高秀麗 段文博 王 婧 王 濤 任 珊

(1.齊齊哈爾醫(yī)學院醫(yī)藥科學研究院,黑龍江齊齊哈爾 161006;2.齊齊哈爾醫(yī)學院醫(yī)學技術學院,黑龍江齊齊哈爾 161006)

組蛋白H2A.X(histone H2A.X,H2A.X)是組蛋白H2A 的一個變體,在DNA 損傷應答過程中發(fā)揮關鍵作用。在DNA 損傷誘導的腫瘤形成過程中,H2A.X 發(fā)生139 位絲氨酸的磷酸化,同時招募一些DNA 損傷修復蛋白及一些信號蛋白,在DNA 損傷位點附近形成復合物,進而啟動細胞對DNA 損傷的應答、修復等過程[1]。核仁磷蛋白(nucleophosmin,NPM1)是一種組蛋白伴侶蛋白,其可同組蛋白相互結合,負責調(diào)解不同的細胞功能,例如組蛋白轉(zhuǎn)運、基因組穩(wěn)定及轉(zhuǎn)錄調(diào)控等[2]。研究表明,在放射線誘導的條件下,H2A.X 會在DNA 損傷及修復的不同的時期形成動態(tài)復合物,而NPM1 是整個過程的常駐成員[3]。DNA 損傷的積累是癌癥發(fā)生的主要原因,而誘導癌細胞發(fā)生DNA 損傷又是癌癥放化療的主要手段[4],因此研究DNA 損傷對癌癥的病因和治療靶點的篩選具有重要意義,而H2A.X 與NPM1的相互結合有望成為連接DNA 損傷與癌癥之間的關鍵橋梁。哺乳動物雙雜交能夠有效地檢測蛋白質(zhì)之間在體內(nèi)條件下的相互作用,彌補了體外研究蛋白質(zhì)相互作用的不足。本研究分別構建了H2A.X 及NPM1 哺乳動物雙雜交表達載體,并實現(xiàn)了其在人乳腺癌MCF-7 細胞中的表達,以期為深入研究乳腺癌中H2A.X 同NPM1 的結合及其功能提供實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗細胞

MCF-7 細胞購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 主要試劑與儀器

MEM 培養(yǎng)液(HyClone,SH30024.01B,美國);Opti-MEM 培養(yǎng)液(Gibgo,31985070,美國);胎牛血清(Clark,FB25015,美國);Lip3000 轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen,美國);限制性內(nèi)切酶(TaKaRa,日本);TRIzol(Invitrogen,15596-026,美國);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(全式金,AE301-02,中國);Ex Taq HS 聚合酶(TaKaRa,RR006,日本);凝膠回收試劑盒(全式金,EG101 -01,中國);T5 Zero 載體(全式金,CT501,中國);質(zhì)粒小量提取試劑盒(康為,CW2016,中國);T4 DNA 連接酶(全式金,FL101-01,中國)。

PCR 儀(Bio-Rad,C1000 Touch,美國);臺式冷凍離心機(Eppendorf,5804R,德國);紫外可見分光光度計(島津,Biospec-nano,日本);凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad,ChemiDoc1708280,美國);正置顯微鏡(尼康,E100 Eclipse,日本);二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo,3111,美國);暗箱式紫外分析儀(上海馳唐,WFH-203B)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞及培養(yǎng)方法

MCF-7 細胞培養(yǎng)于MEM 培養(yǎng)液,添加10%胎牛血清,0.11 g/L 丙酮酸鈉及0.01 mg/mL 牛胰島素,培養(yǎng)于37℃含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中。

1.3.2 細胞轉(zhuǎn)染

MCF-7 細胞采用Lip3000 轉(zhuǎn)染試劑進行瞬時轉(zhuǎn)染:將7.5 μL Lip3000 轉(zhuǎn)染試劑和2.5 μg 質(zhì)粒DNA分別加至125 μL Opti-MEM 培養(yǎng)液中,之后將含DNA 的Opti-MEM 培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至含轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)液中,混勻并靜止20 min 后滴加至細胞中。轉(zhuǎn)染約36 h 后利用RT-PCR 方法檢測基因轉(zhuǎn)染效率。

1.3.3 H2A.X 及NPM1 表達載體的構建

根據(jù)人源H2A.X(GeneBank accession:NM_002105.3) 及 NPM1 (GeneBank accession:NM _002520.6)基因序列在編碼區(qū)上游和下游設計并合成擴增引物:H2A.X(上游5’-GCTCTAGAGCTA GCATGTCGGGCCGCGGCAAG-3’,下游 5’-GGGG TACCTTAGTACTCCTGGGAGGCCTGGGT-3’);NPM1(上游5’-GCTCTAGACACCCGATGGAAGATTCGAT GGA-3’,下游5’-GGGGTACCTTAAAGAGACTTCC TCCACTGCCAG-3’),并在引物兩端引入限制性酶切位點(上游:XbalⅠ,下游:KpnⅠ)。常規(guī)TRIzol法提取MCF-7 細胞總RNA 并將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以獲得的cDNA 為模板,由Ex Taq HS 聚合酶擴增H2A.X 及NPM1 mRNA 全長序列,擴增條件:94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 min,以上過程重復30 循環(huán),最后執(zhí)行72℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后由凝膠回收試劑盒按說明書純化回收并與T5 Zero 載體在37℃條件下連接2 h,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a 感受態(tài)細胞,轉(zhuǎn)化產(chǎn)物經(jīng)37℃孵育16 h 后挑取平板上生長飽滿的單克隆菌落培養(yǎng)14 h,提取細菌質(zhì)粒DNA 并進行電泳及雙酶切驗證(酶切體系:XbalⅠ0.5 μL,KpnⅠ0.5 μL,M buffer 2 μL,質(zhì)粒DNA 1 μg,雙蒸水補充至20 μL;酶切條件:37℃,2 h),經(jīng)酶切驗證正確的產(chǎn)物分別由T4 DNA 連接酶連接至線性p-BIND及PACT 表達載體(連接體系:線性目的片段17 μL,線性載體2 μL,T4 DNA 連接酶1 μL,5×DNA 連接酶緩沖液5 μL;連接條件:16℃,14 h),獲得的連接產(chǎn)物通過電泳及雙酶切驗證后送至上海生工生物工程有限公司進行測序驗證。

1.3.4 RT-PCR 檢測H2A.X 及NPM1 mRNA 表達水平

MCF-7 細胞采用常規(guī)TRIzol 法提取RNA 并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以獲得的cDNA 為模板,以H2A.X、NPM1 及GAPDH RT-PCR 引物進行PCR 擴增,擴增條件:94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 min,以上過程重復30 循環(huán)。H2A.X 引物序列:上游5’-TACCTCGCTAGCATGTCGGG-3’,下游5’-TTAGTACTCCTGGGAGGCCTGGGTG-3’;NPM1 引物序列:上游5’-TGTGAACTAAAGGCCGACAAAGATT-3’,下游5’-CACTAATATGCACTGGCCCTGAACC-3’,GAPDH 引物序列:上游5’-GGACCTGACCTG CCGTCTA-3’,下游5’-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3’。將獲得的PCR 產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,并通過Bio-Rad 凝膠成像儀進行凝膠成像。

2 結果

2.1 H2A.X-pBind 表達載體的構建

電泳結果表明,獲得的H2A.X PCR 產(chǎn)物同NCBI 上報道的H2A.X 編碼序列大小相一致(圖1 A),將純化后的PCR 產(chǎn)物進行TA 克隆及酶切驗證后,獲得預期大小的DNA 片段(圖1B、1C)。將驗證正確的酶切產(chǎn)物與p-BIND 線性載體連接并酶切驗證后,同樣獲得預期DNA 片段(圖1D、1E)。選取驗證結果正確的連接產(chǎn)物進行測序,測序結果與NCBI 中H2A.X 編碼序列比對驗證,插入片段匹配率為100%(圖1F)。以上結果說明H2A.X-pBIND表達載體構建成功。

2.2 NPM1-PACT 表達載體的構建

電泳結果表明,獲得的NPM1 PCR 產(chǎn)物同NCBI 上報道的NPM1 編碼序列大小相一致(圖2 A),將純化后的PCR 產(chǎn)物進行TA 克隆及酶切驗證后,獲得預期大小的DNA 片段(圖2B、2C)。將驗證正確的酶切產(chǎn)物與PACT 線性載體連接并酶切驗證后,同樣獲得預期DNA 片段(圖2D、2E)。選取驗證結果正確的連接產(chǎn)物進行測序,測序結果與NCBI 中NPM1 編碼序列比對驗證,插入片段匹配率為100%(圖2F)。以上結果說明NPM1-PACT 表達載體構建成功。

2.3 H2A.X 及NPM1 在MCF-7 細胞中表達效果

將構建好的H2A.X-pBIND 及NPM1-PACT 表達載體及其對照空載體分別轉(zhuǎn)染至MCF-7 細胞中,并利用RT-PCR 方法檢測兩種基因的表達水平。結果表明,同對照組相比,實驗組中H2A.X 及NPM1 mRNA 表達水平均明顯增加(圖3),說明構建的H2A.X 及NPM1 表達載體可成功在MCF-7 細胞中表達。

3 討論

女性乳腺癌因其高發(fā)病率、難治愈性以及發(fā)病群體的年輕化而成為癌癥領域急需攻克的難題之一。眾多研究結果表明,DNA 損傷的積累是乳腺癌發(fā)生的主要原因,而誘導癌細胞發(fā)生DNA 損傷又是乳腺癌放化療的主要途徑,因此研究DNA 損傷應答對乳腺癌的病因和治療靶點的篩選具有重要的意義。H2A.X 因其同DNA 損傷應答的密切關系而成為研究熱點。目前,ATM-H2A.X-p53 已成為經(jīng)典的DNA 損傷信號途徑:ATM 是DNA 損傷的感受器并磷酸化H2A.X,激活p53,進而啟動細胞周期阻滯、DNA 修復及細胞凋亡[5-7]。然而,除以上經(jīng)典途徑外,H2A.X 可在DNA 損傷應答的不同時期招募不同蛋白形成動態(tài)變化的復合物,Du 等[3]研究表明NPM1 是多種動態(tài)復合物中的常駐成員,而其在H2A.X 介導的DNA 損傷應答過程中的作用尚不清楚。目前,針對NPM1 的研究主要集中NPM1 的突變、過表達及其翻譯后修飾同癌癥之間的關系[8]。研究表明,NPM1 突變已成為急性髓性白血病的標志之一[9-11],而在胃癌[12]、結腸癌[13]、卵巢癌[14]等癌中NPM1 則呈高表達,并通過促進細胞增殖和抑制細胞凋亡發(fā)揮其促癌作用[15-16]。另外,NPM1 是一種可發(fā)生多種翻譯后修飾的蛋白,翻譯后修飾會直接調(diào)控NPM1 的功能,且同多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關[17-18]。近年來,NPM1 的組蛋白伴侶功能也逐漸受到人們的重視,其同組蛋白結合后對組蛋白的轉(zhuǎn)運、染色質(zhì)轉(zhuǎn)錄的調(diào)控功能逐漸為人們所揭示[19]。這提示我們,NPM1 可能因其組蛋白伴侶蛋白的特性同H2A.X 結合,并以DNA 損傷為橋梁在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色。

圖1 H2A.X-pBIND 表達載體的構建Note.A,Amplification of H2A.X gene expression sequence by PCR method.1/2,Replication experiments for increasing PCR products;3,DL2000 DNA Marker.B,TA clone of H2A.X PCR products.1,TA clone products of H2A.X-T5 Zero;2,λ-Hind ⅢDNA Marker.C,Double enzyme validation of H2A.X TA clone.1,H2A.X-T5 Zero double enzyme products by Xbal Ⅰand Kpn Ⅰ;2,DL2000 DNA Marker;3,λ HindⅢDNA Marker.D,Clone between H2A.X and target vector p-BIND.1/2,Clone products of H2A.X-pBIND;3,λ-HindⅢDNA Marker.E,Double enzyme validation of H2A.X-pBIND clone.1/2,H2A.X-pBIND double enzyme products by Xbal Ⅰand Kpn Ⅰ;3,DL2000 DNA Marker;4,λ-Hind ⅢDNA Marker.F,Sequencing results of H2A.X-pBIND.Figure 1 Construction of H2.X-pBIND expression vector

蛋白質(zhì)是生物功能的最終執(zhí)行者,幾乎每一項功能的完成都需要不同蛋白之間的協(xié)同合作。因此,研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用是解析各種調(diào)控機制的關鍵。哺乳動物雙雜交方法衍生于酵母雙雜交[20-21],該方法分別將兩種目標蛋白與轉(zhuǎn)錄因子的DNA 結合結構域與轉(zhuǎn)錄激活結構域相融合,利用目標蛋白的相互結合,使轉(zhuǎn)錄因子的兩種結構域在空間上相互靠近,進而啟動報告基因的轉(zhuǎn)錄,最終利用報告基因的活性指示兩種目標蛋白的結合情況,是研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法[22-23]。同目前主流的蛋白質(zhì)免疫共沉淀方法相比,哺乳動物雙雜交的優(yōu)點在于可最大程度地模擬體內(nèi)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用,也常作為蛋白質(zhì)免疫共沉淀的互補方法;同GST pull-down 實驗及組學方法相比,哺乳動物雙雜交具有操作簡單、成本低的優(yōu)勢。因此,哺乳動物雙雜交是研究蛋白質(zhì)互作中不可缺少的主要方法。

本研究以哺乳動物雙雜交實驗為基礎,構建了H2A.X 和NPM1 相應表達載體,同時實現(xiàn)了兩種表達載體在乳腺癌MCF-7 細胞中的表達,為后續(xù)研究乳腺癌中H2A.X 同NPM1 的結合及功能提供了實驗基礎。但二者在乳腺癌中的相互作用模式以及在乳腺癌DNA 損傷應答過程中扮演的角色仍需進一步的研究。

圖2 NPM1-PACT 表達載體的構建Note.A,Amplification of NPM1 gene expression sequence by PCR method.1/2,Replication experiments for increasing PCR products;3,DL2000 DNA Marker.B,TA clone of NPM1 PCR products.1,TA clone products of NPM1-T5 Zero;2,λ-Hind ⅢDNA Marker;C,Double enzyme validation of NPM1 TA clone.1,H2A.X-T5 Zero double enzyme products by Xbal Ⅰand Kpn Ⅰ;2,DL2000 DNA Marker;3,λ HindⅢDNA Marker.D,Clone between NPM1 and target vector PACT.1/2,Clone products of NPM1-PACT;3,λ-Hind ⅢDNA Marker.E,Double enzyme validation of NPM1-ACT clone.1/2,NPM1-PACT double enzyme products by Xbal Ⅰand Kpn Ⅰ;3,DL2000 DNA Marker.F,Sequencing results of NPM1-PACT.Figure 2 Construction of NPM1-PACT expression vector

圖3 H2A.X-pBIND 和NPM1-PACT 在MCF-7 細胞中的表達Note.1,MCF-7 cells transfected with pBIND (control group);2,MCF-7 cells transfected with H2A.X-pBIND (experiment group);3,MCF-7 cells transfected with PACT(control group);4,MCF-7 cells transfected with NPM1-PACT (experiment group);5,DL2000 DNA Marker.Figure 3 Expression of H2A.X-pBIND and NPM1-PACT in MCF-7 cells