李海寧，都研文，楊潔，熱孜亞木.吾甫爾，于寧，邢建國

1.石河子大學，新疆 石河子 832000；2.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆 烏魯木齊 830004；3.新疆醫(yī)科大學，新疆 烏魯木齊 830011

缺血性心臟病是臨床常見的高死亡和高致殘性疾病，近年來，隨著臨床預防的普及，以及介入、冠狀動脈旁路移植術等治療手段的發(fā)展，患者生存率有一定程度的提高，但隨之而來的心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）引起患者心功能的較大損害。研究顯示，再灌注引起的致死性損傷占心肌梗死面積的30%，目前針對MIRI心肌病尚無特效藥[1-2]。香青蘭Drococephalum moldivacaL.是新疆維吾爾族習用藥食兩用植物，主要用于治療冠心病和高血壓，其具有促進血液循環(huán)、改善心臟功能、治療心肌缺血作用。田薊苷（Tilianin）是從香青蘭中提取的一種天然活性成分，屬黃酮類化合物。前期研究表明，田薊苷是抗MIRI 的主要活性物質，與普萘洛爾比較，較小劑量田薊苷即具有同等作用，可降低心電圖ST 段抬高幅度，改善心肌細胞腫脹、壞死、中性粒細胞浸潤等病理現(xiàn)象[3-7]，但其作用機制還未完全闡明。肝X 受體α（LXR-α）是核受體家族具有抗MIRI 作用的LXR 亞型，是一種新的內源性保護因子，上調LXR-α 可增加促細胞存活的Akt 磷酸化、抑制促細胞凋亡的p38MAPK磷酸化，抑制細胞凋亡，緩解MIRI[8-14]。本實驗以田薊苷為研究對象，以H9c2 細胞缺氧/復氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）損傷為模型，從LXR-α 相關通路觀察田薊苷對心肌細胞的影響，探討其體外抗MIRI 作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物和細胞株

田薊苷，新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，純度98%，批號20171012。大鼠心肌細胞H9c2，中國科學院上海細胞庫。

1.2 主要試劑與儀器

低糖DMEM 培養(yǎng)基（美國Hyclone 公司，貨號SH30021.01），胰蛋白酶（美國Hyclone 公司，貨號SH30042.01），無糖DMEM 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司，貨號11966-025），胎牛血清（美國Gibco 公司，貨號10099-141），厭氧安寧包（日本MGC 公司，貨號C-1），CCK-8 試劑盒（博士德生物工程有限公司，貨號AR1160），活性氧（ROS）檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號CA1410），線粒體膜電位（JC-1）試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號M8650），Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒（美國BD 公司，貨號556547），LXR-α（英國Abcam 公司，貨號ab176323），p-p38MAPK（美國CST 公司，貨號8690S，4511S），Akt、p-Akt（美國CST 公司，貨號4691S、13038S），Bax（美國CST 公司，貨號2772S），Bcl-2（英國Abcam 公司，貨號ab59348），Caspase-3（美國CST 公司，貨號9662S），GAPDH、HRP 標記山羊抗兔IgG、HRP 標記山羊抗大鼠IgG（北京中杉金橋公司，貨號分別為TA-08、ZB-2301、ZB-2305）。電泳、轉膜試劑（武漢博士德生物工程有限公司），ECL發(fā)光液（美國Millipore，貨號WBKLS0100），EVOS FLoid 倒置熒光顯微鏡（Thermo Fisher 公司），多功能酶標儀（美國BioTek 公司），F(xiàn)ACS Aria 型流式細胞儀（美國BD 公司），轉移電泳儀槽（美國Bio-Rad公司），垂直電泳槽（美國Bio-Rad 公司），Allegra 64R冷凍高速離心機（美國Beckman 公司）。

1.3 細胞培養(yǎng)與分組

H9c2 細胞用含10%胎牛血清DMEM 低糖培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。實驗隨機分為對照組、模型組和田薊苷低、中、高劑量（5、10、20 μg/mL）組。

1.4 缺氧/復氧細胞模型建立

參照文獻[15-17]方法操作，細胞用田薊苷預處理3 h，換液為無糖無血清DMEM 培養(yǎng)基，置于放有厭氧安寧包的密封盒，缺氧6 h，棄去舊培養(yǎng)基，加含10%胎牛血清DMEM 低糖培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)進行復氧處理，復氧3 h，建立H/R 細胞模型。

1.5 細胞形態(tài)觀察

取對數(shù)生長期細胞，以1×105個/mL 接種于6 孔板，每孔2 mL，培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，PBS 沖洗2 次，4%多聚甲醛固定20 min，鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.6 細胞活力檢測

取對數(shù)生長期細胞，以1×105個/mL 接種于96孔板，每孔100 μL，每組設6 個復孔，按照CCK-8檢測試劑盒說明書測定細胞活力，于酶標儀波長450 nm 處檢測各孔吸光度（OD 值），在不含細胞培養(yǎng)液中加入等量CCK-8 溶液，按相同方法測定吸光度作為對照，計算細胞存活率。細胞存活率（%）＝（實驗孔OD 值－空白孔OD 值）÷（對照孔OD 值－空白孔OD 值）×100%。

1.7 細胞凋亡檢測

取對數(shù)生長期細胞，以1×105個/mL 接種于6 孔板，棄去上清液，PBS 洗2 次，加250 μL 胰蛋白酶消化100 s，每孔加1 mL 含血清培養(yǎng)液終止消化，1000 r/min 離心5 min，PBS 洗2 次，離心，收集細胞，用400 μL Annexin V-Binding Buffer 重懸細胞，按照Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，利用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.8 活性氧檢測細胞內

細胞處理同“1.7”項下方法，收集細胞，分別加入10μmol/L DCFH-DA工作液1mL，37℃避光孵育30min，棄去工作液，用不含胎牛血清的細胞培養(yǎng)液清洗3次，500 μL培養(yǎng)基重懸細胞，設置陰性和陽性對照，經(jīng)流式檢測細胞釋放ROS 百分比。

1.9 細胞線粒體膜電位檢測

細胞處理同“1.7”項下方法，收集細胞，每組加0.5mL 配制好的JC-1染色工作液，混勻后置于培養(yǎng)箱孵育20 min，1000 r/min離心3 min，并用配制好的JC-1染色緩沖液反復重懸洗滌細胞3次，除去未結合的多余染色液。再加入0.4mL JC-1染色緩沖液重懸細胞，過300目篩，經(jīng)流式檢測線粒體膜電位（MMP）變化，以紅綠熒光之比判斷MMP水平。

1.10 Westernblot 檢測蛋白表達

H9c2細胞按“1.4”項下方法處理，冰上完成蛋白提取，裂解液按比例加蛋白酶、磷酸酶抑制劑。蛋白樣品經(jīng)BCA 法測定濃度，按比例加入蛋白上樣緩沖液，金屬浴95℃、5min變性。經(jīng)SDS-雙丙烯酰胺凝膠電泳后電轉至PVDF膜。含5%脫脂牛奶TBST溶液封閉，加一抗LXR-α、p-p38MAPK、p-Akt、Akt、Bax、Bcl-2（1∶1000），4℃孵育過夜，次日用TBST搖洗3次×10 min，加HRP標記二抗（1∶2000），室溫孵育2h，TBST 洗滌3次×10 min，ECL 成像系統(tǒng)采集圖像，ImageJ 軟件分析條帶灰度值。

1.11 統(tǒng)計學方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用方差分析，非配對t檢驗進行兩組間比較，Bonferroni法進行校正。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 田薊苷對缺氧/復氧損傷H9c2細胞形態(tài)的影響

對照組細胞數(shù)較多，形態(tài)完整，呈完整梭形，單層簇狀生長；模型組細胞核皺縮，細胞變圓，漂浮于培養(yǎng)基上；田薊苷各劑量組細胞形態(tài)有不同程度改善，其中田薊苷中、高劑量組細胞密度略增加。見圖1。

圖1 各組H9c2細胞形態(tài)（標尺＝100μm）

2.2 田薊苷對缺氧/復氧損傷H9c2細胞活力的影響

與對照組比較，模型組細胞存活率明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，田薊苷各劑量組H9c2細胞存活率明顯升高（P＜0.05），田薊苷高劑量組升高最明顯。結果見圖2。

圖2 各組H9c2細胞存活率比較（，n＝3）

2.3 田薊苷對缺氧/復氧損傷H9c2細胞凋亡的影響

與對照組比較，模型組細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，田薊苷中、高劑量組H9c2細胞凋亡率明顯降低（P＜0.05），田薊苷高劑量組降低最明顯。結果見圖3。

圖3 各組H9c2 細胞凋亡率比較（，n＝3）

2.4 田薊苷對缺氧/復氧損傷H9c2細胞活性氧水平的影響

與對照組比較，模型組ROS含量明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，田薊苷各劑量組H9c2細胞ROS 含量明顯降低（P＜0.05）。結果見圖4。

圖4 各組H9c2細胞ROS含量比較（，n＝3）

2.5 田薊苷對缺氧/復氧損傷H9c2細胞線粒體膜電位的影響

紅色熒光JC-1 聚合物從線粒體基質釋放到胞漿，呈單體狀態(tài)，顯示綠色熒光，紅綠熒光之比降低，即MMP 明顯降低。與模型組比較，田薊苷各劑量組H9c2細胞紅綠熒光之比明顯升高（P＜0.05），田薊苷高劑量組H9c2細胞MMP升高最明顯。結果見圖5。

2.6 田薊苷達的影響對缺氧/復氧損傷H9c2細胞相關蛋白表

與對照組比較，模型組H9c2細胞LXR-α、p-Akt、Bcl-2蛋白表達明顯降低，p-p38MAPK、Bax、Caspase-3蛋白表達明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，田薊苷中、高劑量組H9c2細胞LXR-α、p-Akt、Bcl-2蛋白表達明顯升高，p-p38MAPK、Bax、Caspase-3蛋白表達明顯降低（P＜0.05）。結果見圖6。

圖5 各組H9c2細胞MMP 水平比較（，n＝3）

圖6 各組H9c2細胞LXR-α、p-p38MAPK、p-Akt、Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白表達比較（，n＝3）

3 討論

缺血再灌注損傷主要是氧供應的恢復和ROS爆發(fā)，氧化應激造成細胞結構損傷和線粒體功能代謝障礙，進而引起凋亡[18]。其病理變化是MIRI發(fā)病機制中的重要環(huán)節(jié)。因此，尋找可同時減少氧化損傷和MIRI誘導細胞凋亡的有效靶點及物是挽救受損心肌細胞的關鍵策略。

LXRs是機體抗MIRI 的重要防御因子。在心血管系統(tǒng)中LXR-α 對心肌缺血、動脈粥樣硬化和心肌肥厚等病理生理過程均具有調控作用。研究顯示，LXRs激動劑GW3695可減輕大鼠腦缺血/再灌注損傷[19]，Akt 在細胞存活和凋亡中起重要作用，MAPK通路是轉導胞外信號至胞內效應的重要級聯(lián)通路，LXR-α 可通過激活PI3K/Akt/eNOS途徑改善內皮祖細胞功能及血管損傷后的內皮再生和修復[20]，白僵菌素抑制cAMP-PKA-CREB 信號傳導并上調LXR-α 的表達，從而抑制p38MAPK[21]。此外，H/R 處理后，氧化應激狀態(tài)被認為是啟動細胞損傷的主要因素[22]。

基于以上機制，本研究采用體外培養(yǎng)大鼠心肌細胞H9c2，通過糖氧剝奪再復糖復氧建立H/R 模型。結果顯示，模型組細胞ROS 含量高于對照組，表明建模成功。給予田薊苷干預后，發(fā)現(xiàn)給藥組細胞活力顯著提升，ROS 含量減少，MMP 升高，同時細胞凋亡率降低，且呈劑量依賴性，表明田薊苷對H/R 誘導H9c2 細胞具有顯著的保護作用。本實驗結果顯示，田薊苷可外源性激活LXR-α 蛋白，繼而使Akt 磷酸化并抑制p-p38MAPK 及其通路下游Bax 的表達降低ROS 含量，提高MMP 并抑制心肌細胞凋亡。

綜上，田薊苷可能通過激活LXR-α/Akt 通路，調節(jié)p-p38MAPK 凋亡通路蛋白而發(fā)揮抑制線粒體介導的內源性細胞凋亡程序，保護心肌細胞?？紤]到心肌H/R 損傷機制較為復雜，田薊苷對LXR-α 及凋亡通路p-p38MAPK/p-Akt 上下游影響的具體機制尚不完全明確，今后將進一步深入研究。