吳曉，盧文麗，張夜航，方肇勤

上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203

原發(fā)性肝癌（primary liver cancer，PLC）發(fā)病快，致死率高，其難以治愈的關(guān)鍵點(diǎn)在于癌細(xì)胞增殖迅速，且擁有抵御不同藥物干預(yù)的復(fù)雜分子應(yīng)激網(wǎng)絡(luò)。本課題組長期以來沿治法-方藥-單味中藥-中藥有效組分-有效組分配伍思路不斷深入，從肝癌臨床常用清熱解毒、行氣活血、健脾益氣等治法及其代表性復(fù)方，以及各治法指導(dǎo)下常用中藥，通過大量體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)，篩選出行氣活血治法代表中藥預(yù)知子（Akebia Fructus），發(fā)現(xiàn)其能有效抑制不同肝癌細(xì)胞惡性增殖，其機(jī)制包括選擇性誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）等途徑，且與遺傳霉素、阿霉素、絲裂霉素、博來霉素等藥物使用后存在減量增效效應(yīng)[1-10]。上述研究為預(yù)知子聯(lián)合其他中藥/成分奠定了良好基礎(chǔ)。本研究觀察預(yù)知子提取物聯(lián)合雷公藤紅素對肝癌細(xì)胞增殖的影響，并通過細(xì)胞形態(tài)觀察、細(xì)胞凋亡檢測等對分子機(jī)制進(jìn)行初步探索，以期有助于發(fā)現(xiàn)肝癌有效治法方藥，逐步明確其潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

SMMC7721 人肝癌細(xì)胞株，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所。細(xì)胞置于10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素-鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3～4 d 傳代1 次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物

預(yù)知子飲片及醇提物均為課題組前期制備，-80 ℃分裝保存，依據(jù)2015 年版《中華人民共和國藥典》對其主要成分完成超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜（UPLC-HRMS）分析，飲片購自上?？禈蛑兴庯嬈邢薰?。60 ℃干燥過夜，粉碎，10 倍體積75%乙醇浸泡2 h，80 ℃回流2 次，每次2 h，合并回流液，過濾，濃縮，調(diào)pH 值至7.0，定容至含原藥材1 g/mL，超濾除菌，分裝后于-80 ℃保存?zhèn)溆?。雷公藤紅素，美國MCE 公司，批號20552。

1.3 主要試劑與儀器

RPMI 1640 培養(yǎng)基（批號31318005）、胎牛血清（批號 35081004）和 0.25%胰酶-EDTA（批號10519010），美國Corning 公司；噻唑藍(lán)（MTT，批號MKBH9792V），美國Sigma-Aldrich；二甲基亞砜（DMSO，批號20181221），上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；PageRulerTM預(yù)染蛋白 ladder（批號00792185），美國Thermo Scientific 公司；β-actin 鼠抗（批號85r7978），美國Affinity Biosciences 公司；葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 兔抗（Grp78，貨號3177S），美國CST 公司；鼠抗Caspase-3（貨號9668T），美國CST公司；Bax、Bcl-2、SQSTM1/p62、Chop、LC3B、Mfn2，英國Abcam 公司，批號分別為GR256474-1，GR255451-4、GR3241806-3、GR3181295-8、GR3264793-4 和GR3268716-3；細(xì)胞凋亡Hoechst 染色試劑盒（批號022519190524），上海碧云天生物技術(shù)有限公司；青霉素-鏈霉素（貨號C0222）、HRP-IgG（H+L）山羊抗兔（貨號A0208）、HRP-IgG（H+L）山羊抗小鼠（貨號A0216）、RIPA 裂解液（貨號P0013C）、PMSF 蛋白酶抑制劑（貨號ST506）、BeyoECL Plus 超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（貨號P0018S），上海碧云天生物技術(shù)有限公司。CP2250 分析天平（德國Sartorius 公司），MH-1 搖床（海門其林貝爾儀器），Model 310 CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific 公司），1300 SERIES A2 生物安全柜（美國Thermo Scientific 公司），ELX-800 全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國BioTek Instruments 公司），XDS-1B 倒置顯微鏡（重慶光學(xué)儀器廠），AxioImager M2 熒光顯微鏡（德國Zeiss 公司），PowerPacTMBasic 電泳儀及配套電泳槽（美國Bio-Rad 公司），170-3930 小型濕轉(zhuǎn)槽（美國Bio-Rad 公司），HPS RT2 Advanced 加熱磁力攪拌器（美國Thermo Scientific 公司），F(xiàn)luorChem E 化學(xué)發(fā)光高靈敏度凝膠成像與分析系統(tǒng)（美國Protein-Simple公司）。

1.4 MTT 法檢測細(xì)胞存活率和72 h IC50

將細(xì)胞接種于96 孔板，待細(xì)胞融合率達(dá)30%～40%，以不同濃度預(yù)知子醇提物（2.0、1.6、1.2、0.8、0.4 mg/mL）、雷公藤紅素（1.5、1.25、1、0.75、0.5，0.25 μmol/L）分別作用于細(xì)胞，另設(shè)空白對照組（有細(xì)胞，無藥物干預(yù)），每組設(shè)8 個(gè)復(fù)孔。72 h 后進(jìn)行MTT 檢測。吸棄原培養(yǎng)液，加入0.5 g/L MTT 溶液200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄MTT 溶液，按150 μL/孔加入DMSO，避光振搖10 min，于酶標(biāo)儀波長570 nm處檢測各孔吸光度（A），計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）＝（A用藥組－A空白孔）÷（A空白組－A空白孔）×100%。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次。計(jì)算IC50。

1.5 藥物相互作用指數(shù)

根據(jù)獲得的72 h IC50對藥物劑量適當(dāng)調(diào)整。將細(xì)胞接種于96 孔板，待細(xì)胞融合率達(dá)30%～40%，設(shè)置空白對照組、預(yù)知子醇提物組（2.0 mg/mL）、雷公藤紅素組（1.0 μmol/L）、預(yù)知子醇提物＋雷公藤紅素組（聯(lián)合組，預(yù)知子2.0 mg/mL＋雷公藤紅素1.0 μmol/L）。分別加入相應(yīng)藥物，培養(yǎng)72 h，光鏡下迅速拍照，并完成MTT 檢測。計(jì)算各組存活率并計(jì)算藥物相互作用指數(shù)（coefficient of drug interaction，CDI）。2 種藥物組合后細(xì)胞存活率用AB 表示，單個(gè)藥物細(xì)胞存活率用A 或B 表示，CDI＝AB/（A×B）。0.7≤CDI＜1表示協(xié)同，CDI＜0.7 表示顯著協(xié)同，CDI＝1 表示相加，CDI＞1 表示拮抗[11-13]。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次，每次同時(shí)設(shè)置3 塊復(fù)板。

1.6 細(xì)胞凋亡相關(guān)形態(tài)觀察

取潔凈已滅菌蓋玻片置于6 孔板，接種細(xì)胞培養(yǎng)過夜，融合率為40%～50%。次日給藥，72 h 后吸盡培養(yǎng)液，加入0.5 mL 固定液，固定10 min；去固定液，PBS 洗滌2 次，每次3 min，洗滌時(shí)用搖床晃動(dòng)；吸盡液體，加入0.5 mL Hoechst 33258 染色液，染色5 min；去染色液，PBS 清洗2 次，每次3 min；吸盡液體，滴加抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片，讓細(xì)胞接觸封片液，盡量避免氣泡；熒光顯微鏡下可檢測到呈藍(lán)色的細(xì)胞核。激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長460 nm。

1.7 Annexin V-FITC/PI 檢測細(xì)胞凋亡

收集細(xì)胞懸液，PBS 洗滌1 次，將PBS 一并收入相應(yīng)離心管；胰酶消化細(xì)胞，完全培養(yǎng)基終止消化，吹打細(xì)胞，收集至對應(yīng)離心管；1000 r/min 離心5 min，棄除上清液；PBS 清洗2 次，再以1×結(jié)合緩沖液洗滌細(xì)胞1 次；以1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106～5×106個(gè)/mL；轉(zhuǎn)入流式管，每管100 μL 細(xì)胞懸液，加5 μL Annexin V-FITC，室溫避光孵育15 min；再加入3 μL PI，室溫避光孵育10 min；每管中添加400 μL 預(yù)冷的PBS，2 h 內(nèi)上機(jī)測試完畢。數(shù)據(jù)采用FlowJo VX 軟件進(jìn)行分析。

1.8 Western blot 檢測相關(guān)蛋白表達(dá)

RIPA 裂解液裂解細(xì)胞，4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，取上清液測定蛋白濃度；蛋白上樣量約30 μg，SDS-PAGE 膠濃度為10%～12%，蛋白轉(zhuǎn)移至0.45 μm PVDF 膜上，5%BSA 室溫封閉2 h 后，Bax（1∶2000）、Bcl-2（1∶2000）、Caspase-3（1∶1000）、Grp78（1∶1000）、Chop（1∶2500）、p62（1∶2000）、LC3B（1∶20 000），Mfn2（1∶5000）一抗4 ℃孵育過夜，二抗（1∶1000）室溫孵育1 h，BeyoECL 顯色后采用FluorChem E 凝膠成像與分析系統(tǒng)獲得條帶，以β-actin 作為內(nèi)參，采用Image J 計(jì)算各條帶灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)以表示，多組間兩兩比較，方差齊用LSD法，方差不齊采用Tamhane’s T2（M）檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 單藥預(yù)知子醇提物或雷公藤紅素對SMMC7721細(xì)胞存活率的影響

由圖1、圖2 可知，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞存活率均呈下降趨勢。預(yù)知子醇提物72 h IC50為2.07 mg/mL，雷公藤紅素72 h IC50為0.92 μmol/L。為便于后續(xù)實(shí)驗(yàn)開展，根據(jù)IC50對藥物劑量做適當(dāng)調(diào)整，預(yù)知子醇提物采用2.0 mg/mL，雷公藤紅素采用1.0 μmol/L 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 預(yù)知子醇提物對SMMC7721細(xì)胞存活率的影響（，n＝8）

圖2 雷公藤紅素對SMMC7721細(xì)胞存活率的影響（，n＝8）

2.2 預(yù)知子醇提物和雷公藤紅素相互作用指數(shù)

預(yù)知子醇提物組、雷公藤紅素組較空白對照組細(xì)胞存活率顯著下降（P＜0.05），聯(lián)合組較預(yù)知子醇提物組、雷公藤紅素組細(xì)胞存活率顯著下降（P＜0.05），見表1。同時(shí)，依據(jù)存活率數(shù)值計(jì)算2種藥物CDI均值為0.45，按標(biāo)準(zhǔn)[11-13]視為具有顯著協(xié)同效應(yīng)。

表1 各組SMMC7721細(xì)胞存活率比較（）

表1 各組SMMC7721細(xì)胞存活率比較（）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與預(yù)知子醇提物組比較，#P＜0.05；與雷公藤紅素組比較，▲P＜0.05

2.3 單藥及聯(lián)合對SMMC7721細(xì)胞形態(tài)的影響

預(yù)知子醇提物組細(xì)胞增殖被抑制，出現(xiàn)空泡（箭頭所示）；雷公藤紅素組細(xì)胞增殖抑制現(xiàn)象明顯，細(xì)胞形態(tài)與預(yù)知子醇提物組區(qū)別明顯；聯(lián)合組細(xì)胞增殖抑制更顯著，視野下可見細(xì)胞數(shù)量明顯減少。見圖3。

2.4 單藥及聯(lián)合對SMMC7721細(xì)胞凋亡的影響

與空白對照組比較，預(yù)知子醇提物組細(xì)胞核無明顯變化；雷公藤紅素組個(gè)別細(xì)胞出現(xiàn)核固縮現(xiàn)象(箭頭所示)；聯(lián)合組細(xì)胞核數(shù)量顯著減少，且部分細(xì)胞核呈碎塊狀。見圖4。

圖3 各組SMMC7721細(xì)胞形態(tài)（×100）

圖4 各組SMMC7721細(xì)胞核形態(tài)（Hoechst 染色，×400）

2.5 單藥及聯(lián)合對SMMC7721細(xì)胞凋亡率的影響

與空白對照組比較，預(yù)知子醇提物組和雷公藤紅素組細(xì)胞凋亡率降低；聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率增加，較其余3組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖5。

2.6 單藥及聯(lián)合對SMMC7721細(xì)胞線粒體凋亡途徑蛋白表達(dá)的影響

各組Bax 蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與空白對照組比較，雷公藤紅素組Bcl-2蛋白表達(dá)降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；雷公藤紅素組和聯(lián)合組Caspase-3蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；聯(lián)合組cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與雷公藤紅素組比較，聯(lián)合組Bax/Bcl-2比值明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖6。

2.7 單藥及聯(lián)合對SMMC7721細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑蛋白表達(dá)的影響

與空白對照組比較，預(yù)知子醇提物組Grp78蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；雷公藤紅素組和聯(lián)合組Grp78蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；聯(lián)合組Chop蛋白表達(dá)明顯高于其余3 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖7。

圖5 各組SMMC7721細(xì)胞凋亡率比較（，n＝4）

圖7 各組SMMC7721細(xì)胞Grp78、Chop蛋白表達(dá)比較（，n＝3）

2.8 單藥及聯(lián)合對SMMC7721細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與空白對照組比較，預(yù)知子醇提物組和聯(lián)合組p62、LC3BⅡ蛋白表達(dá)及LC3BⅡ/Ⅰ比值均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而雷公藤紅素組上述各指標(biāo)均無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖8。

2.9 單藥及聯(lián)合對SMMC7721細(xì)胞線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)偶聯(lián)結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與空白對照組比較，預(yù)知子醇提物組、雷公藤紅素組和聯(lián)合組Mfn2蛋白表達(dá)均有所上調(diào)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖9。

圖8 各組SMMC7721細(xì)胞p62、LC3B蛋白表達(dá)比較（，n＝3）

圖9 各組SMMC7721細(xì)胞Mfn2蛋白表達(dá)比較（，n＝3）

3 討論

近年來，對于疾病-靶點(diǎn)-藥物的常規(guī)治療策略已逐漸轉(zhuǎn)向多種活性成分的聯(lián)合療法。這種模式的轉(zhuǎn)變，與單藥治療在慢性病、耐藥性及不良反應(yīng)等方面的局限性有關(guān)。同時(shí)，越來越多的證據(jù)表明，聯(lián)合/協(xié)同療法在應(yīng)對病因和病理生理學(xué)特征復(fù)雜的疾病，如惡性腫瘤時(shí)具有更強(qiáng)的療效優(yōu)勢，也深化了對疾病治療靶點(diǎn)和潛在多靶點(diǎn)的認(rèn)識[14-15]。

以上發(fā)展趨勢同樣體現(xiàn)在中醫(yī)藥研究領(lǐng)域。如針對肝癌患者脾氣虛弱、氣滯血瘀、痰熱邪毒等常見證候，相應(yīng)給予健脾益氣、行氣活血、清熱解毒等治法及方藥。中藥復(fù)方及其加減含有多種成分，本身已是聯(lián)合/協(xié)同用藥的表現(xiàn)形式之一。在此基礎(chǔ)上，圍繞肝癌治療領(lǐng)域的常用治法、方藥，開展處方優(yōu)化、中藥配伍及其作用機(jī)制研究，符合肝癌臨床治療方案協(xié)同發(fā)展需求。行氣活血中藥預(yù)知子的篩選，建立在本課題組早期針對肝癌患者常見證型開展的大樣本流行病學(xué)調(diào)查[16-18]，以及治療所使用的中藥復(fù)方用藥規(guī)律的回顧性分析的基礎(chǔ)上[19-21]。預(yù)知子在抑制多種肝癌細(xì)胞增殖方面效果突出，細(xì)胞出現(xiàn)典型的ERS形態(tài)學(xué)改變，ERS等通路基因差異表達(dá)活躍[1-10]。預(yù)知子特有的作用及機(jī)制，為其聯(lián)合/協(xié)同其他中藥/成分奠定基礎(chǔ)，并提供思路和選項(xiàng)。

本研究結(jié)果顯示，在明確預(yù)知子醇提物和雷公藤紅素72h IC50后，二者聯(lián)合使用抑制SMMC7721細(xì)胞增殖存在顯著協(xié)同效應(yīng)，誘導(dǎo)凋亡作用增強(qiáng)、確切。進(jìn)一步觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，預(yù)知子醇提物作用后，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)ERS樣變化，如發(fā)生空泡現(xiàn)象，與以往研究[6，9]一致，但對細(xì)胞核影響不明顯；雷公藤紅素作用后，細(xì)胞出現(xiàn)核固縮現(xiàn)象；二者聯(lián)合使用后，細(xì)胞數(shù)量顯著減少，且視野下細(xì)胞核呈碎塊狀。形態(tài)學(xué)結(jié)果提示，二者聯(lián)合后誘導(dǎo)凋亡有增強(qiáng)跡象。進(jìn)一步通過流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，預(yù)知子醇提物和雷公藤紅素各自單獨(dú)給藥時(shí)凋亡現(xiàn)象并不明顯，聯(lián)合使用顯著誘導(dǎo)凋亡發(fā)生（早期凋亡率和晚期凋亡率），故進(jìn)一步探索二者聯(lián)合作用的分子機(jī)制。

研究表明，雷公藤紅素具有多種藥理活性[22]，如可致肝癌細(xì)胞內(nèi)在線粒體凋亡通路激活，誘導(dǎo)凋亡和自噬[23]；在協(xié)同作用方面，雷公藤紅素與Bcl-2抑制劑ABT-737可協(xié)同抑制肝癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡，并伴Caspase級聯(lián)反應(yīng)激活和線粒體細(xì)胞色素C的釋放。此外有研究認(rèn)為，ERS在其中起著不可或缺的作用[24]。綜合課題組前期基礎(chǔ)和國內(nèi)外研究進(jìn)展，本研究繼續(xù)嘗試從線粒體凋亡途徑、ERS途徑、自噬途徑等方面開展機(jī)制研究。具體包括線粒體凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2及二者比值，Caspase-3和cleaved Caspase-3；ERS相關(guān)蛋白Grp78、Chop；自噬相關(guān)蛋白p62、LC3B。此外，鑒于線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)均為膜性結(jié)構(gòu)且存在緊密連接，可能互相影響，本研究進(jìn)一步嘗試檢測線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)偶聯(lián)（MAM）的標(biāo)志物Mfn2的表達(dá)量[25]，嘗試提供更多的分子依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，線粒體凋亡途徑——經(jīng)典的Caspase依賴途徑方面，對凋亡貢獻(xiàn)程度不大；ERS相關(guān)蛋白Grp78，自噬相關(guān)蛋白p62、LC3B相對活躍；MAM 結(jié)構(gòu)作用還有待研究。具體表現(xiàn)為促凋亡蛋白Bax和抑凋亡蛋白Bcl-2的變化并不明顯；進(jìn)一步結(jié)合Bax/Bcl-2比值發(fā)現(xiàn)，雷公藤紅素組該比值呈升高趨勢，但與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Bax、Bcl-2的表達(dá)及其比值在肝癌細(xì)胞凋亡中被視為具有重要的調(diào)控作用[26]，提示雷公藤紅素可能與凋亡發(fā)生的關(guān)聯(lián)更大。此外，與空白對照組比較，各給藥組Caspase-3和cleaved Caspase-3表達(dá)量總體呈下降趨勢，且以聯(lián)合組最明顯（P＜0.05）。與空白對照組比較，雷公藤紅素組和聯(lián)合組Grp78蛋白表達(dá)均明顯升高（P＜0.05），且聯(lián)合組表達(dá)量較單藥組升高更明顯（P＜0.05）；單藥組Chop蛋白表達(dá)變化不明顯，聯(lián)合組表達(dá)明顯升高（P＜0.05），提示二者有協(xié)同效應(yīng)。與空白對照組比較，預(yù)知子醇提物組、聯(lián)合組p62、LC3BⅡ蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05），而2組間無明顯差異，雷公藤紅素組無明顯變化。MAM結(jié)構(gòu)標(biāo)志物Mfn2各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于本次僅檢測了MAM結(jié)構(gòu)的一種分子，其他標(biāo)志物如Drp1等均未涉及，不可避免存在局限性。就入選的4種途徑9個(gè)蛋白分子而言，預(yù)知子醇提物和雷公藤紅素作用靶點(diǎn)不盡相同；二者一致性效應(yīng)機(jī)制方面，除Caspase-3和cleaved Caspase-3、Chop和Mfn2等分子外，尚需進(jìn)一步關(guān)注其他介導(dǎo)凋亡信號的途徑或分子。

綜上，本研究明確了預(yù)知子醇提物和雷公藤紅素聯(lián)合抑制SMMC7721 細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡的一致性效應(yīng)，并對分子機(jī)制進(jìn)行了初步探索。但二者各自及聯(lián)合作用的具體機(jī)制仍有待今后深入挖掘。