張麗鳳余雙全梁祚仁莫頌軼黃彥峰黎 昀廖素嬋龐艷芳黃俊杰

(右江民族醫(yī)學(xué)院,廣西百色 533000)

酒精濫用所致疾病已成為當(dāng)今社會(huì)的公共衛(wèi)生問題。酒精是一種親脂性的小分子,其可以通過血腦屏障到達(dá)腦組織,并與細(xì)胞膜的受體結(jié)合從而改變神經(jīng)細(xì)胞功能,進(jìn)而影響記憶和認(rèn)知功能。盡管酒精中毒所致認(rèn)知障礙及腦損傷等方面的研究取得了一定的進(jìn)展,但迄今為止酒精中毒所致認(rèn)知障礙的確切發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。海馬神經(jīng)元突觸可塑性被認(rèn)為是學(xué)習(xí)和記憶的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ),當(dāng)受外界環(huán)境影響時(shí),神經(jīng)系統(tǒng)可塑性也發(fā)生變化,突觸可塑性分為形態(tài)結(jié)構(gòu)可塑性和功能可塑性。研究表明五味子乙素(schisandrin B,Sch B)具備了抗氧化,保護(hù)腦組織,改善學(xué)習(xí)記憶的能力,但Sch B 對(duì)慢性酒精中毒大鼠學(xué)習(xí)記憶影響的領(lǐng)域未見相關(guān)的研究報(bào)道。本研究旨通過建立慢性酒精中毒大鼠模型,用Sch B 干預(yù)治療,探討Sch B 對(duì)慢性酒精中毒致大鼠海馬突觸超微結(jié)構(gòu)損傷的改善作用,并闡明其相關(guān)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

從湖南省長沙天勤生物技術(shù)有限公司[SCXK(湘)2019-0014]購買25 只成年清潔級(jí)Wistar 大鼠,雄性,6 周齡,體重180～200 g。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在右江民族醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行[SYXK(桂)2017-0004],本研究遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R 原則,經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批同意批準(zhǔn)后(IACUC2020010501)實(shí)施,并嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物安全制度及相關(guān)規(guī)章執(zhí)行。

1.2 主要試劑與儀器

五味子乙素購買于維克奇生物科技公司(批號(hào):wkq19101401);電鏡固定液購買于Servicebio 公司(貨號(hào):G1102);812 包埋劑SPI 公司(貨號(hào):90529-77-4);透射電子顯微鏡(日本HITACHI 公司);Morris 水迷宮(北京新天地科技有限公司);超薄切片機(jī)(德國Leica 公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 慢性酒精中毒模型建立和動(dòng)物分組

以白酒(56°北京紅星二鍋頭)連續(xù)灌胃大鼠8周,建立慢性酒精中毒動(dòng)物模型[1],以8 mL/(kg·d)作為起始劑量灌胃,后每周增加1mL,至第3 周增加到10 mL/(kg·d)的劑量,第4 周增至12 mL/(kg·d)的灌胃劑量并一直按此劑量連續(xù)灌胃到第8 周。然后對(duì)模型組進(jìn)行酒精戒斷24 h 后評(píng)分,判斷慢性酒精中毒模型建立是否成功[2]。將慢性酒精中毒模型建立成功的大鼠隨機(jī)分為分成4 個(gè)組,即模型組(n=5 只)、Sch B 低劑量組(n=5 只)、Sch B 中劑量組(n=5 只)、Sch B 高劑量組(n=5 只),Sch B 各劑量組用Sch B 灌胃,每天1 次,各組的Sch B 劑量分別為10、20、40 mg/kg 體重,連續(xù)30 d。另選取5 只每天灌胃蒸餾水,作為空白對(duì)照組。大鼠在室溫(25±1)℃、濕度50%～60%環(huán)境下分籠飼養(yǎng),自由飲水。

1.3.2 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物模型建立成功后,用Morris 水迷宮檢測酒精中毒模型大鼠學(xué)習(xí)與記憶能力(包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)),先對(duì)大鼠進(jìn)行定位航行獲得性訓(xùn)練,每天定位訓(xùn)練4 次,即在4 個(gè)不同的象限都各訓(xùn)練一次。定位航行實(shí)驗(yàn)完成后再進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn),將水下平臺(tái)撤除,任意選取1 個(gè)入水點(diǎn),所有動(dòng)物均為同一入水點(diǎn),將動(dòng)物面向池壁輕輕放入水中,動(dòng)物落水后游泳時(shí)間以60 s 為限,記錄動(dòng)物在此時(shí)間內(nèi)首次跨越平臺(tái)所用時(shí)即潛伏期以及跨越平臺(tái)次數(shù)等指標(biāo)。

1.3.3 動(dòng)物樣本取材

大鼠進(jìn)行Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)后,用20%氨基甲酸乙酯按5mL/kg 劑量進(jìn)行腹腔注射,麻醉成功后,立即斷頭取腦,定位取海馬CA1 區(qū),將分離的組織塊投放到電鏡固定液中,在4℃條件下固定4 h。

1.3.4 透射電子顯微鏡觀察海馬CA1 區(qū)突觸超微結(jié)構(gòu)

固定的海馬組織,經(jīng)脫水、滲透、切片、鈾鉛雙染色后,應(yīng)用透射電子顯微鏡觀察各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的改變,同時(shí)電腦采集圖像,觀察海馬神經(jīng)元突觸數(shù)目及測定海馬突觸結(jié)構(gòu)的形態(tài)參數(shù)(突觸后膜致密物質(zhì)厚度、突觸間隙寬度)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Morris 水迷宮檢測各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力

Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,酒精中毒模型組空間探索實(shí)驗(yàn)潛伏期比空白對(duì)照組的空間探索實(shí)驗(yàn)潛伏明顯變長,而平臺(tái)穿越次數(shù)減少(P<0.05);與酒精中毒模型組比,Sch B 低劑量組、Sch B 中劑量組、Sch B 高劑量組空間探索實(shí)驗(yàn)潛伏期均縮短,而平臺(tái)穿越次數(shù)增多,以Sch B 高劑量組變化明顯(P<0.05)(見表1)。

2.2 透射電鏡觀察各組大鼠海馬CA1 區(qū)突觸的超微結(jié)構(gòu)改變

與空白對(duì)照組比較,神經(jīng)元細(xì)胞呈重度水腫,大面積細(xì)胞膜破損,細(xì)胞器游離;細(xì)胞核呈不規(guī)則形固縮,局部凹陷,異染色質(zhì)邊集,核周隙明顯增寬;線粒體呈明顯腫脹,大多線粒體膜內(nèi)基質(zhì)變淡,嵴斷裂、消失;粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴(kuò)張,脫顆粒,空泡變。與酒精中毒模型組比較,五味子乙素低、中、高劑量組細(xì)胞水腫逐漸減輕,細(xì)胞膜局部小面積破損;隨著五味子乙素劑量增加,細(xì)胞損傷程度降低,細(xì)胞質(zhì)豐富,細(xì)胞膜漸完整;細(xì)胞核呈不規(guī)則形,染色質(zhì)均勻,核膜清晰、完整;線粒體呈輕度腫脹,大多數(shù)線粒體嵴存在,膜完整,少量線粒體膜內(nèi)基質(zhì)變淡;粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕微擴(kuò)張(見圖1)。

2.3 透射電鏡測定各組大鼠海馬CA1 區(qū)突觸數(shù)及突觸結(jié)構(gòu)形態(tài)參數(shù)

通過透射電鏡對(duì)海馬CA1 區(qū)突觸數(shù)量、突觸間隙寬度、突觸后致密物質(zhì)厚度進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,酒精中毒模型組突觸數(shù)量減少,突觸間隙變寬,突觸后膜致密物質(zhì)不均變薄,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與酒精中毒模型組相比,Sch B 低、中、高劑量組突觸數(shù)量增加,突觸間隙清晰縮短,突觸后致密物質(zhì)增厚,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表2)。

表1 Morris 水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)潛伏期和平臺(tái)穿越次數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(,n=5)Table 1 Experimental results of Morris water maze space exploration experiment incubation period and platform crossing times

表1 Morris 水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)潛伏期和平臺(tái)穿越次數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(,n=5)Table 1 Experimental results of Morris water maze space exploration experiment incubation period and platform crossing times

注:與空白對(duì)照組比較,?P<0.05;與酒精中毒模型組比較,#P<0.05。Note.Compared with the blank control group,?P<0.05.Compared with the alcoholism group,#P<0.05.

3 討論

酒精濫用所致疾病已成為當(dāng)今社會(huì)的公共衛(wèi)生問題。酒精是一種親脂性的小分子,其可以通過血腦屏障到達(dá)腦組織,并與神經(jīng)細(xì)胞膜的受體結(jié)合從而改變神經(jīng)細(xì)胞功能,進(jìn)而影響記憶和認(rèn)知功能[3-4],長期飲酒過度可誘發(fā)慢性酒精中毒并導(dǎo)致認(rèn)知障礙及腦損傷。本研究結(jié)果顯示,慢性酒精中毒大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)潛伏期比正常大鼠的空間探索實(shí)驗(yàn)潛伏期明顯變長,規(guī)定時(shí)間內(nèi)跨越平臺(tái)次數(shù)減少,說明酒精中毒大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降,與報(bào)道的研究結(jié)果一致[5-6]。酒精中毒所致認(rèn)知障礙及腦損傷等方面已經(jīng)得到公認(rèn),且其研究也取得了一定的進(jìn)展,但迄今為止酒精中毒所致認(rèn)知障礙的確切發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。

突觸是神經(jīng)元之間信息傳遞和加工的部位,而突觸可塑性是學(xué)習(xí)和記憶的生理學(xué)基礎(chǔ)[7]。海馬神經(jīng)元突觸可塑性則是學(xué)習(xí)和與記憶的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ),突觸可塑性分為形態(tài)結(jié)構(gòu)可塑性和功能可塑性,突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)可塑性是指突觸結(jié)構(gòu)形態(tài)、突觸密度的改變以及新突觸形成[8-10],其與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)[11],體內(nèi)外各種因素的改變可使突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)可塑性隨之發(fā)生改變。本研究結(jié)果顯示,慢性酒精中毒大鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞水腫,細(xì)胞核腫脹,細(xì)胞器減少,線粒體明顯腫脹;突觸小體腫脹嚴(yán)重,間隙變寬,突觸后膜致密物質(zhì)不均,突觸數(shù)量明顯減少。因突觸間隙內(nèi)含有大量的降解酶,能夠分解神經(jīng)遞質(zhì),因此在神經(jīng)遞質(zhì)傳遞過程中若突觸間隙越寬,神經(jīng)遞質(zhì)從突觸前膜釋放跨越間隙與后膜受體結(jié)合所需的時(shí)間越長,在間隙中傳導(dǎo)被降解的量越多,影響信息傳遞,突觸后致密物質(zhì)變薄反應(yīng)了附著在后膜上的致密物質(zhì)蛋白減少,而在神經(jīng)遞質(zhì)傳遞過程中需要蛋白的參與,蛋白的減少可能使神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞速度減慢,消耗更多[12-13]。說明慢性酒精中毒可引起神經(jīng)元損害、突觸可塑性降低造成學(xué)習(xí)記憶障礙發(fā)生。

圖1 透射電鏡觀察各組大鼠海馬CA1 區(qū)突觸的超微結(jié)構(gòu)Note.A,Blank control group.B,Alcoholism group.C,Low-dose Sch B group.D,Medium-dose Sch B group.E,Highdose Sch B group.Figure 1 The ultrastructure of neurons in hippocampal CA1 area were observed by transmission electron microscope

表2 各組大鼠突觸數(shù)量和突觸結(jié)構(gòu)參數(shù)(,n=5)Table 2 Number of synapses and structural parameters of synapses in each group

表2 各組大鼠突觸數(shù)量和突觸結(jié)構(gòu)參數(shù)(,n=5)Table 2 Number of synapses and structural parameters of synapses in each group

注:與空白對(duì)照組比較,?P<0.05;與酒精中毒模型組比較,#P<0.05。Note.Compared with the blankcontrol group,?P<0.05.Compared with the alcoholism group,#P<0.05.

目前,慢性酒精中毒引起學(xué)習(xí)記憶障礙的發(fā)病率逐年升高,但臨床上尚缺乏治療酒精中毒的特效藥,這就給酒精中毒導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶障礙的防治帶來了一定的困難,因此,尋找有效防治慢性酒精中毒學(xué)習(xí)記憶障礙藥物意義重大。Sch B 是五味子中含量最高的木脂素,近年來Sch B 改善學(xué)習(xí)記憶能力方面的研究有所增多,有研究報(bào)道Sch B 具有抗氧化,保護(hù)腦組織,改善學(xué)習(xí)記憶的能力[14-15];也有研究認(rèn)為Sch B 能調(diào)控神經(jīng)元的同步活動(dòng)從而保護(hù)神經(jīng)元[16-17],但Sch B 對(duì)慢性酒精中毒大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響未見相關(guān)的研究報(bào)道。本研究通過Sch B 干預(yù)后,發(fā)現(xiàn)大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)潛伏期縮短,跨平臺(tái)穿越次數(shù)增多,且高劑量組表現(xiàn)更加明顯,說明在慢性酒精中毒導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶障礙基礎(chǔ)上給予Sch B 治療,其發(fā)揮了較為明顯的改善作用,隨著給藥劑量的增加,改善作用更加明顯。通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)Sch B 干預(yù)治療后神經(jīng)元胞質(zhì)豐富,細(xì)胞器增多,細(xì)胞損傷程度降低;突觸小體水腫程度較低,突觸間隙清晰,寬度變窄,突觸后致密區(qū)增厚,突觸界面較長,突觸數(shù)量增加。

綜上所述,Sch B 可通過改變大鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元突觸超微結(jié)構(gòu),促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞突觸可塑性,從而提高慢性酒精中毒大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。但其具體的分子機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。