福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院胸外科，福建 泉州 362000

食管癌是上消化道常見(jiàn)的癌癥之一，也是全球癌癥相關(guān)死亡率的第6大主要原因。食管癌患者的常規(guī)臨床治療包括手術(shù)、放療和化療［1］。盡管近年來(lái)改良了治療技術(shù)，但食管癌患者的總體5年生存率仍僅為20%～30%［2］。因此，了解食管癌發(fā)病的分子機(jī)制，對(duì)于發(fā)現(xiàn)更多的腫瘤特異性生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，進(jìn)行早期診斷和治療具有重要意義。miRNA是一類高度保守的、非編碼的18～25個(gè)核苷酸的RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平上起負(fù)調(diào)控基因表達(dá)的作用［3］。miRNA依賴于其靶基因，通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡、分化和代謝，既可以作為癌基因，也可以作為抑癌基因。miR-122在胃癌、卵巢癌等腫瘤中發(fā)揮抑癌作用，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等［4-5］；而在腎癌、三陰性乳腺癌等多種腫瘤中發(fā)揮致癌作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等［6-7］；但是miR-122-5p對(duì)食管癌細(xì)胞的作用尚不清楚。已有研究［8］表明，cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白1（cAMP response element-binding protein 1，CREB1）在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中過(guò)表達(dá)，與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移階段呈正相關(guān)。本文主要研究miR-122-5p通過(guò)靶向CREB1對(duì)食管癌細(xì)胞及移植瘤的生長(zhǎng)的作用及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自上?；鄯f生物科技有限公司（貨號(hào)：C21700500BT），miR-NC、pc-NC、miR122-5p mimic、pc-CREB1質(zhì)粒和實(shí)驗(yàn)所用各種引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)并合成，MTT試劑盒購(gòu)自上海歌凡生物科技有限公司（貨號(hào)：GM01-500T），胎牛血清、青霉素和鏈霉素雙抗溶液購(gòu)自上海素爾生物科技有限公司（貨號(hào)：16000-044、15140122），miRNeasy試劑盒購(gòu)自南京新科元生物技術(shù)有限公司（貨號(hào)：217004），SYBR-Green聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司（貨號(hào)：4309155），cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司（貨號(hào)：GK8030-20），BCA試劑盒購(gòu)自上海易色醫(yī)療科技有限公司（貨號(hào)：BC201），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗、Ki-67、增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、活化胱天蛋白酶-3、Bax、Bcl-2、CREB1兔來(lái)源的單克隆抗體購(gòu)自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司（貨號(hào)：ab36151、ab92742、ab18197、ab2302、ab32503、ab182858、ab32515），LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自上海恪敏生物科技有限公司（貨號(hào)：11668-027）。裸鼠購(gòu)自四川夏派森醫(yī)藥科技有限公司［許可證：SYXK（川）2017-203］。Nano-Drop分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司，F(xiàn)luorChem HD2凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)ProteinSimple公司。

1.1.2 細(xì)胞及培養(yǎng)

人正常食管細(xì)胞HEEC和食管癌細(xì)胞系（EC18、EC109、EC9706、Kyse520、Kyse140、HKESC1）均購(gòu)自上海素爾生物科技有限公司，所有細(xì)胞在含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清、100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于溫度為37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)。

1.1.3 組織樣品

選取2017年11月—2019年11月于福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院行腫瘤瘤切除術(shù)后保存在液氮中的食管癌及相應(yīng)癌旁正常組織（距癌邊緣3～5 cm）標(biāo)本43例。其中男性28例，女性15例，年齡35～71歲；按照美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)TNM分期，Ⅰ期3例，Ⅱ期25例，Ⅲ期11例，Ⅳ期4例。所有患者術(shù)前均未接受化療和放療，且經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查證實(shí)為原發(fā)性食管癌。該研究得到福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并根據(jù)《赫爾辛基宣言》的道德準(zhǔn)則進(jìn)行，且該實(shí)驗(yàn)獲得患者的同意并簽訂知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RTFQ-PCR）檢測(cè)miR-122-5p和CREB1 mRNA的表達(dá)［9］

使用miRNeasy試劑盒從食管癌組織和細(xì)胞系中提取總RNA，并用Nano-Drop分光光度計(jì)測(cè)量RNA質(zhì)量和濃度。用PrimeScript RT Master Mix Kit將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并按SYBR-Green PCR試劑盒說(shuō)明擴(kuò)增并檢測(cè)mRNA。miR-122-5p的循環(huán)條件：94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)，用U6標(biāo)準(zhǔn)化。CREB1的循環(huán)條件為：95 ℃15 s，60 ℃ 60 s，共40個(gè)循環(huán)，用U6標(biāo)準(zhǔn)化。每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)分析。使用2-ΔΔCt方法計(jì)算。miR-122-5p的上游引物序列：5’-CCGCTCGAG TTCGTGGCTACAGAGTTT-3’，下游引物序列：5’-CCGGAATTCTTTATCGAGGGAAGGAT T-3’；CREB1的上游引物序列：5’-CGCGGAT CCAAATGGACTGGCTTGG-3’，下游引物序列：5’-CGGAATTCTGCCCTATGGAAGAGC TG-3’；U6的上游引物序列：5’-GCTTCGGCA GCACATATACTAAAAT-3’，下游引物序列：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。

1.2.2 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染

將細(xì)胞分為對(duì)照組、miR-NC組、pc-NC組、miR-122-5p mimic組、pc-CREB1組、miR-122-5p mimic+pc-CREB1組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于6孔板（1×106個(gè)/孔）上。當(dāng)達(dá)到80%融合時(shí)，根據(jù)LipofectamineTM2000說(shuō)明書(shū)將100 nmol/L的miR-NC、pc-NC、miR-122-5p mimic、pc-CREB1質(zhì)粒分別或聯(lián)合轉(zhuǎn)染進(jìn)入EC109細(xì)胞中。

1.2.3 雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)分析靶向關(guān)系［5］

將EC109細(xì)胞接種在24孔板上，并溫育24 h。將1 μg螢火蟲(chóng)螢光素酶報(bào)告基因構(gòu)建體PGL3-CREB1-WT（CREB1野生型）或PGL3-CREB1-MUT（CREB1突變型）以及miR-122-5p mimic或mimic-NC和PRL-CMV海腎螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，EC109細(xì)胞裂解15 min，采用雙螢光素酶檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)量螢光素酶的相對(duì)活性，用螢火蟲(chóng)螢光素酶活性和海腎螢光素酶活性比值表示螢光素酶的相對(duì)活性。

1.2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況［9］

取1.2.2處理的細(xì)胞，將每組2 000個(gè)細(xì)胞接種在含有150 μL培養(yǎng)基的96孔板上。在不同的培養(yǎng)時(shí)間（24、48、72 h）后，向每個(gè)孔中添加20 μL MTT底物（5 mg/mL），并將板再溫育4 h。然后除去培養(yǎng)基，并將細(xì)胞溶解在150 μL的二甲基亞砜中。然后將培養(yǎng)板搖動(dòng)15 min，并在490 nm處讀取吸光度（D）值。

1.2.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)能力［5］

將細(xì)胞接種于6孔板（1×106個(gè)/孔）上，直到生長(zhǎng)至可見(jiàn)菌落。用甲醇溶液固定菌落，0.25%結(jié)晶紫染色30 min，計(jì)算菌落數(shù)量。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率［9］

取1.2.2處理的細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，離心收集細(xì)胞，并按1×106個(gè)/mL的濃度重懸。細(xì)胞懸液中加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC和碘化丙啶（propidium iodide，PI），避光溫育15 min，然后用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)Ki-67、PCNA、活化胱天蛋白酶-3、Bax、Bcl-2、CREB1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平［9］

取1.2.2處理的細(xì)胞，用RIPA裂解液提取總蛋白，并用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，然后經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白后，用半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，并用脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，再加入兔來(lái)源的單克隆一抗［Ki-67 1∶1 000、PCNA 1∶1 000、胱天蛋白酶-3 1∶500、Bax 1∶1 000、Bcl-2 1∶1 000、CREB1 1∶1 000、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）1∶1 000］4 ℃封閉過(guò)夜，接著加入對(duì)應(yīng)山羊抗兔二抗（1∶2 000）室溫封閉1 h，最后滴電化學(xué)反應(yīng)液曝光，以GAPDH為內(nèi)參，使用Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH積分光密度（integrated-optical density，IOD）比值表示蛋白的表達(dá)水平。

1.2.8 裸小鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)［10］

所有BALB/c裸小鼠分為4組：control組、miR-122-5p mimic組、pc-CREB1組、miR-122-5p mimic+pc-CREB1組。在裸小鼠左腋下皮下注射各轉(zhuǎn)染過(guò)的EC109細(xì)胞（每只裸小鼠在100 mL PBS中注射5×106個(gè)細(xì)胞），繼續(xù)在無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）條件下正常飲食飼養(yǎng)。第30天頸椎脫位法處死裸小鼠，完整取出皮下腫瘤，測(cè)定移植瘤體積和質(zhì)量，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Ki-67標(biāo)記指數(shù)和胱天蛋白酶-3的表達(dá)水平。

1.2.9 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Ki-67標(biāo)記指數(shù)和胱天蛋白酶-3的表達(dá)水平［11］

移植瘤經(jīng)常規(guī)石蠟包埋切片，脫蠟水化，過(guò)氧化物酶阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，非免疫性動(dòng)物血清阻斷非特異性反應(yīng)，分別加入兔來(lái)源Ki-67和活化胱天蛋白酶-3單克隆抗體，4 ℃過(guò)夜，滴加生物素標(biāo)記二抗，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蒸餾水沖洗，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片觀察統(tǒng)計(jì)。Ki-67陽(yáng)性染色多數(shù)位于細(xì)胞核中，胱天蛋白酶-3陽(yáng)性染色多數(shù)位于細(xì)胞質(zhì)中。每組選取5張片子，每張片子在×200光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野，使用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件分析Ki-67標(biāo)記指數(shù)和胱天蛋白酶-3在樣本中的IOD值，用IOD值反映免疫反應(yīng)物的表達(dá)強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0處理，圖形使用GraphPad Prism 6.0軟件構(gòu)建。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，數(shù)據(jù)經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)均呈正態(tài)分布，多組比較進(jìn)行One-Way ANOVA分析，兩組比較使用SNK檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-122-5p和CREB1在食管癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)情況

與正常組織相比，食管癌組織miR-122-5p表達(dá)顯著下調(diào)（0.36±0.09vs1.00±0.04，P＜0.0 1），CREB1mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（3.62±0.08vs1.01±0.05，P＜0.01，圖1A）；食管癌組織中miR-122-5p與CREB1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=0.897 7，圖1B）。人正常食管細(xì)胞HEEC及食管癌細(xì)胞系EC18、EC109、EC9706、Kyse520、Kyse140、HKESC1中miR-122-5p表達(dá)分別是1.00±0.05、0.34±0.08、0.3 1±0.0 9、0.3 6±0.0 7、0.3 9±0.0 8、0.41±0.07、0.43±0.08，CREB1 mRNA表達(dá)分別是1.00±0.04、4.32±0.09、4.53±0.07、4.1 6±0.0 8、3.7 2±0.0 9、3.4 3±0.0 9、3.17±0.07。與人正常食管細(xì)胞HEEC相比，食管癌細(xì)胞系EC18、EC109、EC9706、Kyse520、Kyse140、HKESC1中miR-122-5p表達(dá)顯著下調(diào)，CREB1 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01，圖1C）；選取EC109細(xì)胞做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 miR-122-5p和CREB1在食管癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)情況Fig.1 miR-122-5p and CREB1 expressions in esophageal cancer tissues and cells

2.2 miR-122-5p和CREB1靶向關(guān)系

通過(guò)TargetScan軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-122-5p與CREB1的3’UTR區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)（圖2A）；通過(guò)雙螢光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-122-5p mimic與PGL3-CREB1-WT共轉(zhuǎn)染致螢光素酶活性顯著降低（0.42±0.06vs1.00±0.05，P＜0.01，圖2B）。與對(duì)照組相比，miR-NC組miR-122-5p水平無(wú)明顯變化（1.01±0.21vs1.00±0.20，P＜0.01），miR-122-5p mimic組miR-122-5p水平顯著上調(diào)（5.21±0.31vs1.00±0.20，P＜0.01，圖2C），說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功。與對(duì)照組相比，miR-NC和pc-NC組CREB1蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化（0.83±0.07vs0.82±0.08，0.81±0.09vs0.82±0.08），miR-122-5p mimic組CREB1蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（0.43±0.06vs0.82±0.08，P＜0.01），pc-CREB1組CREB1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（1.42±0.09vs0.82±0.08，P＜0.01，圖2D）；與miR-122-5p mimic組相比，miR-122-5p mimic+pc-CREB1組CREB1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（0.83±0.07vs0.43±0.06，P＜0.01，圖2D）；說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功，且miR-122-5p靶向下調(diào)CREB1的表達(dá)。

2.3 miR-122-5p靶向CREB1對(duì)食管癌EC109細(xì)胞增殖的影響

對(duì)照組、miR-NC組、pc-NC組、miR-122-5p mimic組、pc-CREB1組、miR-122-5p mimic+pc-CREB1組24 hD值分別是0.49±0.04、0.48±0.03、0.50±0.03、0.40±0.03、0.66±0.03、0.52±0.03，48 hD值分別是0.82±0.03、0.81±0.04、0.84±0.04、0.65±0.04、1.32±0.05、0.90±0.04，72 hD值分別是1.31±0.04、1.30±0.03、1.35±0.03、0.91±0.03、2.12±0.04、1.51±0.04，克隆細(xì)胞數(shù)目分別是86.52±5.42、87.34±5.31、85.26±5.29、36.98±3.27、127.55±6.05、86.29±5.34，PCNA蛋白表達(dá)水平分別是0.42±0.03、0.43±0.04、0.41±0.03、0.19±0.04、0.72±0.04、0.43±0.04，Ki-67標(biāo)記指數(shù)分別是0.53±0.04、0.54±0.03、0.52±0.04、0.23±0.03、0.81±0.04、0.55±0.05。與對(duì)照組相比，miR-NC和pc-NC組食管癌EC109細(xì)胞D值、克隆細(xì)胞數(shù)目、PCNA和Ki-67標(biāo)記指數(shù)均無(wú)明顯影響，miR-122-5p mimic組食管癌EC109細(xì)胞D值和克隆細(xì)胞數(shù)目顯著減少，PCNA和Ki-67標(biāo)記指數(shù)顯著降低（P＜0.01，圖3），pc-CREB1組食管癌EC109細(xì)胞D值和克隆細(xì)胞數(shù)目顯著增加，PCNA和Ki-67標(biāo)記指數(shù)顯著升高（P＜0.01，圖3）；與miR-122-5p mimic組相比，miR-122-5p mimic+pc-CREB1組食管癌EC109細(xì)胞D值和克隆細(xì)胞數(shù)目顯著增加，PCNA和Ki-67標(biāo)記指數(shù)顯著升高（P＜0.01，圖3）。

2.4 miR-122-5p靶向CREB1對(duì)食管癌EC109細(xì)胞凋亡的影響

對(duì)照組、miR-NC組、pc-NC組、miR-122-5p mimic組、pc-CREB1組、miR-122-5p mimic+pc-CREB1組細(xì)胞凋亡率分別是（4.92±0.52）%、（4.8 6±0.5 3）%、（4.9 8±0.5 5）%、（3 2.1 5±0.6 1）%、（1.1 6±0.3 2）%、（5.02±0.53）%，活化胱天蛋白酶-3表達(dá)水平分別是0.18±0.03、0.18±0.02、0.17±0.02、0.53±0.04、0.07±0.03、0.17±0.03，Bax表達(dá)水平分別是0.15±0.04、0.16±0.03、0.15±0.02、0.63±0.04、0.06±0.03、0.12±0.03，Bcl-2表達(dá)水平分別是0.55±0.04、0.56±0.03、0.54±0.03、0.21±0.03、0.72±0.04、0.55±0.04。與對(duì)照組相比，miR-NC和pc-NC組食管癌EC109細(xì)胞凋亡率和活化胱天蛋白酶-3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)均無(wú)明顯影響，miR-122-5p mimic組食管癌EC109細(xì)胞凋亡率顯著升高，活化胱天蛋白酶-3、Bax蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01，圖4），pc-CREB1組食管癌EC109細(xì)胞凋亡率顯著降低，活化胱天蛋白酶-3、Bax蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01，圖4）；與miR-122-5p mimic組相比，miR-122-5p mimic+pc-CREB1組食管癌EC109細(xì)胞凋亡率顯著降低，活化胱天蛋白酶-3、Bax蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01，圖4）。

圖2 miR-122-5p和CREB1靶向關(guān)系Fig.2 miR-122-5p and CREB1 targeting relationship

圖3 miR-122-5p靶向CREB1對(duì)食管癌EC109細(xì)胞增殖的影響Fig.3 The effect of miR-122-5p on the proliferation of esophageal cancer EC109 cells by targeting CREB1

圖4 miR-122-5p靶向CREB1對(duì)食管癌EC109細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 The effect of miR-122-5p on apoptosis of esophageal cancer EC109 cells by targeting CREB1

2.5 miR-122-5p靶向CREB1對(duì)食管癌EC109移植瘤生長(zhǎng)的影響

對(duì)照組、miR-122-5p mimic組、pc-CREB1組、miR-122-5p mimic+pc-CREB1組食管癌EC109移植瘤體積分別是（833.46±22.95）、（397.52±20.56）、（1286.43±26.42）、（856.99±22.75）mm3，移植瘤質(zhì)量分別是（0.83±0.05）、（0.39±0.04）、（1.21±0.05）、（0.85±0.04）g，Ki-67的IOD值分別是162.49±23.55、89.53±22.73、281.46±27.18、172.44±25.64，活化胱天蛋白酶-3的IOD值分別是97.33±25.37、186.92±28.12、48.73±24.55、104.52±26.16。與對(duì)照組相比，miR-122-5p mimic組食管癌EC109移植瘤體積顯著減小，質(zhì)量顯著減輕，Ki-67標(biāo)記指數(shù)顯著升高，胱天蛋白酶-3表達(dá)顯著減少（P＜0.01，圖5），pc-CREB1組食管癌EC109移植瘤體積顯著增大，質(zhì)量顯著增加，Ki-67標(biāo)記指數(shù)顯著降低，活化胱天蛋白酶-3表達(dá)顯著增加（P＜0.01，圖5）；與miR-122-5p mimic組相比，miR-122-5p mimic+pc-CREB1組食管癌EC109移植瘤體積顯著增大，質(zhì)量顯著增加，Ki-67標(biāo)記指數(shù)顯著降低，胱天蛋白酶-3表達(dá)顯著增加（P＜0.01，圖5）。

圖5 miR-122-5p靶向CREB1對(duì)食管癌EC109移植瘤生長(zhǎng)的影響Fig.5 The effect of miR-122-5p on the growth of esophageal cancer EC109 xenografts by targeting CREB1

3 討 論

越來(lái)越多的證據(jù)顯示，miRNA在腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用。miRNA充當(dāng)基因表達(dá)的主要調(diào)節(jié)劑，在食管癌中存在大量miRNA的異常表達(dá)，如miR-574-3p在食管癌中低表達(dá)，作為抑癌基因［12］；miR-424在食管癌中高表達(dá)，作為致癌基因［13］。已有研究［14］表明，miR-122-5p既可以作為致癌基因，如miR-122通過(guò)體外靶向ALDOA促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)展，又可以作為抑癌基因，如miR-122-5p通過(guò)靶向ALDOA抑制膽管癌細(xì)胞的增殖、侵襲和生長(zhǎng)［15］。同已有研究［16］結(jié)論相一致，本研究表明，miR-122-5p在食管癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-122-5p減少食管癌細(xì)胞克隆數(shù)目，下調(diào)PCNA和Ki-67標(biāo)記指數(shù)，增加細(xì)胞凋亡率，上調(diào)活化胱天蛋白酶-3和Bax蛋白表達(dá)，下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)。腫瘤的一大特征就是細(xì)胞的無(wú)限生長(zhǎng)。在正常情況下，細(xì)胞的增殖和凋亡處于一種動(dòng)態(tài)平衡，但是在腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞可無(wú)限增殖，而細(xì)胞凋亡被抑制［17］。PCNA和Ki-67標(biāo)記指數(shù)反映細(xì)胞增殖能力［18］。Caspase家族和Bcl-2家族在細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尤其是線粒體途徑中發(fā)揮極為重要的調(diào)控作用，其中活化胱天蛋白酶-3、Bax和Bcl-2是常見(jiàn)的細(xì)胞凋亡標(biāo)志蛋白，反映細(xì)胞的凋亡能力［19］。這說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-122-5p抑制食管癌細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

本研究結(jié)果顯示，miR-122-5p對(duì)食管癌細(xì)胞的作用是通過(guò)靶向下調(diào)CREB1表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。CREB1基因位于人類染色體2q32.3-q34處，屬于堿性/亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子家族［20］。CREB1基因編碼多效性轉(zhuǎn)錄因子，在癌癥中經(jīng)常失調(diào)，可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖或遷移狀態(tài)［21］。CREB1在胃癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等多種癌癥中表達(dá)上調(diào)，作為癌基因，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，并抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展［22］。已有研究［8］表明，CREB1在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中高表達(dá)，同本研究結(jié)果相一致。本研究結(jié)果顯示，CREB1過(guò)表達(dá)增加食管癌細(xì)胞克隆數(shù)目，上調(diào)PCNA和Ki-67標(biāo)記指數(shù)，減少細(xì)胞凋亡率，下調(diào)活化胱天蛋白酶-3和Bax蛋白表達(dá)，上調(diào)調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，提示CREB1過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞增殖，并抑制細(xì)胞凋亡。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)，同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-122-5p和CREB1可逆轉(zhuǎn)miR-122-5p過(guò)表達(dá)對(duì)食管癌細(xì)胞增殖的抑制作用及凋亡的誘導(dǎo)作用，提示miR-122-5p過(guò)表達(dá)對(duì)食管癌細(xì)胞增殖的抑制作用及凋亡的誘導(dǎo)作用是通過(guò)下調(diào)CREB1表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。與miR-506通過(guò)靶向CREB1抑制食管癌細(xì)胞增殖的研究［23］結(jié)果相似，本研究證明，miR-122-5p通過(guò)靶向CREB1抑制食管癌細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。同體外研究結(jié)果相一致，體內(nèi)移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-122-5p靶向CREB1減小食管癌EC109移植瘤體積和質(zhì)量，增加Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞比率，減少胱天蛋白酶-3陽(yáng)性細(xì)胞比率，證明miR-122-5p通過(guò)靶向CREB1抑制食管癌移植瘤的生長(zhǎng)。

綜上所述，miR-122-5p通過(guò)靶向下調(diào)CREB1來(lái)抑制食管癌細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制食管癌細(xì)胞和移植瘤的生長(zhǎng)，提示miR-122-5p和CREB1可成為治療和預(yù)防食管癌的潛在靶點(diǎn)。