對(duì)照品各1 mg,用甲醇溶解,制成濃度均為0.1mg/mL的對(duì)照品溶液,4℃冰箱保存?zhèn)溆?。分別精密移取上述對(duì)照品溶液50μL,用甲醇配制成濃度均為5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039μg/mL的系列混合對(duì)照品溶液,4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
精密稱取葛根素對(duì)照品0.39mg,用甲醇溶解,制成7.8μg/mL 的葛根素標(biāo)準(zhǔn)工作液,作為內(nèi)標(biāo)溶液,4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
色譜柱為ACQUITY UPLCBEH C18(2.1mm×50mm,1.7μm),柱溫為室溫(22~24℃),流速0.3mL/min,以甲醇(A)和0.1%甲酸-水(B)為流動(dòng)相,梯度洗脫(0~2min,0%~20%A;2~10 min,20%~80%A;10~12min,80%~20%A)。
采用ESI;芍藥苷用負(fù)離子檢測(cè),其余成分均用正離子檢測(cè);掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM);噴霧電壓4500V,金屬毛細(xì)管壓力3kV,錐孔電壓50V,離子源溫度100℃,脫溶劑氣流量800L/h,錐孔氣流量80L/h。用于定量分析的離子對(duì):異嗪皮啶m/z223→162,紫丁香苷m/z 395→232,刺五加苷E m/z 765→603,芍藥苷m/z525→449,異鉤藤堿m/z385→160,葛根素m/z 417→267。
2.6.1 專屬性考察
取空白組織樣品、空白組織樣品+對(duì)照品+內(nèi)標(biāo)、給藥1h組織樣品+內(nèi)標(biāo),按“2.2”項(xiàng)下方法處理,按“2.4”“2.5”項(xiàng)下條件進(jìn)樣檢測(cè)。腦組織樣品檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1??瞻啄X組織樣品+對(duì)照品+內(nèi)標(biāo)溶液中異嗪皮啶、紫丁香苷、刺五加苷E、芍藥苷、異鉤藤堿、葛根素(內(nèi)標(biāo))的保留時(shí)間分別為4.14、2.79、4.32、3.74、4.46、3.56min,給藥1h 腦組織樣品上述各成分的保留時(shí)間分別為4.23、2.88、4.37、3.79、4.64、3.60 min。可以看出,組織中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾目標(biāo)成分的測(cè)定。
圖1 PD模型大鼠腦組織中5種成分提取離子流圖
2.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量限
分別精密吸取PD 模型大鼠肝、心、脾、肺、腎、腦、小腸組織勻漿樣品100 μL,加入“2.3”項(xiàng)下系列混合對(duì)照品溶液100 μL,再加入100 μL 內(nèi)標(biāo)溶液,按“2.2”項(xiàng)下方法處理,按“2.4”“2.5”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析,各成分標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程見(jiàn)表1。在測(cè)定的濃度范圍內(nèi),各目標(biāo)成分在各組織中的線性關(guān)系均良好。各目標(biāo)成分的線性范圍均為13~1667 ng/mL,定量限均為13 ng。
表1 PD 模型大鼠各組織中5 種成分線性關(guān)系考察結(jié)果
2.6.3 提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)
分別精密吸取 PD 模型大鼠腦組織勻漿樣品100 μL,依次加入低、中、高濃度混合對(duì)照品溶液100 μL,再加入100 μL 內(nèi)標(biāo)溶液,按“2.2”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析,得到響應(yīng)值A(chǔ);取腦組織樣品,按“2.2”項(xiàng)下方法處理,再加入混合對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液,進(jìn)樣分析,得到響應(yīng)值B;取溶劑為乙腈的對(duì)照品溶液進(jìn)樣分析,得到響應(yīng)值C。同時(shí)測(cè)定5 個(gè)平行樣品,計(jì)算提取回收率(A/B×100%)和基質(zhì)效應(yīng)(B/C×100%)。在腦組織樣品中,各目標(biāo)成分在低、中、高濃度下的提取回收率及基質(zhì)效應(yīng)見(jiàn)表2。在其他組織(心、肝、脾、肺、腎、小腸)樣品中,各目標(biāo)成分在不同濃度下的的提取回收率及基質(zhì)效應(yīng)為80%~105%,RSD 均小于15%,表明各目標(biāo)成分在各組織中提取回收率高,重復(fù)性好,且各組織對(duì)目標(biāo)成分無(wú)基質(zhì)效應(yīng)干擾,不影響該方法的準(zhǔn)確性與重現(xiàn)性。
表2 PD 模型大鼠腦組織中5 種成分提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)(%,n=5)
2.6.4 精密度試驗(yàn)
分別精密吸取PD 模型大鼠腦組織樣品100 μL,依次加入低、中、高濃度的混合對(duì)照品溶液100 μL,分別按“2.2”項(xiàng)下方法處理,按“2.4”“2.5”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析,每一濃度5 個(gè)平行樣品,連續(xù)測(cè)定3 d。大鼠腦組織樣品中,各目標(biāo)成分在低、中、高濃度下日內(nèi)精密度及日間精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)、相對(duì)誤差(RE)均在±15%之內(nèi),見(jiàn)表3。在其他組織(心、肝、脾、肺、腎、小腸)樣品中,各目標(biāo)成分在不同濃度的日內(nèi)精密度及日間精密度RSD、RE均在±15%之內(nèi),表明精密度良好。
2.6.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)
按“2.3”項(xiàng)下方法制備低、中、高濃度質(zhì)控樣品,考察室溫放置4 h(短期穩(wěn)定性)、-20 ℃存放4 周(長(zhǎng)期穩(wěn)定性)、在自動(dòng)進(jìn)樣器中室溫放置12 h(制備后穩(wěn)定性)、-20 ℃取出后于室溫融化并反復(fù)凍融3 次(凍融穩(wěn)定性)的回收率和RSD,腦組織樣品中5種成分的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。在其他組織(心、肝、脾、肺、腎、小腸)樣品中,不同濃度質(zhì)控樣品在上述4 種環(huán)境中的回收率RSD 為1.79%~9.04%。結(jié)果表明,在各組織(心、肝、脾、肺、腎、小腸、腦)中,5 種目標(biāo)成分在各種條件下的穩(wěn)定性均良好。
PD 模型大鼠給藥后各成分在不同時(shí)間點(diǎn)的組織分布濃度見(jiàn)表5??梢钥闯?,給藥后6 h 各成分的組織分布濃度最高,分別于1、8 h 在小腸中出現(xiàn)2 個(gè)高峰。除小腸外,給藥后6 h,大鼠體內(nèi)異嗪皮啶的組織分布為腎>脾>心>肝>腦>肺,紫丁香苷為腎>腦>肺>脾>肝>心,刺五加苷E 為腎>脾>腦>肺>心>肝,芍藥苷為腎>肝>脾>心>腦>肺,異鉤藤堿為腎>肝>脾>心>腦>肺。
表3 PD 模型大鼠腦組織中5 種成分精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=5)
表4 PD 模型大鼠腦組織中5 種成分穩(wěn)定性試驗(yàn)(%,n=5)
表5 PD 模型大鼠給藥后不同時(shí)間5 種成分組織分布濃度(,μg/mL,n=6)
表5 PD 模型大鼠給藥后不同時(shí)間5 種成分組織分布濃度(,μg/mL,n=6)
藥物在機(jī)體組織中的分布特征是藥代動(dòng)力學(xué)的主要研究?jī)?nèi)容之一,通過(guò)了解藥物的組織分布情況,可進(jìn)一步明確其作用靶點(diǎn),為新藥安全性評(píng)價(jià)等奠定基礎(chǔ)[13]。PD 屬中醫(yī)學(xué)“顫證”范疇,其病機(jī)多為脾之化源不足,肝腎虧虛,導(dǎo)致筋脈拘攣、虛風(fēng)內(nèi)動(dòng),治療以補(bǔ)益肝腎為主[14-15]。在復(fù)方拜顫停片中,白芍代表成分芍藥苷和鉤藤代表成分異鉤藤堿均在肝、腎中濃度較高,刺五加代表成分異嗪皮啶、刺五加苷E和紫丁香苷均在腎、脾中濃度較高,可見(jiàn),刺五加、白芍、鉤藤三藥配伍可協(xié)同調(diào)理肝、腎、脾三臟,達(dá)到熄風(fēng)止顫目的。
本研究建立了UPLC-MS 測(cè)定大鼠肝、心、脾、肺、腎、腦及小腸組織中復(fù)方拜顫停片有效成分異嗪皮啶、紫丁香苷、刺五加苷E、異鉤藤堿和芍藥苷含量的方法,具有準(zhǔn)確性、專屬性。給藥后目標(biāo)成分在PD 模型大鼠體內(nèi)組織分布情況顯示,各成分在小腸中分別于1、8 h 出現(xiàn)2 個(gè)高峰,測(cè)定時(shí)間內(nèi)在肝與小腸中的變化趨勢(shì)相反,推測(cè)可能存在肝腸循環(huán)。此外,異嗪皮啶、紫丁香苷、刺五加苷E、芍藥苷和異鉤藤堿均在腎臟中含量最高,可能由于這5 種成分均主要通過(guò)腎臟代謝。
PD 主要由于多巴胺能神經(jīng)元損傷,紋狀體內(nèi)多巴胺濃度下降,進(jìn)而引起大腦興奮和抑制的神經(jīng)反饋調(diào)節(jié)失衡[16]。本研究結(jié)果顯示,在腦組織中,紫丁香苷與芍藥苷分布濃度較高,刺五加苷E、異嗪皮啶和異鉤藤堿也有不同程度分布,表明這5 種成分均能通過(guò)血腦屏障,作用于腦,進(jìn)而發(fā)揮其治療作用。刺五加歸脾、腎、心經(jīng),白芍歸肝、脾經(jīng),鉤藤歸肝、心包經(jīng),本研究結(jié)果與藥物歸經(jīng)不完全一致,可能由于中藥具有多成分、多靶點(diǎn)的特性,某個(gè)藥物單體成分并不能完全顯示該藥的歸經(jīng),且藥物配伍也可能影響其歸經(jīng)。
綜上,本研究對(duì)復(fù)方拜顫停片在PD 模型大鼠體內(nèi)的組織分布情況進(jìn)行研究,可為其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及新藥開(kāi)發(fā)提供重要依據(jù)。