陳修報(bào) 王安琪 鄭浩然 劉洪波 楊 健,①

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江中下游漁業(yè)生態(tài)環(huán)境評(píng)價(jià)和資源養(yǎng)護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 無(wú)錫 214081；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無(wú)錫漁業(yè)學(xué)院 無(wú)錫 214081)

重金屬鎘(Cd)具有來(lái)源廣、積累性強(qiáng)、難以降解、易于沿食物鏈發(fā)生生物放大作用等特點(diǎn)，被列為對(duì)水生生物和人類危害最大的優(yōu)先控制污染物之一(Campbell, 2006; 劉天紅等, 2015)。需要高度關(guān)注的是，我國(guó)漁業(yè)生態(tài)環(huán)境Cd 污染形勢(shì)仍較為嚴(yán)峻(張聰?shù)? 2018)，其中，江河等天然重要漁業(yè)水域中的Cd超標(biāo)率為1.5%，國(guó)家級(jí)內(nèi)陸水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)的Cd 超標(biāo)率達(dá)2.7% (農(nóng)業(yè)部等, 2015)，而水產(chǎn)品中的Cd 殘留現(xiàn)象大量存在，如長(zhǎng)三角地區(qū)池塘養(yǎng)殖水產(chǎn)品中Cd 的超標(biāo)率甚至高達(dá)100% (和慶等, 2017)。因此，亟需對(duì)漁業(yè)水環(huán)境Cd 污染動(dòng)態(tài)進(jìn)行早期預(yù)警和有效監(jiān)測(cè)。

貝類因具有運(yùn)動(dòng)能力差、對(duì)污染物的高積累性和低代謝性等特點(diǎn)，被證實(shí)為評(píng)價(jià)水環(huán)境污染的理想指示生物(崔正國(guó)等, 2015; Farrington et al, 2016)。背角無(wú)齒蚌(Anodonta woodiana)作為“淡水貝類觀察”研究體系的專用指示生物(Yang et al, 2008)，已成功預(yù)警和監(jiān)測(cè)Cd 等污染狀況(Liu et al, 2010; Chen et al,2019)。利用貝類對(duì)水環(huán)境Cd 污染的預(yù)警監(jiān)測(cè)，可分為“致死性”(如分離出整個(gè)軟組織，并測(cè)定其中Cd含量)和“非致死性”(如分析心率等生理指示的響應(yīng)特征) 2 類方法(Liu et al, 2016; 孫珊等, 2017)，而后者越來(lái)越受到重視(Liu et al, 2016; Bakhmet et al,2019)。值得注意的是，前人基于貝類心率對(duì)Cd 污染監(jiān)測(cè)多集中于應(yīng)用成體(貝殼不透明)，需要在貝殼上靠近心臟部位鉆一個(gè)洞(開(kāi)一個(gè)“窗口”)才能觀察到心臟跳動(dòng)(Candido et al, 2006; Liu et al, 2016)，這會(huì)對(duì)貝類產(chǎn)生應(yīng)激影響并導(dǎo)致污染物從“窗口”滲透進(jìn)入軟組織，進(jìn)而影響到貝類真實(shí)的心跳規(guī)律。本研究發(fā)現(xiàn)，背角無(wú)齒蚌早期幼蚌對(duì)Cd 的脅迫非常敏感(陳修報(bào)等, 2017)，且貝殼為透明或半透明狀態(tài)，能夠在非致死或非損傷條件下清晰觀察到心率(Chen et al, 2015)。

本研究嘗試?yán)米灾鏖_(kāi)發(fā)的相關(guān)研究專用“標(biāo)準(zhǔn)化”背角無(wú)齒蚌(陳修報(bào)等, 2017)的早期幼蚌(即從心跳清晰可見(jiàn)直至貝殼不再透明發(fā)育期的個(gè)體)為模式生物，研究其正常的心率規(guī)律，并探索其對(duì)水環(huán)境Cd 毒性的應(yīng)答特征，以期為從新角度開(kāi)發(fā)基于淡水貝類的早期生物預(yù)警和監(jiān)測(cè)技術(shù)提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 早期幼蚌采集與心率檢測(cè)

在“標(biāo)準(zhǔn)化”背角無(wú)齒蚌的人工繁育過(guò)程中(Chen et al, 2015)，連續(xù)采集從心跳清晰可見(jiàn)直至貝殼不再透明的典型生長(zhǎng)階段的早期幼蚌(圖1)：EJ1 [25 日齡，殼長(zhǎng)為(1.5±0.1) mm，平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，下同，n=30]、EJ2 [55 日齡，殼長(zhǎng)為(10.5±0.6) mm，n=30]、EJ3[70 日齡，殼長(zhǎng)為(20.4±0.9) mm，n=30]和EJ4 [85 日齡，殼長(zhǎng)為(30.0±2.0) mm，n=30]。人工繁育方法及水體理化指標(biāo)參見(jiàn)Chen 等(2015)。

圖1 “標(biāo)準(zhǔn)化”背角無(wú)齒蚌的早期幼蚌(□示心臟)Fig.1 The early juvenile of “standardized” A. woodiana(the square shows the heart)

鑒于背角無(wú)齒蚌的活動(dòng)強(qiáng)度存在一定的晝夜節(jié)律變化(早晨最低，傍晚最大)(吳慶龍等, 2005)，為了確認(rèn)早期幼蚌的心率是否具有日間分時(shí)變化差異，分別在09:00～10:00 和16:00～17:00 采集同一批次的早期幼蚌(n=30)，依據(jù)Pandolfo 等(2009)對(duì)淡水貝類幼蚌心率的觀察方法，用解剖鏡直接觀察不同生長(zhǎng)階段早期幼蚌的心率。根據(jù)Liu 等(2016)的統(tǒng)計(jì)方法，心率定義為1 min 觀察到的心跳次數(shù)。

1.2 Cd 暴露實(shí)驗(yàn)

根據(jù)淡水貝類毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)規(guī)范(ASTM, 2006;陳修報(bào)等, 2017)，參考我國(guó)《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》(GB11607-89)規(guī)定的Cd 限量(0.005 mg/L)和作者前期研究獲得的 Cd2+對(duì)背角無(wú)齒蚌幼蚌的安全濃度(0.45 mg/L)(陳修報(bào)等, 2017)，用人工配制軟水(ASTM,2006)和CdCl2(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)配制5 個(gè)Cd2+理論濃度梯度：0 (對(duì)照組)、0.0025、0.005、0.025、0.1 和0.5 mg/L；實(shí)測(cè)Cd2+濃度分別為0、0.0026、0.005、0.026、0.11 和0.55 mg/L。Cd2+實(shí)測(cè)濃度和理論濃度的偏差均＜10%，本研究采用理論濃度對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析和討論。對(duì)照組和暴露組各設(shè)置3 個(gè)平行。

綜合考慮不同生長(zhǎng)階段早期幼蚌在自然水環(huán)境中的存活率及監(jiān)測(cè)適宜規(guī)格，本研究選取EJ4 階段的早期幼蚌作為暴露對(duì)象。用500 ml 玻璃培養(yǎng)皿作實(shí)驗(yàn)容器，溶液200 ml，每個(gè)培養(yǎng)皿加入5 個(gè)幼蚌，每24 h 全部更換溶液以保持Cd2+濃度穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)期間不投餌。實(shí)驗(yàn)于貝類重金屬暴露系統(tǒng)(上海海圣水族設(shè)備廠)中進(jìn)行，水溫保持在(20±1)℃，16 h 光照︰8 h 黑暗，光照強(qiáng)度為1000 lx。實(shí)驗(yàn)持續(xù)96 h，并于24、48、72 和96 h 取樣，觀察心率。心率的觀察和統(tǒng)計(jì)方法同1.1。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

所得數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析。應(yīng)用Paired t-test 比較不同生長(zhǎng)階段早期幼蚌的心率差異性，以及Cd 暴露期間的早期幼蚌心率差異水平。應(yīng)用Pearson 等級(jí)相關(guān)系數(shù)分析心率與殼長(zhǎng)、日齡及Cd暴露濃度、暴露時(shí)間之間的相關(guān)性，并用回歸分析變量之間的關(guān)系。P＜0.05 表示差異水平或相關(guān)性顯著。

2 結(jié)果

2.1 早期幼蚌的心率

不同生長(zhǎng)階段的“標(biāo)準(zhǔn)化”背角無(wú)齒蚌早期幼蚌的心率見(jiàn)表1。EJ1、EJ3 和EJ4 的心率在09:00～10:00和16:00～17:00 之間保持一致(P＞0.05)，只有EJ2 在前期的心率略高于下午(P＜0.05)。隨著日齡的增加或殼長(zhǎng)的增長(zhǎng)，早期幼蚌的心率逐漸降低(表1)，心率(H)與日齡(D)和殼長(zhǎng)(L)之間均呈顯著線性負(fù)相關(guān)(P＜0.05; 圖2)。

2.2 Cd 對(duì)早期幼蚌心率的影響

如圖3所示，暴露期間，對(duì)照組(0)、0.025和0.1 mg/L Cd2+暴露組的“標(biāo)準(zhǔn)化”背角無(wú)齒蚌早期幼蚌(EJ4)的心率總體保持一致(P＞0.05)；0.0025 mg/L Cd2+暴露組的心率在72和96 h出現(xiàn)顯著降低(P＜0.05)；0.005 mg/L Cd2+暴露組的心率在72 h出現(xiàn)顯著降低(P＜0.05)；0.5 mg/L Cd2+暴露組的心率在96 h出現(xiàn)顯著降低(P＜0.05)。心率(H)和暴露時(shí)間(T)僅在0.0025和0.5 mg/L Cd2+暴露組間呈顯著線性負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。

表1 “標(biāo)準(zhǔn)化”背角無(wú)齒蚌早期幼蚌的心率(次/min; Mean±SD; n=30)Tab.1 Heart rates of early juveniles of “standardized”A. woodiana (beats/min; Mean±SD; n=30)

圖2 “標(biāo)準(zhǔn)化”背角無(wú)齒蚌早期幼蚌心率與日齡(a)和殼長(zhǎng)(b)之間的關(guān)系(n=60)Fig.2 Relationships between heart rates and day old (a) as well as shell length (b)of early juveniles of “standardized” A. woodiana (n=60)

圖3 “標(biāo)準(zhǔn)化”背角無(wú)齒蚌早期幼蚌心率(n=15)與Cd 暴露時(shí)間的關(guān)系Fig.3 The relationship between heart rates of early juveniles of “standardized” A. woodiana (n=15) and Cd exposure time

不同暴露時(shí)間下，各組別早期幼蚌(EJ4)的心率變化見(jiàn)圖4。其中，暴露24 h 的0.005、0.1 和0.5 mg/L Cd2+暴露組的心率顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)；暴露48 h的0.5 mg/L Cd2+暴露組的心率顯著低于對(duì)照組和其他暴露組(P＜0.05)；暴露72 h 的0.1 mg/L Cd2+暴露組的心率顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，0.5 mg/L Cd2+暴露組的心率顯著低于對(duì)照組和其他暴露組(P＜0.05)；暴露96 h 的0.5 mg/L Cd2+暴露組的心率顯著低于對(duì)照組和其他暴露組(P＜0.05)。貝類對(duì)Cd2+暴露的響應(yīng)較為敏感，容易引起同一組別中心率變幅較大(Liu et al,2016)。盡管如此，Paired t-test 檢驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著Cd2+暴露濃度的增加，6 個(gè)組別EJ4 的心率(n=15)仍表現(xiàn)為降低趨勢(shì)(圖4)，且Pearson 等級(jí)相關(guān)系數(shù)和回歸分析顯示，6 個(gè)組別EJ4 的心率(H; n=15)和Cd2+暴露濃度(C)之間呈顯著的線性負(fù)相關(guān)(P＜0.05; 圖4)。

圖4 “標(biāo)準(zhǔn)化”背角無(wú)齒蚌早期幼蚌心率(n=15)與Cd 濃度之間的關(guān)系Fig.4 The relationship between heart rates of early juveniles of “standardized”A. woodiana (n=15) and Cd concentrations

3 討論

3.1 早期幼蚌心率規(guī)律

貝類心率是反映新陳代謝強(qiáng)度的重要指標(biāo)(Liu et al, 2016; Bakhmet et al, 2019)。心率變化與生物自身因素(如年齡、規(guī)格、晝夜變化)和外界環(huán)境因素(如水體理化因子、藻類豐富度)緊密相關(guān)(Bakhmet et al,2005、2019; Liu et al, 2016)。本研究在觀察不同生長(zhǎng)階段早期幼蚌的心率規(guī)律時(shí)，所采集的樣本來(lái)源相同、所處的外界環(huán)境因素一致，因此，心率的差異應(yīng)歸因于生物自身因素不同。

本研究為背角無(wú)齒蚌相關(guān)心率重金屬脅迫應(yīng)答方面的首次探索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，早期幼蚌的心率總體無(wú)明顯的日變化(表1)，表明其新陳代謝強(qiáng)度總體保持一致。然而，早期幼蚌心率與日齡、殼長(zhǎng)之間均呈顯著的線性負(fù)相關(guān)(圖2)，這與紫貽貝(Mytilus edulis)的心率變化趨勢(shì)相似(Sukhotin et al, 2017)。日齡和殼長(zhǎng)小的幼蚌比日齡和規(guī)格大的幼蚌的心率快，這可能與前者的新陳代謝(如生長(zhǎng)速率、濾水率)較強(qiáng)有關(guān)。Chen等(2015)研究發(fā)現(xiàn)，30～60日齡(殼長(zhǎng)為1.9～9.1 mm)背角無(wú)齒蚌的相對(duì)生長(zhǎng)率是60～90日齡(殼長(zhǎng)為9.1～28.7 mm)的1.4倍，證實(shí)日齡和殼長(zhǎng)小的幼蚌的代謝強(qiáng)度明顯高于日齡和規(guī)格大的幼蚌。貝類等水生生物的濾水率與心率總體呈正相關(guān)(Grace et al, 1987; 郭鵠飛等, 2018)。背角無(wú)齒蚌的濾水率隨規(guī)格的增大而逐漸降低(彭建華等, 2004)，也支持了本研究的上述觀點(diǎn)。隨著日齡和規(guī)格的增加，貝類中膜磷脂的不飽和程度降低，從而降低膜的離子通透性，促使新陳代謝效率提高，因而導(dǎo)致心率降低(Sukhotin et al, 2017)。

3.2 早期幼蚌心率對(duì)Cd 毒性的響應(yīng)及預(yù)警評(píng)估

貝類通過(guò)攝食和濾水作用主動(dòng)或被動(dòng)的吸收水環(huán)境中的Cd (Farris et al, 2007; Pernice et al, 2009)。之后，經(jīng)過(guò)易化擴(kuò)散、主動(dòng)運(yùn)輸或內(nèi)吞作用，Cd 在有機(jī)體內(nèi)進(jìn)一步轉(zhuǎn)運(yùn)和分配(Farris et al, 2007)。心臟作為貝類循環(huán)系統(tǒng)的最重要器官，是Cd 毒性作用的關(guān)鍵“靶器官”之一(Bakhmet et al, 2012)。

本研究顯示，背角無(wú)齒蚌早期幼蚌(EJ4)的心率和Cd2+暴露時(shí)間之間的“時(shí)間–效應(yīng)”關(guān)系總體不明顯(圖3)。Martinovi?等(2015)將紫貽貝暴露于4.5 mg/L Cd2+(40 μmol/L CdCl2)水體中，結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)24、48和72 h后，紫貽貝的心率未產(chǎn)生明顯變化，與本研究結(jié)果相吻合。這可能是由于較大規(guī)格的背角無(wú)齒蚌(如EJ4)已形成完善的解毒機(jī)制，不僅能夠通過(guò)緊閉雙殼、減少濾水率和呼吸率以減少對(duì)Cd2+的吸收(Farris et al, 2007)，還能夠誘導(dǎo)金屬硫蛋白(MT)的合成來(lái)絡(luò)合Cd2+進(jìn)行解毒(Farris et al, 2007)。例如，Li等(2015)發(fā)現(xiàn)，Cd2+暴露會(huì)引起背角無(wú)齒蚌鰓和外套膜中MT顯著增加，且MT含量與Cd積累量呈線性正相關(guān)，從而在短時(shí)間內(nèi)避免Cd2+對(duì)心率的影響。

值得注意的是，早期幼蚌(EJ4)的心率和Cd2+暴露濃度之間具有顯著的“劑量–效應(yīng)”關(guān)系(圖4)。本研究中，心率和暴露濃度之間呈線性負(fù)相關(guān)(圖4)，這與牛蛙(Rana catesbiana)心率與水體中Pb2+濃度呈負(fù)相關(guān)(高波等, 2015)，羅紋貽貝(Geukensia demmissa)心率與水體中多氯聯(lián)苯(PCB)、多環(huán)芳烴(PAH)濃度呈負(fù)相關(guān)(Galloway et al, 2002)，香港巨牡蠣(Crassostrea hongkongensis)心率與水體中溶解性重金屬(Cd、Cr、Cu、Ni、Pb 和Zn)總濃度呈負(fù)相關(guān)的趨勢(shì)(Liu et al,2016)一致。當(dāng)Cd2+的積累量超過(guò)貝類解毒能力時(shí)，Cd2+就會(huì)通過(guò)與蛋白質(zhì)和鈣基因互作并產(chǎn)生氧化損傷，對(duì)有機(jī)體(如心臟)產(chǎn)生毒性作用(Moulis, 2010)，導(dǎo)致心率降低，研究背角無(wú)齒蚌早期幼蚌的心跳頻率對(duì)Cd2+濃度的毒性效應(yīng)特征，有潛力應(yīng)用于漁業(yè)水環(huán)境Cd 污染的預(yù)警及監(jiān)測(cè)。

綜上所述，本研究首次探索和闡明了“標(biāo)準(zhǔn)化”背角無(wú)齒蚌早期幼蚌的心率規(guī)律及其對(duì)水環(huán)境Cd2+暴露的響應(yīng)特征。早期幼蚌的心率總體沒(méi)有明顯的日變化，心率與日齡、殼長(zhǎng)之間呈顯著的線性負(fù)相關(guān)。早期幼蚌的心率對(duì)Cd2+較為敏感，雖然心率和Cd2+暴露之間未表現(xiàn)出明顯的“時(shí)間–效應(yīng)”關(guān)系，但存在顯著的“劑量–效應(yīng)”關(guān)系。根據(jù)早期幼蚌心率對(duì)Cd2+的響應(yīng)特征，有潛力應(yīng)用于漁業(yè)水環(huán)境Cd 污染的預(yù)警及監(jiān)測(cè)。由于貝類心率可能會(huì)受到水溫、pH、水體硬度等因子的影響，在今后的研究中還需要進(jìn)一步較為系統(tǒng)地探究心率與水質(zhì)因子之間的關(guān)聯(lián)性。