韓洪翠，張艷玲，路芳，畢磊，黃運(yùn)芳，馬鵬凱，張玉杰

北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488

交泰丸是治療失眠癥的經(jīng)典名方，由黃連、肉桂按10∶1 組成，具有交通心腎、鎮(zhèn)靜安神功效，用于心腎不交引起的驚悸、夜寐不安等癥。目前，交泰丸研究多集中于藥理、化學(xué)成分和臨床等，且鎮(zhèn)靜催眠作用是研究較多的方向之一[1]，但由于交泰丸成分復(fù)雜，其鎮(zhèn)靜催眠藥效物質(zhì)及作用機(jī)制尚未完全明確。已知交泰丸可通過(guò)調(diào)節(jié)5-羥色胺（5-HT）、γ-氨基丁酸（GABAA）等中樞神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠作用[2-3]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用分子對(duì)接技術(shù)，選取與中樞鎮(zhèn)靜催眠、降壓等密切相關(guān)的3 個(gè)蛋白受體，即5-HT1A受體、GABAA 受體、多巴胺D3（DRD3）受體作為蛋白靶標(biāo)，研究其與交泰丸主要成分小檗堿（BBR）、黃連堿（COP）、巴馬?。≒AL）、表小檗堿（EBBR）、藥根堿（JAT）的結(jié)合活性，同時(shí)結(jié)合蛋白mRNA 表達(dá)實(shí)驗(yàn)，探究交泰丸鎮(zhèn)靜催眠藥效物質(zhì)及其治療失眠的分子作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)4 周齡雄性昆明小鼠56 只，體質(zhì)量18～20 g，斯貝福（北京）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2011-0004。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級(jí)環(huán)境，12 h 光照/黑夜循環(huán)，溫度25 ℃，濕度60%，自由攝食飲水。

1.2 藥物與試劑

BBR、PAL 對(duì)照品（批號(hào)分別為713-8702、732-8701），中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度≥98%；COP、EBBR、JAT 對(duì)照品（批號(hào)分別為MUST-12111602、MUST-14101309、MUST-14090711），成都曼思特生物技術(shù)有限公司，純度≥98%；對(duì)氯苯丙胺酸（PCPA），批號(hào)20131101-17，美國(guó)Sigma 公司；Trizol Reagent試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑，Invitrogen公司；DEPC 水，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；其他試劑均為分析純。

1.3 儀器

Q-5000 型紫外分光光度計(jì)（Quwell 公司），WD-9413 型凝膠成像分析儀（北京六一儀器廠），DG-3D 型大型水平電泳槽、DG-Ⅲ型雙穩(wěn)數(shù)顯電泳儀（北京東林昌盛生物科技有限責(zé)任公司），ABI PRISM 7500 型熒光定量PCR 儀（ABI 公司），3K18型離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司），9600型普通PCR儀（ABI公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 同源模建

5-HT1A受體同源模型多以2 種人β2 腎上腺素能受體[4]或牛視紫紅質(zhì)受體[5]（PDB 代碼分別為2RH1、3D4S、1U19，http://www.rcsb.org）為模板建立，將5-HT1A受體序列（P08908，http://www.uniprot.org）分別與以上3 種蛋白晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行序列對(duì)比，選取同源性較高蛋白為模板蛋白。用Discovery Studio2016 軟件同源模建，得到20個(gè)模型，選擇PDF Total Energy、DOPE score 均最低的模型作為目標(biāo)蛋白。通過(guò)Ramachandran Plot 和Profile-3D 對(duì)同源模建蛋白模型進(jìn)行評(píng)估。

2.2 分子對(duì)接

2.2.1 小分子配體及受體準(zhǔn)備

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)3 種受體蛋白的性質(zhì)選擇臨床陽(yáng)性藥作為參考配體，見(jiàn)表1。

表1 靶標(biāo)及參考配體信息

用ChemOffice2019 軟件獲得阿米替林、巴比妥、BP-897 和5 種黃連生物堿小分子初始3D 結(jié)構(gòu)，用Discovery Studio2016 軟件進(jìn)行配體準(zhǔn)備及能量最小化，得到優(yōu)化后配體。導(dǎo)入同源模建得到5-HT1A受體蛋白，并在PDB 庫(kù)中下載GABAA 和DRD3 受體的晶體結(jié)構(gòu)，去掉結(jié)構(gòu)中水分子和原配體，補(bǔ)充非完整的氨基酸殘基，為蛋白加氫等，得到優(yōu)化后受體。

2.2.2 活性位點(diǎn)確定與分子對(duì)接

根據(jù)5-HT1A受體與7 個(gè)配體對(duì)接結(jié)果[4]，選擇產(chǎn)生作用最多的ILE189 為活性氨基酸位點(diǎn)；GABAA受體α1 亞型（Gabra1）中PHE65 可決定配體親和力，且相鄰ARG67 可促進(jìn)配體結(jié)合位點(diǎn)形成[6]，因此，選擇與ARG65 相鄰PHE62 氨基酸殘基為GABAA 受體活性結(jié)合位點(diǎn)；根據(jù)模建DRD3 活性氨基酸位點(diǎn)ASP117[7]，選擇位置相似、類型相同ASP110 氨基酸殘基作為活性位點(diǎn)。基于以上活性氨基酸位點(diǎn)確定結(jié)合口袋，用Discovery Studio2016 軟件Libdock 模塊將3個(gè)受體分別與5 種黃連生物堿和對(duì)應(yīng)的參考配體對(duì)接。

2.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.3.1 造模及分組

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，隨機(jī)分為對(duì)照組8 只和造模組48只。造模組腹腔注射PCPA（400mg/kg）混懸液，對(duì)照組注射等量生理鹽水，連續(xù)2d，28～30 h觀察小鼠行為[8]。造模組注射30h后白日活動(dòng)量增加，無(wú)法入睡、攝食量減少、敏感性較強(qiáng)，表明造模成功。再分為模型組和5種黃連生物堿給藥組各8只。

2.3.2 給藥

造模第3 日，各給藥組分別給予BBR、PAL、COP、EBBR 和JAT 5種黃連生物堿0.3g，分別用30mL生理鹽水混勻灌胃，給藥劑量100 mg/（kg.d），對(duì)照組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃，連續(xù)7 d。第7 日灌胃1h 后，斷頭處死，冰浴迅速取出全腦，液氮冷凍，置于-80℃冰箱保存。

2.3.3 qPCR 檢測(cè)

Trizol提取小鼠腦組織總RNA。Q-5000紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度及純度，保證其純度在1.7～2.0。取5μL RNA 溶液進(jìn)行1%瓊脂糖膠電泳，5 V/cm 電壓電泳20 min，拍照，檢測(cè)RNA完整性。然后以提取的總RNA 為模板，使用Invitrogen 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA的合成。PCR反應(yīng)體系：cDNA 1μL，上游與下游引物各0.25μL，PCR 反應(yīng)mix×（AmpliTaq Gold?FastDNA PolymeraseLD，10×buffer，SYBR?Green 1，dNTPs）12.5μL，滅菌水10.5μL，總反應(yīng)體系25μL；反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2min，94℃變性30 s，62℃退火30s，72℃延伸30s，共35次循環(huán)，72℃、10min 終止反應(yīng)。采用2-ΔΔCt法對(duì)目的基因進(jìn)行相對(duì)定量分析。引物均委托鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，引物序列見(jiàn)表2。

表2 PCR 各基因引物序列

3 結(jié)果

3.1 5-羥色胺1A 受體模型建立

5-HT1A受體序列對(duì)比結(jié)果顯示，2RH1和序列的同源性與相似性最高，見(jiàn)表3。因此，以2RH1為模板進(jìn)行同源模建，選擇可信度與質(zhì)量最高的模型為目標(biāo)蛋白（見(jiàn)圖1）。Ramachandran 圖評(píng)估結(jié)果（見(jiàn)圖2）顯示，psi-phi 構(gòu)象不合理氨基酸（紅色點(diǎn)）有4個(gè)，小于氨基酸總數(shù)5%，表明5-HT1A受體模型氨基酸二面角結(jié)構(gòu)較合理。Profile-3D評(píng)估結(jié)果顯示，模型Verify Score、Verify Expected Low Score和Verify Expected HighScore分別為108.59、190.252、85.6135，且Verify Score位于Verify Expected Low Score和Verify Expected High Score 之間，說(shuō)明模型質(zhì)量較高。

表3 5-HT1A 受體序列對(duì)比結(jié)果（%）

圖1 5-HT1A 受體3D模型

圖2 5-HT1A 受體Ramachandran圖

3.2 分子對(duì)接結(jié)果

LibDock分子對(duì)接結(jié)果見(jiàn)表4。5種黃連生物堿與5-HT1A、GABAA、DRD3受體打分結(jié)果均較高，表明配體小分子與受體結(jié)合活性均較高，且其中EB BR 打分高于參考配體阿米替林，5種生物堿打分結(jié)果均高于參考配體巴比妥，顯示中藥小分子針對(duì)受體蛋白靶向治療失眠的潛力，而參考配體BP-897作為DRD3受體激動(dòng)劑，其打分結(jié)果高于5種黃連生物堿，表現(xiàn)了BP-897對(duì)DRD3受體的高親和力。配體小分子與5-HT1A、GABAA、DRD3受體蛋白的分子對(duì)接二維平面圖（見(jiàn)圖3～圖5）顯示，各對(duì)接構(gòu)象同受體蛋白氨基酸殘基之間相互作用力。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，配體主要與5-HT1A受體氨基酸殘基GLY237、THR236形成氫鍵，加強(qiáng)小分子與蛋白的結(jié)合，同時(shí)與ASP239和ARG227等氨基酸殘基產(chǎn)生靜電作用和疏水作用；配體主要與GABAA 受體氨基酸殘基LYS66、ALA72等產(chǎn)生疏水作用，與氨基酸殘基LEU70、LYS66等產(chǎn)生氫鍵作用，極少產(chǎn)生靜電作用；配體與DRD3受體蛋白之間產(chǎn)生的非鍵相互作用主要為氫鍵作用和疏水作用，產(chǎn)生作用的主要氨基酸殘基分別為SER192、VAL111和PHE346，只與氨基酸殘基ASP110產(chǎn)生靜電作用。

表4 LibDock 分子對(duì)接結(jié)果（分）

圖3 各配體小分子與5-HT1A 受體相互作用二維平面圖

圖4 各配體小分子與GABAA受體相互作用二維平面圖

圖5 各配體小分子與DRD3受體相互作用二維平面圖

3.3 qPCR 檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照組比較，模型組小鼠腦組織5-HT1A、Gabra1和DRD3mRNA 表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01）；與模型組比較，COP組小鼠腦組織除DRD3mRNA表達(dá)上調(diào)不明顯外，5-HT1A、Gabra1mRNA 表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01），余4種生物堿組5-HT1A、Gabra1、DRD3mRNA 表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)表5。

表5 各組小鼠腦組織5-HT1A、Gabra1 和DRD3 mRNA 表達(dá)比較（）

表5 各組小鼠腦組織5-HT1A、Gabra1 和DRD3 mRNA 表達(dá)比較（）

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

4 討論

失眠癥屬中醫(yī)學(xué)“不寐”范疇，是由臟腑機(jī)能紊亂、氣血虧虛、陰陽(yáng)失調(diào)引起的，導(dǎo)致不能獲得正常睡眠的一類病癥。交泰丸是治療心腎不交型失眠的常用基礎(chǔ)方劑，前期研究發(fā)現(xiàn)，交泰丸透過(guò)血腦屏障的主要成分為黃連生物堿，且其在病理動(dòng)物模型上表現(xiàn)出顯著差異的腦分布特征[9]。由此推測(cè)，黃連生物堿可能是交泰丸鎮(zhèn)靜催眠的藥效物質(zhì)。

當(dāng)今，計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)（CADD）、分子烙印技術(shù)等已成為藥物研發(fā)領(lǐng)域的一部分[10]。而分子對(duì)接技術(shù)作為CADD 受體的一種方法，可迅速且較精確地預(yù)測(cè)受體和配體結(jié)合模式，在研究中藥有效成分的潛在靶標(biāo)及作用機(jī)制方面有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[11]。近年隨著醫(yī)學(xué)研究的推進(jìn)，發(fā)現(xiàn)多數(shù)中樞神經(jīng)遞質(zhì)在調(diào)節(jié)睡眠-覺(jué)醒節(jié)律中發(fā)揮了重要的作用[12]。研究表明，交泰丸催眠的藥理作用與其影響調(diào)節(jié)睡眠中樞神經(jīng)遞質(zhì)腎上腺素和5-HT 釋放有關(guān)[2]；交泰丸可增加PCPA模型大鼠GABAA 受體表達(dá)，從而發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠作用[3]；此外，作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)，多巴胺可通過(guò)其特異性受體，發(fā)揮影響學(xué)習(xí)記憶、調(diào)節(jié)“睡眠-覺(jué)醒”、參與認(rèn)知與情感等多種復(fù)雜的生理功能，在多巴胺受體中D3 受體親和力最高。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇5-HT1A、GABAA、DRD3 受體做為分子對(duì)接靶標(biāo)，與交泰丸的5 種主要黃連生物堿及相應(yīng)的參考配體進(jìn)行分子對(duì)接打分，預(yù)測(cè)配體與受體之間的結(jié)合活性。結(jié)果顯示，5-HT1A、GABAA、DRD3受體與配體之間打分結(jié)果均較高，結(jié)合5 種黃連生物堿與受體之間的結(jié)合活性，可看出結(jié)合活性較高的原小檗堿型生物堿為EBBR、BBR 和COP。

為進(jìn)一步探究交泰丸鎮(zhèn)靜催眠的藥效物質(zhì)及其分子機(jī)制，本研究使用PCPA 建立失眠小鼠模型，通過(guò)測(cè)定小鼠腦組織5-HT1A、Gabra1 和DRD3 受體mRNA 的表達(dá)，評(píng)估交泰丸鎮(zhèn)靜催眠藥效物質(zhì)對(duì)中樞神經(jīng)遞質(zhì)受體的影響。結(jié)果顯示，除COP 組DRD3受體表達(dá)上調(diào)不明顯外，5 種黃連生物堿均可顯著上調(diào)5-HT1A、Gabra1 和DRD3 受體表達(dá)，其中上調(diào)作用較明顯的生物堿為BBR、PAL 和JAT。結(jié)合分子對(duì)接與靶標(biāo)蛋白mRNA 表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小檗堿結(jié)合活性與分子作用強(qiáng)度均較高，而結(jié)合活性較高的EBBR 與COP 分子作用強(qiáng)度不高。造成此差異的原因可能是5 種黃連生物堿成分在生物體內(nèi)跨血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)能力不同，由于小分子化合物與血漿蛋白結(jié)合后不易透過(guò)血腦屏障，結(jié)合黃連生物堿進(jìn)入腦中的含量差異[13]與其血漿蛋白結(jié)合率的差異[14]，可以看出BBR跨血腦屏障運(yùn)輸?shù)哪芰?qiáng)，而EBBR 與COP 不易透過(guò)血腦屏障；此外，3 種神經(jīng)遞質(zhì)受體在小鼠腦組織分布差異也可能是導(dǎo)致2 個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異的原因之一。在交泰丸分子作用機(jī)制方面，5 種黃連生物堿對(duì)中樞神經(jīng)遞質(zhì)受體的影響結(jié)果表明，原小檗堿型生物堿能提高5-HT1A、Gabra1、DRD3 受體mRNA 的表達(dá)，從而增加神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、GABAA、多巴胺與受體的結(jié)合，促進(jìn)慢波睡眠形成[12]，抑制嚙齒動(dòng)物本能運(yùn)動(dòng)[15]，起到治療失眠作用。

本研究選擇已經(jīng)證實(shí)的與中樞神經(jīng)系統(tǒng)鎮(zhèn)靜催眠、降壓等作用密切相關(guān)的3 種受體探究交泰丸鎮(zhèn)靜催眠藥效物質(zhì)及其治療失眠的機(jī)制，表明原小檗堿型生物堿成分是交泰丸的鎮(zhèn)靜催眠藥效物質(zhì)，其中小檗堿作用最強(qiáng)，且可通過(guò)影響5-HT1A、Gabra1、DRD3等受體的表達(dá)治療失眠，但由于黃連生物堿具有多靶點(diǎn)的特性，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。