李靜 ，鐘森杰，李亮，吳華英，資源，袁志鷹，黃惠勇

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷研究所，湖南 長沙 410208；3.衡陽市中醫(yī)醫(yī)院，湖南 衡陽 421001

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（coronary atherosclerotic heart disease，CHD）是指因冠狀動脈發(fā)生粥樣硬化或痙攣引起管腔閉塞或狹窄，導(dǎo)致心肌缺血、缺氧或壞死而引發(fā)的心臟病變[1]。據(jù)統(tǒng)計，在我國CHD 是死亡率最高的疾病[2]。CHD 屬中醫(yī)學(xué)“胸痹”“心痛”等范疇，屬本虛標(biāo)實之證，本虛為氣血陰陽虧虛，標(biāo)實為寒凝、血瘀、痰濁、氣滯等，而血瘀證是CHD 中最常見的證型之一[3-4]。CHD 血瘀證主要表現(xiàn)為胸部刺痛、絞痛，固定不移，痛引肩背或臂內(nèi)側(cè)，胸悶，心悸不寧，唇舌紫黯，或有瘀斑，舌下絡(luò)脈青紫，脈沉澀或結(jié)代[5]。

代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)研究的重要組成部分，分析技術(shù)具有高通量、高靈敏度、高精確度的特點，使生物體內(nèi)源性代謝物質(zhì)變化規(guī)律與疾病生理病理變化相契合[6]。代謝組學(xué)研究思路具有整體性、動態(tài)性和系統(tǒng)性的特點，與中醫(yī)學(xué)的哲學(xué)思想具有一致性[7]。因此，本研究以CHD 血瘀證模型大鼠為研究對象，運用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-QE-MS）代謝組學(xué)技術(shù)進行檢測，分析CHD 血瘀證模型大鼠尿液內(nèi)源性代謝物及代謝通路的變化，以期從代謝組學(xué)角度闡明CHD 血瘀證潛在的生物學(xué)基礎(chǔ)，為CHD 有效防治提供新思路。

1 材料和方法

1.1 動物

SPF 級雄性SD 大鼠20 只，體質(zhì)量（220±20）g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（湘）2019-0004。分籠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF 級動物房，溫度22～26 ℃，相對濕度40%～65%。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后開始實驗。

1.2 藥物、試劑與儀器

注射用青霉素鈉（80 U/支，華北制藥股份有限公司，批號20190418），鹽酸利多卡因注射液（5 mL，0.1 g/支，國藥集團容生制藥有限公司，批號20190618）。甲醇（批號67-56-1，CNW Technologies），乙腈（批號75-05-8，CNW Technologies），乙酸銨（批號 631-61-8，CNW Technologies），氨水（批號1336-21-6，CNW Technologies）。小動物呼吸機-220V（深圳市瑞沃德生命科技有限公司），P150 型16 通道多導(dǎo)電生理記錄儀（美國BIOPAC 公司），Vanquish型超高效液相色譜儀（Thermo Fisher Scientific），Q Exactive HFX 型高分辨質(zhì)譜儀（Thermo Fisher Scientific），BSA124S-CW 天平（Sartorius），Heraeus Fresco17 離心機（Thermo Fisher Scientific），D24UV純水儀（Merck Millipore），PS-60AL 超聲儀（深圳市雷德邦電子有限公司）。

1.3 分組與造模

20 只大鼠按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、CHD血瘀證模型組，每組10 只。CHD 血瘀證模型組大鼠參考文獻[8-9]方法，采用結(jié)扎左冠狀動脈前降支方法制備CHD 血瘀證模型。CHD 血瘀證模型組大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，背位固定，頸部消毒，暴露氣管，連接小動物呼吸機，行氣管插管，設(shè)置呼吸頻率85 次/min，潮氣量8～10 mL/kg，呼吸比為2∶1。大鼠機械通氣正常后，于左側(cè)第3、4 肋間切開皮膚，鈍性分離，充分暴露心臟，用6-0 帶線縫合針在左心耳與肺動脈圓錐交界稍下約2～3 mm 處結(jié)扎左冠狀動脈前降支，以結(jié)扎部位以下心肌變白、搏動減弱且心電圖表現(xiàn)為ST 段弓背抬高或/和T 波高聳或與其形成單向曲線為造模成功。關(guān)閉胸腔，縫合傷口。術(shù)后連續(xù)3 d 肌肉注射青霉素鈉預(yù)防感染。假手術(shù)組開胸后，只穿線不結(jié)扎，其余步驟同CHD 血瘀證模型組。大鼠自由飲水，正常進食。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 HE 染色

造模成功后第3 日處死大鼠，開胸取心肌組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，依次脫水，行HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察心肌形態(tài)。

1.4.2 尿液代謝組學(xué)檢測

造模成功后第3 日7:00 輕提大鼠尾根部，按摩膀胱，多次采集大鼠晨尿樣本，用尿液存儲器迅速收集尿液，過濾，分裝至1.5 mL EP 管，4 ℃、1000 r/min離心5 min，取上清液，并移至凍存管，液氮速凍30 s后取出，置于-80 ℃冰箱保存。樣本4 ℃融化，進行上機檢測前處理：①根據(jù)樣品滲透壓，加入一定體積的水；②加入400 μL 提取液[（甲醇∶乙腈＝1∶1（V/V），含同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)混合物）]，渦旋混勻30 s；③超聲10 min（冰水浴）；④-40 ℃靜置1 h；⑤將樣品4 ℃、12 000 r/min 離心15 min；⑥取上清液于進樣瓶中上機檢測；⑦所有樣品另取等量上清，混合成質(zhì)控樣品上機檢測。

UPLC-QE-MS檢測條件：采用Vanquish超高效液相色譜儀，通過WatersACQUITY UPLCBEH Amide 液相色譜柱（2.1 mm×100mm，1.7μm）對目標(biāo)化合物進行色譜分離。流動相A為水相，含25mmol/L乙酸銨和25mmol/L氨水，B為乙腈。采用梯度洗脫：0～0.5 min，95%B；0.5～7 min，95%～65%B；7～8 min，65%～40%B；8～9 min，40%B；9～9.1min，40%～95%B；9.1～12 min，95%B。流速：0.5mL/min；柱溫：25℃；樣品盤溫度：4℃；進樣體積：3μL。

1.5 數(shù)據(jù)處理

ThermoQExactive HFX 質(zhì)譜儀能在控制軟件（Xcalibur，Thermo）控制下進行一級、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。經(jīng)UPLC-QE-MS檢測，得到原始數(shù)據(jù)，利用ProteoWizard 軟件轉(zhuǎn)成mzXML格式后，使用自主編寫的R程序包（內(nèi)核為XCMS）進行峰識別、峰提取、峰對齊和積分等處理，然后與BiotreeDB（V2.1）自建二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫匹配進行物質(zhì)注釋，算法打分的Cutoff 值設(shè)為0.3。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SIMCA 軟件（V15.0.2）對原始數(shù)據(jù)進行對數(shù)轉(zhuǎn)換加中心化（CTR）格式化處理，然后進行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）。以t檢驗P＜0.05和VIP＞1.5為條件，篩選潛在內(nèi)源性差異代謝物。運用Metabo Analyst4.0（https://www.metaboanalyst.ca/）通路軟件，利用鑒定出的差異代謝物KEGG ID進行通路富集分析，以原始P＜0.05為條件，篩選出富集顯著的代謝通路。采用SPSS24.0統(tǒng)計軟件進行分析，實驗數(shù)據(jù)以表示，符合正態(tài)分布及方差齊性者采用獨立樣本t檢驗，不符合則采用秩和檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE 染色結(jié)果

假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞橫紋清晰，排列整齊，細(xì)胞核清晰，多呈橢圓形，細(xì)胞質(zhì)染色均勻，未見血管擴張及炎細(xì)胞浸潤；CHD血瘀證模型組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，心肌纖維化粗大，細(xì)胞核邊緣不清，可見血管擴張，淋巴細(xì)胞浸潤。見圖1。

2.2 尿液正負(fù)離子基峰譜圖

在正負(fù)離子模式下，尿液樣本經(jīng)UPLC-QE-MS檢測后，繪制代表性尿液正負(fù)離子基峰譜圖，見圖2。

2.3 代謝輪廓分析

2組大OPLS-DA 代鼠尿液樣本在謝輪廓分析正負(fù)離子模，獲得相應(yīng)式下，經(jīng)P得分圖。PC CA 和A 得分圖見圖3，樣本在二維空間上表現(xiàn)出分離狀態(tài)，無重疊部分，反映2組大鼠尿液樣本代謝輪廓的改變。OPLS-DA 得分圖見圖4，樣本呈對稱分布，2組間分離明顯，表明2組樣本存在顯著差異，提示建模后大鼠機體正常生理代謝受影響。

圖1 2 組大鼠心肌組織形態(tài)（HE染色，×200）

圖2 2 組大鼠尿液樣本正負(fù)離子模式基峰譜圖

2.4 差異代謝產(chǎn)物篩選

以VIP＞1.5、P＜0.05為篩選條件，最終得到36種組間差異代謝物。與假手術(shù)組比較，CHD血瘀證模型組甘油、L-硒代蛋氨酸、尿嘧啶含量增加，N-乙?；?L-天門冬氨酸、丙氨酰亮氨酸、D-丙氨酸、氨基葡萄糖6-磷酸、D-核糖5-磷酸、纈氨酸賴氨酸、丙氨酰谷氨酸、賴氨酰纈氨酸、草酰乙酸、丙酮酸、纈氨酸、D-木酮糖、脯氨酰脯氨酸、5’-磷酸吡哆醛、4-乙酰氨基丁酸、假尿苷、D-核糖、尿酸、海藻糖、1H-吲哚-3-甲醛、5-磷酸-α-D-核糖1-二磷酸、α-D-核糖1,2-環(huán)磷酸鹽5-磷酸鹽、脫氧腺苷、泛酸、N-乙酰丙酮酰谷氨酸、D-木糖醇、磷酸烯醇丙酮酸鹽、乳糖、L-硒代半胱氨酸、硒代胱氨酸、5-氨基咪唑-4-羧酰胺、D-葡糖醇-1,5-內(nèi)酯6-磷酸鹽、磷酸甘油含量減少，代謝產(chǎn)物信息詳見表1。

圖3 2 組大鼠尿液液正負(fù)離子模式PCCA 得分圖

圖4 2 組大鼠尿尿液正負(fù)離子模式式OPLS-DA 得分圖圖

表1 2組組大鼠尿液差異代代謝物

2.5 顯著代謝通路分析

為進一步探討差異代謝物與CHD 血瘀證的關(guān)系，運用Metabo Analyst4.0通路軟件進行生物代謝通路富集及拓?fù)浞治?，代謝通路分析概要圖見圖5。以原始P＜0.05為篩選條件，鑒定涉及9條顯著代謝通路：丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，磷酸戊糖途徑，糖酵解/糖異生，泛酸和輔酶A（CoA）生物合成，檸檬酸鹽循環(huán)（TCA 循環(huán)），丙酮酸代謝，嘌呤代謝，甘油脂代謝，戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互轉(zhuǎn)化。差異代謝物代謝通路具體信息見表2。

圖5 代謝通路分析概要圖

表2 顯著代謝通路具體信息

3 討論

代謝組學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)研究的重要組成部分，直接反映疾病病理過程代謝化合物的共性和特征性指標(biāo)，能在區(qū)分疾病模型上發(fā)揮獨特作用[10]。尿液樣本所含的信息豐富，采集樣本具有無創(chuàng)性、可重復(fù)性，因此，尿液在代謝組學(xué)研究中具優(yōu)勢[11]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，CHD血瘀證模型組大鼠尿液中代謝產(chǎn)物含量紊亂，篩選出36個代謝標(biāo)志物，涉及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，磷酸戊糖途徑，糖酵解/糖異生，泛酸和CoA 生物合成，檸檬酸鹽循環(huán)（TCA 循環(huán)），丙酮酸代謝，嘌呤代謝，甘油脂代謝，戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互轉(zhuǎn)化等顯著代謝通路。

其中3條糖代謝通路分別為磷酸戊糖途徑、戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互轉(zhuǎn)化、糖酵解/糖異生。磷酸戊糖途徑通路包括D-核糖5-磷酸、D-核糖、D-葡糖醇-1,5-內(nèi)酯6-磷酸鹽、5-磷酸-α-D-核糖1-二磷酸。磷酸戊糖途徑是機體糖代謝的重要途徑之一，是葡萄糖氧化分解的重要方式，以6-磷酸葡萄糖為起點，直接進行脫氫和脫羧反應(yīng)，生成大量NADPH 和磷酸核糖，為體內(nèi)多種代謝供氫體和碳源[12]。戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互轉(zhuǎn)化通路包括D-木酮糖、D-木糖醇。葡萄糖醛酸形成木酮糖，可與磷酸戊糖途徑相連，研究表明戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互轉(zhuǎn)化通路與軛合反應(yīng)有關(guān)[13]。糖酵解/糖異生通路有丙酮酸、磷酸烯醇丙酮酸鹽、草酰乙酸、磷酸甘油參與。心臟缺氧時，ATP生成減少，糖酵解途徑通過加強底物磷酸化，糖酵解途徑通過加強底物磷酸化以生成ATP，從而補充心肌能量的不足[14]。糖異生通路是生物合成葡萄糖的重要途徑，以補充糖供應(yīng)的不足。已有研究表明，心肌缺血狀態(tài)下，蛋白質(zhì)功能產(chǎn)能不足，通過糖代謝分解產(chǎn)生能量以此供應(yīng)心肌[15]。以上研究表明，CHD血瘀證病理過程中存在多條糖代謝紊亂，提示糖氧化供能障礙，機體處于磷酸戊糖途徑、戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互轉(zhuǎn)化、糖酵解/糖異生等糖代謝途徑過度激活的應(yīng)急代謝狀態(tài)。

丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸通路包括N-乙?；?L-天門冬氨酸、N-乙酰丙酮酰谷氨酸、草酰乙酸、丙酮酸、氨基葡萄糖6-磷酸參與。丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸途徑經(jīng)過氨基化的底物為丙酮酸、草酰乙酸、α-酮戊二酸。有研究表明，草酰乙酸是TCA 循環(huán)的起點，α-酮戊二酸是TCA 循環(huán)的重要中間產(chǎn)物，丙酮酸參與TCA 循環(huán)的回補反應(yīng)，維持TCA 循環(huán)的進行[16]。因此，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸通路異常將影響丙酮酸、草酰乙酸、α-酮戊二酸，最終影響TCA循環(huán)。本研究也發(fā)現(xiàn)丙酮酸代謝和TCA 循環(huán)通路的紊亂。冠狀動脈粥樣硬化引起心肌缺氧，使心肌能量發(fā)生代謝障礙，而TCA循環(huán)途徑異常則是能量代謝紊亂的標(biāo)志[17]。心臟能量利用率低下，需氧量增加，因此出現(xiàn)心率加快、呼吸不暢、胸悶胸痛等表現(xiàn)。

泛酸、纈氨酸、尿嘧啶參與泛酸和CoA 生物合成途徑，其中泛酸、纈氨酸含量減少，尿嘧啶含量增加。泛酸是CoA 生物合成的重要前體物質(zhì)之一，并參與生物體內(nèi)氨基酸類、糖類、脂類、蛋白質(zhì)類的能量代謝。研究表明，泛酸對脂質(zhì)過氧化損傷的細(xì)胞和大鼠具有保護作用[18]。本實驗結(jié)果顯示，當(dāng)CHD 血瘀證發(fā)生時，由于泛酸和纈氨酸含量降低，導(dǎo)致生物體內(nèi)CoA 合成減少，引起相關(guān)代謝途徑紊亂。甘油、磷酸甘油參與甘油脂代謝，其脂代謝異常視為CHD發(fā)病的危險因素之一。脂代謝異常時，動脈內(nèi)膜細(xì)胞功能發(fā)生改變、受損，脂質(zhì)物質(zhì)在血管內(nèi)皮下沉積引起動脈粥樣硬化[19-20]。有研究表明，脂代謝異常引起血液黏度增高等血液流變學(xué)變化是CHD 血瘀證微觀辨證的重要指標(biāo)[21]，與本研究結(jié)果一致。

嘌呤代謝途徑有D-核糖5-磷酸、5-磷酸-α-D-核糖1-二磷酸、脫氧腺苷、5-氨基咪唑-4-羧酰胺參與。嘌呤代謝途徑經(jīng)嘌呤堿基最終分解生成尿酸，是人體嘌呤代謝的終末產(chǎn)物。生成尿酸部位主要是血管壁，特別是血管內(nèi)皮細(xì)胞，尿酸含量減少，在血管壁上沉積，損傷血管內(nèi)膜，引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和低密度脂蛋白膽固醇的氧化，導(dǎo)致冠狀動脈粥樣硬化加重[22]。

本研究利用代謝組學(xué)技術(shù)檢測分析，揭示了CHD血瘀證潛在的生物學(xué)基礎(chǔ)，病理機制涉及能量代謝失衡及氨基酸代謝、糖代謝、嘌呤代謝紊亂，脂質(zhì)堆積等多個層面，提示CHD 血瘀證發(fā)病的復(fù)雜病理過程，為疾病早期預(yù)測和臨床診斷提供了依據(jù)。