孫思怡，盧勝旭，陸宇明，許恩蘭，吳東梅，劉春華，蔣宗塏，郭劍芬＊

(1.福建師范大學地理科學學院 福建 福州 350007；2.濕潤亞熱帶山地生態(tài)國家重點實驗室培育基地 福建 福州 350007；3.福建農(nóng)林大學莘口教學林場 福建 三明 365000)

土壤微生物是土壤有機質(zhì)分解和養(yǎng)分周轉(zhuǎn)的主要參與者[1]。土壤酶作為微生物代謝的指標，推動著土壤微生物分解有機質(zhì)，在土壤碳、氮、磷循環(huán)過程中發(fā)揮著重要的作用[2]。Sinsabaugh 等研究認為，水解酶的活性可以作為微生物營養(yǎng)需求的指標，而且在C、N 和P 周轉(zhuǎn)相關的酶活性之間也存在化學計量關系[3]。相關研究將微生物用于獲取碳、氮、磷養(yǎng)分的主要水解酶的比值 (βG∶NAG∶AP)，稱為生態(tài)酶化學計量比，能夠反映土壤微生物群落的養(yǎng)分需求和利用能力，并與土壤養(yǎng)分循環(huán)、轉(zhuǎn)化及其有效性聯(lián)系起來，可用來衡量土壤微生物能量和養(yǎng)分資源的限制狀況[3-5]。已有的研究表明生態(tài)酶活性及其計量比受到溫度、水分、pH 值、養(yǎng)分有效性、微生物生物量以及植被特征等因素的影響[6-10]，而將土壤-微生物生物量-酶化學計量比結(jié)合起來的研究鮮有報道。

杉木 (Cunninghamia lanceolata(Lamb.) Hook.)為我國南方主要造林樹種，栽培面積大[11]。近幾十年來，由于杉木林長期單一的純林經(jīng)營，造成連栽杉木人工林的土壤肥力退化、生產(chǎn)力下降等問題[12-15]。已有研究表明，對杉木人工林進行間伐、套種等改造，能夠改善林分質(zhì)量，豐富生物多樣性[16]；杉木純林在套種改造后形成混交林的土壤微生物生物量[17]、土壤肥力和土壤酶活性[18]也得到提高。但過去關于杉木林下套種闊葉樹的研究更多地僅關注套種后土壤理化性質(zhì)及養(yǎng)分的變化，從土壤酶活性及其化學計量比角度的研究較少。為此，本研究在三明格氏栲自然保護區(qū)建立杉木林下套種闊葉樹試驗，研究套種后土壤酶活性及生態(tài)酶計量比的特征，以探討杉木林下套種闊葉樹對提高土壤肥力、促進土壤養(yǎng)分周轉(zhuǎn)的效果。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況與實驗設計

試驗區(qū)位于福建省三明市格氏栲自然保護區(qū)(117°28′ E，26°11′ N) 內(nèi)，該區(qū)屬于中亞熱帶季風氣候，夏熱冬冷且雨熱同季，年均溫19～20 ℃，年降水量達1 740 mm。保護區(qū)內(nèi)平均海拔300～350 m，以低山丘陵為主，植物群落種類豐富且分層明顯。土壤主要以紅壤和黃壤為主，多呈酸性，土壤厚度超過1 m。

自2014 年4 月開始，在三明格氏栲自然保護區(qū)建立杉木林下套種闊葉樹的杉木林試驗區(qū)。套種前先對林地進行疏伐、清除林下雜草、穴狀整地，每個處理的立地條件、坡向、坡位等條件基本一致，明穴規(guī)格為40 cm × 30 cm × 30 cm，林分株行距為2 m × 3 m。設置3 種套種處理，分別為杉木成熟林套種闊葉樹 (套種成熟林)、杉木幼林套種闊葉樹(套種幼林)和杉木純林(對照)，每種處理設置20 m × 20 m 的標準樣地5 個。套種闊葉樹種的杉木林齡分別為51 年生和4 年生，杉木純林的林齡為4 年生。林下套種的種植密度以各闊葉樹種生長后能覆蓋地表為宜，套種的闊葉樹均為3 年生，包括馬褂木 (Liriodendron chinense(Hemsl.) Sarg.)、火力楠(Michelia macclureiDandy)和樂昌含笑(Michelia chapensisDandy)，三者比例為1∶1∶1。栽植后于當年8—9 月?lián)嵊? 次，次年8—9 月進行第二次撫育，撫育內(nèi)容主要包括松土、清除林地雜草等，以促進幼林良好地生長[19]。

1.2 試驗研究方法

1.2.1 土壤樣品采集 2018 年10 月，在套種的每個樣地內(nèi)按“S”型選5 個點，用土鉆取表層土壤(0～10 cm)，將土壤分別充分混合均勻并去除可見的細根和石礫等，再將土樣過2 mm 篩裝入自封袋。一部分存在 4℃冰箱中，用于測定土壤含水量、微生物生物量、碳、氮、磷 (MBC、MBN、MBP)含量、土壤酶活性等，另外一部分自然風干，主要用來測定土壤pH 值和土壤全碳 (TC)、全氮 (TN)、全磷 (TP) 含量等。

1.2.2 土壤基本理化性質(zhì)測定 土壤含水量運用鋁盒烘干衡定法測定，采用ElementarVario MAX 碳氮元素分析儀 (GmbH，Hanau，Germany) 測定土壤TC 和TN 含量；土壤TP 含量的測定則加入濃硫酸-高氯酸消煮后提取待測溶液，使用連續(xù)流動分析儀 (Skalar san++，Skalar，荷蘭) 測定。

1.2.3 土壤微生物生物量碳、氮、磷測定 土壤微生物量運用氯仿熏蒸-浸提法，每個鮮土樣各稱取5 份(5 × 5 g)，兩組土樣放到50 mL 小燒杯中做熏蒸處理，另兩組土樣放到離心管中，放不含氯仿的干燥器中做未熏蒸處理，剩余一組加入62.5 μL 的1 000 mg· kg?1磷標液，放置24 h 進行加標回收實驗。24 h 后，將燒杯中的熏蒸土樣取出，土壤微生物生物量碳和氮 (MBC、MBN) 用2 mL 0.5 mol·L?1K2SO4洗至離心管中，土壤微生物生物量磷 (MBP)用20 mL 0.5 mol·L?1NaHCO3洗至離心管中。未熏蒸的土樣則分別直接加入20 mL 0.5 mol·L?1K2SO4和20 mL 0.5 mol·L?1NaHCO3。MBC 含量用總有機碳分析儀 (TOC-VCPH/CPN，Shimadzu，日本)測定，MBN、MBP 含量用連續(xù)流動分析儀 (San++，Skalar，荷蘭)測定。

1.2.4 土壤酶活性測定 土壤酶活性測定參考Saiya-Cork 等[20-21]的方法，各樣品分別稱取 1 g 土壤加入125 mL 50 mmol·L?1且pH 值為5.0 的醋酸緩沖液中，制成懸浮液，靜置30 min 取上清液200 μL 加入96 孔微孔板中。每個樣品有16 個重復 (200 μL 樣品溶液+50 μL 200 μmol·L–1底物溶液)，8 個陰性對照 (200 μL 醋酸緩沖溶液+50 μL 底物溶液)、8 個空白 (200 μL 樣品溶液+50 μL 緩沖溶液) 和8 個淬火標準液 (200 μL 樣品溶液+50 μL 標準液) 及淬火標準對照液(200 μL 緩沖液+50 μL 標準液)進行校正。再將微孔板置于20℃黑暗培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)4 h 后取出，加入1 mol·L–1NaOH 至每個微孔井使其終止反應。最后采用Synergy H4多功能酶標儀 (Molecular Devices,San Jose,USA)檢測熒光度，酶活性以每小時每克干物質(zhì)產(chǎn)生底物的摩爾數(shù) (nmol·g–1·h–1) 來表達。各種土壤酶的名稱、縮寫、類型及所用標定底物詳細見表1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)經(jīng)Microsoft Excel 2019 軟件處理后，使用SPSS 22.0 軟件進行分析，通過單因素方差分析(One-way ANOVA) 檢驗不同套種處理下土壤理化性質(zhì)、土壤微生物生物量、生態(tài)酶活性及其化學計量比的差異顯著性，并用Pearson 相關分析法分析土壤酶活性及其化學計量比與土壤理化性質(zhì)和微生物生物量碳氮等指標的相關性。使用Canoco Software5.0 軟件對生態(tài)酶活性及其化學計量與土壤理化因子和微生物生物量的關系進行冗余分析（RDA）。

表1 土壤酶的種類、縮寫、類型和所用底物Table 1 The abbreviations,type and substrates of soil enzyme

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

如表2 所示，杉木成熟林套種后土壤pH 值、TC、TN 含量顯著高于套種幼林以及杉木純林，而后兩者之間無顯著差異。不同的套種處理對土壤TP 的含量無顯著影響。不同處理之間土壤C:N、C:P、N:P 差異顯著，其中C:N 的范圍為13.31～9.36，變化趨勢是套種成熟林 >套種幼林 >杉木純林，C:P 和N:P 的范圍分別是260.67～103.38 和19.74～9.94，變化趨勢則是套種成熟林的比值顯著高于套種幼林和杉木純林，而套種幼林與杉木純林之間無顯著差異。

2.2 土壤微生物生物量碳、氮、磷

土壤微生物生物量碳、氮、磷在不同套種處理間變化顯著 (表3)。套種成熟林的微生物生物量碳（MBC）含量分別比套種幼林和杉木純林高8.07%和14.90%。套種成熟林的微生物生物量磷（MBP）含量分別比套種幼林和杉木純林高15.54%和36.75%。但是微生物生物量氮（MBN）含量在三者之間沒有顯著差異。杉木純林土壤的MBN:MBP 明顯高于套種幼林，而與套種成熟林差異不顯著。MBC:MBN 以及MBC:MBP 在不同套種處理之間的差異均不顯著。

表2 不同套種處理土壤理化性質(zhì)Table 2 Physical and chemical properties of soil under different interplanting treatments

表3 不同套種處理下微生物生物量及其計量比Table 3 Microbial biomass and its metering ratio under different interplanting treatments

2.3 土壤酶活性及其計量比

不同的套種處理顯著影響土壤酸性磷酸酶(AP)、β-葡萄糖苷酶(βG)和β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)這3 種土壤水解酶活性 (圖1)，其變化范圍分別為93.29～60.81、0.70～0.22、0.96～0.71 nmol·g?1·h?1。其中AP 酶活性在不同處理間的變化趨勢是套種成熟林 >套種幼林 >杉木純林；杉木純林的βG 酶活性顯著高于套種成熟林和套種幼林，而套種成熟林和套種幼林之間沒有顯著差異性；套種成熟林的NAG 酶活性最高且與套種幼林差異顯著，而杉木純林與其他兩個處理間沒有顯著差異。如圖2 所示，杉木純林βG:NAG 和βG:AP顯著高于套種成熟林和套種幼林，但βG:NAG和βG:AP 在套種成熟林和套種幼林之間差異不顯著。NAG:AP 在各個處理之間的差異均不顯著。

圖1 套種處理對土壤酶活性的影響Fig.1 Effects of different interplanting treatments on soil enzyme activities

圖2 套種處理對土壤生態(tài)酶化學計量比的影響Fig.2 Effects of different intercropping treatments on soil ecological enzyme stoichiometry

2.4 土壤生態(tài)酶活性及化學計量比與土壤理化性質(zhì)的相關性

Pearson 相關分析(表4)表明土壤AP、NAG酶活性分別與土壤pH、TC、TN、MBP 含量以及C:N、C:P、N:P 和MBN:MBP 顯著正相關。其中土壤AP 酶活性與土壤pH、TC、TN、MBP 含量以及C:N、C:P 和N:P 呈極顯著正相關 (P<0.01)，土壤NAG 酶活性與pH 值以及MBN:MBP 呈顯著正相關。而土壤生態(tài)酶計量比中NAG:AP 與土壤理化性質(zhì)相關性不顯著，βG:NAG 與MBP 呈顯著負相關、與MBN:MBP 呈顯著正相關，βG:AP 與pH 值和C:N 呈顯著負相關，與MBP 呈極顯著負相關，而與MBN:MBP 呈顯著正相關。冗余分析表明土壤生態(tài)酶活性及其計量比與土壤C:N 和MBC:MBN 顯著相關。如圖3 所示，第一軸解釋了變量的98.72%，第二軸解釋了變量的0.03%，其中土壤C:N、MBC:MBN 和C:P 分別解釋土壤酶活性和生態(tài)酶化學計量比變化的92.3%、4.4%和1.6%。此外，土壤生態(tài)酶活性及其化學計量比可以將3 種處理明顯地區(qū)分開。

表4 土壤酶活性、酶化學計量比與理化性質(zhì)及土壤化學計量相關性Table 4 Correlation between soil enzyme activity,enzyme stoichiometry and physicochemical properties and soil stoichiometry

圖3 土壤酶活性和生態(tài)酶化學計量比與土壤理化因子的冗余分析Fig.3 Redundant analysis of soil enzyme activity and ecological enzyme stoichiometry and soil physical and chemical factors

3 討論

3.1 不同套種處理對土壤養(yǎng)分、土壤微生物生物量及其化學計量的影響

研究表明，林分的改變會引起凋落物數(shù)量和質(zhì)量、生物量、土壤結(jié)構(gòu)等變化，從而影響土壤碳、氮、磷含量及微生物生物量[22-24]。本研究中，杉木在套種闊葉樹后土壤TC、TN、MBC、MBN 含量顯著增加，因為杉木的葉片多為厚革質(zhì)，富含大量的木質(zhì)素、纖維素等難分解物質(zhì)，其凋落物不易淋溶或被土壤動物機械破壞，微生物難以分解利用，而闊葉樹種凋落物反之，更易于微生物的分解[25-27]。相關研究發(fā)現(xiàn)凋落物的基質(zhì)質(zhì)量可以解釋分解速率變異的21.7%[26]，杉木林下套種闊葉林后，闊葉樹比例增大，凋落物質(zhì)量的改變，加速了凋落物分解，進而影響土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化速率和土壤微生物生物量[28]。本研究結(jié)果表明，套種成熟林的土壤TC、TN、MBC、MBN 含量高于套種幼林，這可能與不同林齡的凋落物產(chǎn)量和分解速率不同有關[29-30]。凋落物數(shù)量和質(zhì)量隨林齡增加而改變，使得土壤TC和TN 含量升高，提供了更為充足的土壤微生物所需養(yǎng)分，從而提高了土壤微生物生物量。

土壤C:N:P 化學計量比是衡量土壤有機質(zhì)和養(yǎng)分狀況的指示器，隨植被類型和養(yǎng)分輸入狀況的變化而改變[31-33]。本研究中杉木林在套種闊葉樹之后C:N 小于杉木幼林，表明套種闊葉樹可能增強了土壤微生物同化作用，使得土壤養(yǎng)分從無機態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橛袡C態(tài)，增加土壤肥力，進一步優(yōu)化土壤質(zhì)量。土壤C:P 和N:P 是P 有效性和養(yǎng)分診斷的指標。全球森林土壤C:P 為81.9，N:P 為6.6，然而本研究中3 種處理的C:P 分別為103.38、260.367、133.34，N:P 分別為9.94、19.74、13.20，均高于全球平均值，這表明本區(qū)域森林土壤受到P 素的限制。

3.2 不同套種處理對土壤酶活性和生態(tài)酶化學計量的影響

βG 酶作為土壤有機碳變化的指標之一，會影響碳素的獲得[34]，土壤中的幾丁質(zhì)分解、氮素的獲取受NAG 酶活性的影響，AP 酶則影響土壤有機磷礦化以及磷素的獲得[35]。本研究中，杉木林下套種闊葉樹使得βG 酶活性顯著降低，而土壤TC 和MBC 含量（圖2，3）在套種處理后總體呈上升趨勢，表明在碳供應充足的情況下，βG 酶活性可能受其他非生物因子的影響更大。套種成熟林NAG 酶活性高于套種幼林，說明隨著林齡的增加，土壤理化性質(zhì)和養(yǎng)分狀況改變，影響凋落物的數(shù)量和基質(zhì)質(zhì)量、林下生物量而改變土壤微生物生物量，進而影響相關土壤酶活性。這與喬航等[36]關于不同林齡油茶人工林土壤酶活性的研究結(jié)果基本一致。此外，套種闊葉樹之后AP 酶活性顯著提高，這可能與套種后土壤微生物生物量磷含量提高有關。

土壤生態(tài)酶化學計量比能夠有效地衡量微生物對 C、N、P 養(yǎng)分的需求[34]，并且在一定程度上反映了土壤微生物生物量和土壤有機質(zhì)之間的平衡狀況、土壤微生物的養(yǎng)分吸收速率和生長效率[37]。全球尺度上，βG:AP 和NAG:AP 的平均值分別為0.62 和0.44[38]，本研究βG:AP 和NAG:AP 的平均值分別為0.006 4 和0.011 3，該研究結(jié)果遠低于全球平均水平，說明該區(qū)域森林生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分循環(huán)受P 限制，這是因為當微生物受磷限制時，相應地會分泌更多的磷酸酶促進土壤有機磷礦化，增加磷素的供應來緩解磷限制。磷酸酶分泌量的增多，土壤中βG:AP、NAG:AP 值則降低[39]，這也與大多數(shù)研究結(jié)果一致[12,40]。另外，套種之后土壤碳氮含量增加，C:P、N:P 和MBC:MBP、MBN:MBP 減小也有可能進一步造成βG:AP 和NAG:AP 減小。βG:AP和βG:NAG 的值均在套種處理之后顯著降低，這可能主要與AP 酶和NAG 酶的活性提高以及βG酶活性降低有關。

3.3 土壤酶活性及生態(tài)酶化學計量特征變化的關鍵驅(qū)動因子

冗余分析結(jié)果表明，土壤C:N、MBC:MBN和C:P 分別解釋土壤酶活性和生態(tài)酶化學計量比的92.3%、4.4%和1.6%。其中C:N 與NAG 成正相關，與βG、βG:NAG、NAG 成負相關；MBC:MBN與NAG、βG:NAG、βG 成負相關；C:P 與AP、βG成正相關，與βG:AP 成負相關。由于土壤酶主要來源于土壤微生物以及凋落物降解的產(chǎn)物等，凋落物等養(yǎng)分輸入改變會造成土壤養(yǎng)分計量比以及微生物生物量的改變，因而導致土壤酶化學計量比亦受土壤養(yǎng)分化學計量比以及微生物生物量計量比的影響[41]。本研究中，相關性分析表明：βG:AP 與土壤C:N 呈顯著負相關，βG:NAG 與土壤 C:N 以及MBC:MBN 均無顯著相關性，說明土壤酶化學計量與土壤養(yǎng)分計量以及微生物生物量并未存在嚴格的對應關系，表明土壤酶化學計量關系是涉及多方面因素的復雜問題。這可能是由于土壤養(yǎng)分的計量比不能表征有效態(tài)養(yǎng)分的計量比[42-43]，此外土壤酶活性可能更多地受到水分、溫度等的間接影響。

4 結(jié)論

杉木套種闊葉樹明顯改變了土壤養(yǎng)分、微生物生物量、生態(tài)酶活性以及生態(tài)酶化學計量比。杉木林下套種闊葉樹對土壤養(yǎng)分含量和相應的微生物生物量產(chǎn)生影響，從而使得套種處理后βG 酶活性顯著降低，土壤AP 酶活性顯著提高，進而導致βG:NAG、βG:AP、NAG:AP 均降低。本研究結(jié)果還表明土壤生態(tài)酶化學計量比不能夠很好的反映土壤養(yǎng)分元素的比例組成，生態(tài)酶的活性可能更多地與有效態(tài)養(yǎng)分組成以及水分、溫度等非生物因素有關，有待進一步研究。