魯俊倩，武 舒，鐘姍辰，張偉溪，蘇曉華，張冰玉

(林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家林業(yè)和草原局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京 100091)

細(xì)胞分裂素是植物生長(zhǎng)過(guò)程中的一類重要調(diào)控激素，其主要通過(guò)雙組分系統(tǒng)進(jìn)行信號(hào)感知與傳遞，參與芽的分化、根的生長(zhǎng)、種子發(fā)育等過(guò)程，且在低溫、干旱及高鹽等非生物脅迫的逆境響應(yīng)中也發(fā)揮重要作用[1-4]。

植物雙組分系統(tǒng)由組氨酸激酶（Histidine Kinase，HK）蛋白、組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移（Histidine Phosphotransfer，HPt）蛋白和反應(yīng)調(diào)節(jié)（Response Regulator，RR）蛋白組成[5-6]。擬南芥（Arabidopsis thaliana）組氨酸激酶由AHK2、AHK3和AHK4（又名CRE1）編碼，與細(xì)胞分裂素結(jié)合對(duì)下游的AHP（Arabidopsis HPts）蛋白和ARR（Arabidopsis Response Regulators）調(diào)節(jié)蛋白進(jìn)行調(diào)節(jié)，進(jìn)而傳遞植物激素（細(xì)胞分裂素、乙烯）和非生物脅迫信號(hào)[2,7-11]。研究表明，組氨酸激酶基因在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，如AHK4對(duì)植物根的發(fā)育具有明顯的調(diào)控作用[12]，AHK3則對(duì)植物葉片的衰老和細(xì)胞分化起主導(dǎo)作用[13-15]，AHK2和AHK3共同調(diào)節(jié)擬南芥的種子萌發(fā)和芽的生長(zhǎng)[16]。另外，組氨酸激酶基因在植物應(yīng)對(duì)低溫、干旱及高鹽等非生物脅迫過(guò)程中也發(fā)揮重要作用[3-4]。Kang 等[17]發(fā)現(xiàn)，擬南芥ahk2和ahk3單突變體比野生型個(gè)體抗旱性明顯增強(qiáng)，并且ahk2/ahk3和ahk3/ahk4雙突變體比相應(yīng)的單突變體抗旱。低溫脅迫時(shí)，ahk2/ahk3和ahk3/ahk4雙突變體比野生型個(gè)體具有較高的抗凍性[18]，ahk2和ahk3單突變體對(duì)干旱、鹽脅迫、低溫和強(qiáng)光等非生物脅迫的抗性比野生型植株顯著增強(qiáng)[3,18]。另外，通過(guò)萌發(fā)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ahk2、ahk3及ahk4單突變體對(duì)外源ABA 高度敏感，外源ABA 對(duì)擬南芥組氨酸激酶基因具有負(fù)調(diào)控作用[3]。通過(guò)ahk2/ahk3雙突變體和野生型植株全基因組表達(dá)分析比較發(fā)現(xiàn)，組氨酸激酶基因在植物ABA 調(diào)控的抗逆反應(yīng)及非ABA 調(diào)控的抗逆反應(yīng)中均起重要作用[19]。在毛果楊（P.trichocarpaTorr.&Gray）基因組中鑒定出1 個(gè)AHK2同源基因PtHK2、2 個(gè)AHK3同源基因PtHK3a和PtHK3b，研究表明，毛果楊PtHK2、PtHK3a和PtHK3b在楊樹(shù)形成層發(fā)育過(guò)程中具有重要調(diào)控作用[20]。然而，組氨酸激酶基因是否參與林木抗逆反應(yīng)尚未見(jiàn)報(bào)道。

銀腺楊‘84K’（P.alba×P.glandulosa‘84K’）是我國(guó)從韓國(guó)引進(jìn)的白楊派優(yōu)良品種，生長(zhǎng)快、材質(zhì)好、抗性強(qiáng)、適應(yīng)性廣，是優(yōu)良的綠化樹(shù)種、生態(tài)樹(shù)種和用材樹(shù)種，且因其易于組培及遺傳轉(zhuǎn)化，成為林木基因工程的理想材料。本研究以銀腺楊‘84K’為材料，克隆了擬南芥AHK3同源基因（PaHK3b）的啟動(dòng)子及全長(zhǎng)CDS（coding sequence），對(duì)其啟動(dòng)子元件及蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了分析，并對(duì)PaHK3b基因在高溫、干旱、鹽脅迫等非生物脅迫及不同植物激素處理下的表達(dá)進(jìn)行了qPCR 檢測(cè)；同時(shí)，通過(guò)原核表達(dá)初步確定其生物學(xué)功能。該研究為利用組氨酸激酶基因進(jìn)行楊樹(shù)抗逆分子改良奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

銀腺楊‘84K’。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1PaHK3b基因的啟動(dòng)子克隆及序列分析 根據(jù)Phytozome 網(wǎng)站上公布的毛果楊基因組信息，查找基因上游啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)PaHK3b基因啟動(dòng)子區(qū)域特異性引物PaHK3b-pro-F 和PaHK3b-pro-R（表1）。采用植物基因組DNA 提取試劑盒（TIANGEN，北京）提取‘84K’楊葉片總DNA，用常規(guī)PCR 方法進(jìn)行目的片段擴(kuò)增，用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，用膠回收試劑盒（Axygen，美國(guó)）回收并純化目的片段，并連接到克隆載體pMDTM19-T Vector（Takara，日本）轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α（TIANGEN，北京），經(jīng)過(guò)藍(lán)白斑培養(yǎng)基（Amp+）篩選，挑取陽(yáng)性單克隆送至生物公司（中美泰和，北京）進(jìn)行序列測(cè)定。利用在線軟件plantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析該基因啟動(dòng)子中含有的順式作用元件。

1.2.2PaHK3b基因CDS 的克隆及序列分析 采用EASY spin Plus 植物RNA 快速提取試劑盒（Aidlab，北京）提取‘84K’楊葉片總RNA，并用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)（takara，日本）試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成單鏈cDNA。根據(jù)Phytozome 網(wǎng)站上公布的毛果楊基因組信息，設(shè)計(jì)PaHK3b基因全長(zhǎng)cDNA 的PCR 擴(kuò)增引物PaHK3b-F 和PaHK3b-R（表1），以單鏈cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)?5℃ 5 min；95℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 3 min，38 個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min；4℃保溫。用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，用膠回收試劑盒（Axygen，美國(guó)）回收純化目的片段，并連接到克隆載體PLB-Vector（TIANGEN，北京）轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，涂含抗性（Amp+）平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取陽(yáng)性單克隆送至生物公司（中美泰和，北京）進(jìn)行序列測(cè)定。利用在線軟件ExpasyProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）對(duì)PaHK3b基因序列特征進(jìn)行分析，使用GOR4 在線工具(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_gor4.pl)進(jìn)行蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用NCBI 在線工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域分析。

1.2.3 ‘84K’楊非生物脅迫處理和激素處理 將帶有頂端的‘84K’楊組培苗嫩莖（2～3 cm）切下，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基 (1/2MS+0.02 mg·L?1NAA+0.05 mg·L?1IBA)中，培養(yǎng)于溫度24℃、光周期16 h/8 h（光照/黑暗）、光照強(qiáng)度為50 μmol·m?2·s?1人工氣候培養(yǎng)室，28 d 后，選取生長(zhǎng)狀態(tài)一致的組培苗，轉(zhuǎn)移到裝有5 mL 1/2MS 液體培養(yǎng)基的玻璃管（直徑4 cm，高20 cm）中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)5 d后，進(jìn)行非生物脅迫處理和植物激素處理。非生物脅迫處理分別為42℃高溫、0℃低溫、200 mmol·L?1NaCl 和5% PEG6000 處理，植物激素為脫落酸（ABA）、6-芐氨基嘌呤（6-BA）、吲哚丁酸（IBA）、赤霉素（GA3）及水楊酸（SA），濃度均為10 μmol·L?1。NaCl、PEG6000 及植物激素處理方法為將藥劑添加到1/2MS 液體培養(yǎng)基中，以培養(yǎng)于1/2MS 培養(yǎng)基中的組培苗為對(duì)照。各處理的時(shí)間均為3 h，每個(gè)處理3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，處理后取成熟葉片，液氮速凍保存于 ?80℃超低溫冰箱。

表1 相關(guān)引物序列及產(chǎn)物大小Table 1 The sequences and PCR product size of primers used in this study

1.2.4PaHK3b基因的表達(dá)分析 提取‘84K’楊根、莖、葉以及不同處理植株葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計(jì)PaHK3b基因?qū)崟r(shí)定量PCR（qRT-PCR）引物PaHK3b-q-F 和PaHK3b-q-R（表1）。將合成的cDNA 稀釋10 倍作為實(shí)時(shí)定量PCR 模板，參照TB Green TM Premix Ex TaqTMII（TliRNaseH Plus）（TaKaRa，日本）試劑盒說(shuō)明配制反應(yīng)體系：TB Green Premix TaqII（TliRNaseH Plus，2 × ）10 μL，Primer-F(10 μmol·L?1) 0.8 μL，Primer-R(10 μmol·L?1) 0.8 μL，cDNA 模板2 μL，ddH2O 補(bǔ)足至20 μL。用Roche Light Cycle 480Ⅱ型熒光定量PCR 儀（Roche，瑞士）進(jìn)行qRTPCR 反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性95℃30 s，變性95℃ 5 s，退火60℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)；溶解曲線為95℃ 5 s，65℃ 1 min。以Actin為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCT算法計(jì)算PaHK3b基因的相對(duì)表達(dá)量[21]。利用Excel2010 和Spass23.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理制圖和差異分析。

1.2.5PaHK3b基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)TIANGEN 公司在線無(wú)縫克隆引物設(shè)計(jì)工具（http://123.56.75.19）設(shè)計(jì)含酶切位點(diǎn)的原核表達(dá)載體引物pET-28a-PaHK3b-F 和pET-28a-PaHK3b-R（表1），PCR 擴(kuò)增‘84K’楊PaHK3b基因的cDNA 序列，回收擴(kuò)增產(chǎn)物。原核表達(dá)載體pET-28a（索萊寶，北京）經(jīng)Hind III（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）單酶切，膠回收純化，根據(jù)EasyGeno 快速重組克隆試劑盒（TIANGEN，北京）操作流程，將二者回收產(chǎn)物進(jìn)行重組反應(yīng)，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)抗性（Kan+）篩選，挑取單克隆進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，并送至生物公司測(cè)序驗(yàn)證，提取陽(yáng)性菌株質(zhì)粒，獲得重組載體（pET-28a-PaHK3b）并轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株BL21（DE3）（TIANGEN，北京）。

1.2.6 重組菌E.coliBL21（pET-28a-PaHK3b）的鹽及干旱脅迫處理 將轉(zhuǎn)化后的表達(dá)菌株BL21（DE3）接種于5 mL 含有50 mg·L?1的卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基，37℃搖床震蕩培養(yǎng)至OD6000.6～0.8，加入終濃度為0.5 mmol·L?1的IPTG 誘導(dǎo)4 h，稀釋菌液104倍，取5 μL 至含有0、50、100、150、200 mmol·L?1NaCl LB 固體培養(yǎng)基上涂抹直徑約為1 cm的9 個(gè)點(diǎn)，超凈臺(tái)吹干菌液，37℃倒置過(guò)夜培養(yǎng)[22]。同時(shí)，取誘導(dǎo)后的產(chǎn)物1 mL 加入到1 mL 含有PEG6000 的LB 液體培養(yǎng)基中使PEG 終濃度為5%（W/V），放置37℃搖床震蕩培養(yǎng)，0～7 h 內(nèi)每隔1 h 測(cè)1 次OD600值，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)3 個(gè)重復(fù)[23-25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘84K’楊PaHK3b 基因CDS 和啟動(dòng)子的獲得及生物信息學(xué)分析

通過(guò)PCR 擴(kuò)增、克隆得到‘84K’楊PaHK3b基因全長(zhǎng)CDS。CDS 全長(zhǎng)為3 060 bp，編碼1 019 個(gè)氨基酸，蛋白分子量為113 564.85 kDa，等電點(diǎn)為6.53，蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為37，為穩(wěn)定蛋白；脂肪族指數(shù)為92.31，蛋白疏水性平均值為?0.088。蛋白主要以無(wú)規(guī)則卷曲為主，α-螺旋與延伸鏈則散布在蛋白中，其中，無(wú)規(guī)則卷曲416 個(gè)(40.82%)、α-螺旋377 個(gè)(37%)、延伸鏈則有226 個(gè)(22.18%)。蛋白結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明，PaHK3b 蛋白具有典型的細(xì)胞分裂素受體結(jié)構(gòu)域，包含CHASE (Cyclaseand histidine kinase associated sensing extracellular)結(jié)構(gòu)域、HisKA (His kinase A domain)結(jié)構(gòu)域及REC(CheY-homologous receiver domain)結(jié)構(gòu)域，其中，CHASE 結(jié)構(gòu)域使細(xì)胞分裂素與其相應(yīng)的受體結(jié)合，HisKA 結(jié)構(gòu)域感知信號(hào)和His 殘基自身磷酸化，REC 結(jié)構(gòu)域與磷酸基團(tuán)相結(jié)合，并向下游的信號(hào)蛋白進(jìn)行傳遞。

克隆得到全長(zhǎng)1 600 bp 的‘84K’楊PaHK3b基因啟動(dòng)子序列，并采用plantCARE 對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明：PaHK3b啟動(dòng)子不僅具有TATA-box 和CAAT-box 核心基本元件，還包括G-box、GA-motif、TCT-motif 等光響應(yīng)元件。另外，PaHK3b啟動(dòng)子區(qū)域還包含多個(gè)與逆境響應(yīng)及激素調(diào)控相關(guān)的順式作用元件，如低溫響應(yīng)元件LTR、防御與脅迫響應(yīng)元件TC-rich repeats、赤霉素響應(yīng)元件GARE-motif、水楊酸響應(yīng)元件TCAelement 等（表2），表明該基因可能參與楊樹(shù)逆境脅迫及激素信號(hào)響應(yīng)。

表2 PlantCARE 預(yù)測(cè)PaHK3b 啟動(dòng)子的主要順式作用元件Table 2 The main cis-elements in PaHK3b promoter predicted by PlantCARE

2.2 ‘84K’楊PaHK3b 基因器官表達(dá)差異性

采用qRT-PCR 技術(shù)對(duì)‘84K’楊PaHK3b基因在根、莖、葉的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明：該基因在根、莖、葉中均有表達(dá)，以根表達(dá)量作為參照，莖表達(dá)量低于根組織，為根表達(dá)量的82%，葉片的表達(dá)量高于根，為根表達(dá)量的1.63 倍（圖1）。以上結(jié)果表明，PaHK3b基因在‘84K’楊葉片表達(dá)量最高。

圖1 ‘84K’楊PaHK3b 基因在根、莖、葉片中的表達(dá)差異Fig.1 Expression difference of PaHK3b gene in root，stem and leaf of ‘84K’ poplar

2.3 非生物脅迫下‘84K’楊PaHK3b 基因的表達(dá)情況

高溫、低溫、鹽脅迫和干旱脅迫條件下，‘84K’楊PaHK3b基因表達(dá)量均明顯高于對(duì)照，并且溫度脅迫下PaHK3b基因表達(dá)量高于鹽脅迫和干旱脅迫下的表達(dá)量（圖2），其中，42℃高溫脅迫、0℃低溫脅迫時(shí)，PaHK3b基因表達(dá)量分別為對(duì)照的2.67、2.61 倍；200 mmol·L?1NaCl 脅迫、5%PEG6000 脅迫時(shí)，PaHK3b基因表達(dá)量分別為對(duì)照的2.28、1.87 倍。以上結(jié)果說(shuō)明，PaHK3b基因參與了非生物脅迫響應(yīng)，在楊樹(shù)的逆境脅迫反應(yīng)過(guò)程中起作用。

圖2 非生物脅迫處理下‘84K’楊葉片PaHK3b 基因的表達(dá)差異Fig.2 Expression difference of PaHK3b in leaf of ‘84K’poplar under abiotic stresses

2.4 ‘84K’楊PaHK3b 基因?qū)ν庠瓷L(zhǎng)素及細(xì)胞分裂素處理的表達(dá)反應(yīng)

圖3 表明：PaHK3b基因?qū)Σ煌参锛に氐捻憫?yīng)有差異。生長(zhǎng)素IBA 處理時(shí)，PaHK3b基因表達(dá)量與對(duì)照相似，而其他激素處理時(shí)，PaHK3b基因表達(dá)量均不同程度的低于對(duì)照，其中，6-BA、ABA、GA3、SA 處理時(shí)，PaHK3b基因表達(dá)量分別為對(duì)照的35%、39%、61%、66%?？梢?jiàn)，外源赤霉素、脫落酸、細(xì)胞分裂素及水楊酸均能抑制楊樹(shù)PaHK3b基因的表達(dá)，表明PaHK3b基因參與植物激素響應(yīng)。

圖3 不同植物激素處理下‘84K’楊葉片PaHK3b 基因的表達(dá)差異Fig.3 Expression difference of ‘84K’PaHK3b under several plant hormone treatments

2.5 重組菌E.coli BL21（pET-28a-PaHK3b）的抗逆檢測(cè)

利用斑點(diǎn)法對(duì)PaHK3b基因的抗鹽性進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明：在未添加NaCl 的LB 固體培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)入pET-28a-PaHK3b重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21 菌株（重組菌株）與轉(zhuǎn)入pET-28a 空載體的菌株（對(duì)照菌株）生長(zhǎng)速度基本一致。在含有50、100、150 mmol·L?1的NaCl LB 固體培養(yǎng)基上，重組菌株與對(duì)照菌株生長(zhǎng)均受到抑制，且隨著NaCl 濃度的增加菌落生長(zhǎng)減少；但重組菌生長(zhǎng)速度較對(duì)照快，菌落多且菌斑大。當(dāng)培養(yǎng)基中NaCl 濃度為200 mmol·L?1時(shí)，2 種菌株均停止生長(zhǎng)（圖4）。因此，PaHK3b基因通過(guò)原核表達(dá)能夠提高大腸桿菌菌株的抗鹽能力。

圖4 大腸桿菌E.coli BL21（pET-28a）和E.coli BL21（pET-28a-PaHK3b）菌株耐鹽性差異Fig.4 Difference in salt tolerance of E.coli BL21（pET-28a）and E.coli BL21（pET-28a-PaHK3b）

利用PEG 模擬干旱脅迫對(duì)PaHK3b基因的抗旱性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明：在LB 液體培養(yǎng)基中，重組菌株的生長(zhǎng)速度較對(duì)照菌株要快；在添加5%PEG6000 的LB 液體培養(yǎng)基中，重組菌株和對(duì)照菌株生長(zhǎng)均受到抑制。培養(yǎng)1 h 時(shí)，重組菌株和對(duì)照菌株生長(zhǎng)沒(méi)有差異，之后轉(zhuǎn)入pET-28a-PaHK3b重組質(zhì)粒的菌株較轉(zhuǎn)入pET-28a 空載的大腸桿菌生長(zhǎng)速度快，培養(yǎng)7 h 后，含重組質(zhì)粒菌株的OD600值是初始的1.8 倍，含空載質(zhì)粒菌株的OD600值是初始的1.1 倍（圖5）。因此，PaHK3b基因原核表達(dá)不僅能夠提高大腸桿菌菌株生長(zhǎng)速度，而且還能夠提高其抗脫水能力。

圖5 大腸桿菌E.coli BL21（pET-28a）和E.coli BL21（pET-28a-PaHK3b）菌株在LB 及LB-5%PEG6000 液體培養(yǎng)基生長(zhǎng)曲線Fig.5 Growth curve of E.coli BL21（pET-28a）and E.coli BL21（pET-28a-PaHK3b）in LB and LB-5%PEG6000 liquid medium respectively

3 討論

組氨酸激酶基因在植物激素信號(hào)響應(yīng)及非生物逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用[3,26]。如擬南芥組氨酸激酶AHK3參與其對(duì)干旱、高鹽及冷脅迫的抗逆反應(yīng)[3-4]，轉(zhuǎn)玉米（Zea maysL.）組氨酸激酶基因ZmHK9的擬南芥抗旱性明顯增強(qiáng)[27]。本研究中，在高溫、低溫、高鹽和PEG 模擬干旱等處理?xiàng)l件下，PaHK3b基因表達(dá)量均增加，其中，基因上調(diào)程度呈高溫>低溫>鹽脅迫>干旱脅迫的模式；在6-BA、ABA、GA3 及SA 處理?xiàng)l件下，PaHK3b基因表達(dá)量均下降，基因下調(diào)程度呈6-BA>ABA>GA3>SA 的模式。因此表明，PaHK3b基因能夠不同程度的參與植物激素信號(hào)響應(yīng)及非生物脅迫信號(hào)響應(yīng)。另外，SA 是植物防衛(wèi)反應(yīng)的重要內(nèi)源植物激素，作為一種信號(hào)分子，在植物生物脅迫響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[28-29]。ABA 在植物抗逆脅迫反應(yīng)及在生物脅迫和非生物脅迫中均具有重要調(diào)控作用。因此，PaHK3b基因可能通過(guò)ABA 及SA 途徑的負(fù)調(diào)節(jié)提高了楊樹(shù)對(duì)逆境脅迫的耐受性。

通過(guò)分析PaHK3b基因CDS 序列發(fā)現(xiàn)，‘84K’楊組氨酸激酶PaHK3b 蛋白具有典型的CHASE 細(xì)胞分裂素受體結(jié)構(gòu)域。在植物外源激素6-BA 處理下，PaHK3b基因下調(diào)表達(dá)，表明該基因能夠感知細(xì)胞分裂素信號(hào)并參與響應(yīng)，這與組氨酸激酶基因具有CHASE 結(jié)構(gòu)域，通過(guò)該結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞分裂素的結(jié)合，感知植物激素信號(hào)并進(jìn)行傳導(dǎo)是一致的[7,10]。對(duì)PaHK3b基因啟動(dòng)子序列分析發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域包含低溫響應(yīng)、防御與脅迫響應(yīng)、赤霉素響應(yīng)、水楊酸響應(yīng)等多個(gè)參與脅迫響應(yīng)及激素調(diào)控的順式作用元件。這與組氨酸激酶基因啟動(dòng)子區(qū)域有多個(gè)植物激素信號(hào)響應(yīng)及非生物逆境脅迫相關(guān)的順式作用元件是一致的[30-31]。另外，結(jié)合在植物激素6-BA、ABA、GA3、SA 和非生物脅迫高溫、低溫、高鹽、PEG 處理下，PaHK3b基因均不同程度參與響應(yīng)的表達(dá)，表明PaHK3b基因參與植物激素信號(hào)響應(yīng)及非生物脅迫響應(yīng)與其基因結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。

已有研究表明，通過(guò)構(gòu)建基因的原核表達(dá)載體，并利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)可以對(duì)基因的功能進(jìn)行初步鑒定。如將小麥（Triticum aestivumL.）脫水蛋白編碼基因——DHN14基因的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌后，大腸桿菌菌株對(duì)重金屬脅迫及過(guò)氧化氫脅迫的耐受性顯著增強(qiáng)，推測(cè)小麥脫水蛋白基因DHN14在其響應(yīng)非生物脅迫的過(guò)程中起作用[23]。轉(zhuǎn)入谷子（Setaria italicaL.）類受體蛋白激酶基因SiRLK35原核表達(dá)載體的大腸桿菌菌株生長(zhǎng)狀態(tài)較陰性對(duì)照好，同時(shí)獲得的轉(zhuǎn)SiRLK35基因水稻植株對(duì)鹽脅迫的耐受性高于對(duì)照[22]。以上研究說(shuō)明，原核表達(dá)結(jié)果能對(duì)克隆基因功能進(jìn)行有效鑒定。在本研究中，轉(zhuǎn)入PaHK3b基因原核表達(dá)載體的菌株在50～150 mmol·L?1NaCl 的LB 固體培養(yǎng)基及5% PEG6000 的LB 液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀態(tài)均好于轉(zhuǎn)入空載體的對(duì)照菌株。因此可得，楊樹(shù)PaHK3b基因能夠促進(jìn)大腸桿菌的生長(zhǎng)，同時(shí)能夠提高其耐鹽和抗旱能力，推測(cè)該基因可能在楊樹(shù)生長(zhǎng)及抗逆境脅迫的過(guò)程中發(fā)揮作用。

4 結(jié)論

本研究從‘84K’楊中克隆了組氨酸激酶基因PaHK3b及其啟動(dòng)子，生物信息學(xué)分析表明，該基因編碼蛋白具有典型的細(xì)胞分裂素受體結(jié)構(gòu)域，其啟動(dòng)子區(qū)域有多個(gè)參與脅迫響應(yīng)和激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的順式作用元件。在高溫、低溫、高鹽和PEG 模擬干旱等非生物脅迫下，PaHK3b基因表達(dá)量增加，而在6-BA、ABA、GA3 及水楊酸等植物激素處理?xiàng)l件下，其表達(dá)量下降。原核表達(dá)PaHK3b基因可以提高受體大腸桿菌的生長(zhǎng)及抗旱耐鹽能力。初步生物學(xué)功能研究表明，該基因參與楊樹(shù)植物激素信號(hào)響應(yīng)，并在其抗逆境脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。本研究結(jié)果為深入研究PaHK3b基因在激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及逆境脅迫下楊樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控作用提供線索，為楊樹(shù)抗逆分子育種及品種改良奠定基礎(chǔ)。