張瑞洲 鮑秀琦 韓宇鵬 姜威 陳剛 甘旭穎
【摘要】目的 探究五味苦參腸溶膠囊(Five-Flavor Sophora flavescens Enteric-Coated Capsules FSEC)對葡聚糖硫酸鈉(Dextran sodium sulfate DSS)誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis UC)模型小鼠結(jié)腸組織中miR-124/STAT3通路表達(dá)的影響。方法:取健康雄性C57BL/6小鼠30只,隨機(jī)分為空白組、模型組、FSEC組,每組10只。模型組、FSEC組飲用3%DSS水7d,空白組正常飲水7d。造模完成后,F(xiàn)SEC組給予3.84/kg/天濃度的五味苦參腸溶膠囊溶液灌腸7d,空白組及模型組則給與等量的生理鹽水灌腸7d。隨后,將全部小鼠切換到正常飲食,觀察各組小鼠的一般狀態(tài),計算DAI評分。一周后處死小鼠,取結(jié)腸組織。提取RNA,實時定量PCR檢測miR-124/STAT3通路的表達(dá)水平。結(jié)果:miR-124中模型組及FSEC組均與空白組有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01),F(xiàn)SEC組與模型組具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。STAT3中模型組及FSEC組均與空白組有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)、FSEC組與模型組具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。而且miR-124及STAT3的相對表達(dá)情況呈負(fù)相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】五味苦參腸溶膠囊;潰瘍性結(jié)腸炎;miR-124/STAT3通路
【中圖分類號】R97 ? 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A ? 【文章編號】2026-5328(2021)12--02
潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種慢性免疫介導(dǎo)的大腸炎癥,常與直腸炎癥有關(guān),但通常向近端延伸,累及結(jié)腸的其他區(qū)域[1]。主要癥狀為持續(xù)或反復(fù)發(fā)作的腹瀉、黏液膿血便伴腹痛、里急 后重和不同程度的全身癥狀[2]長期潰瘍性結(jié)腸炎也與明確的不典型增生和結(jié)直腸癌的風(fēng)險有關(guān)[1]。傳統(tǒng)的UC口服藥物包括但不僅限于5-氨基水楊酸藥物(5-ASA),糖皮質(zhì)激素,英夫利昔單抗等。但是傳統(tǒng)口服藥物存在療效欠佳,不良反應(yīng)明顯等問題。故在UC的臨床治療中,需要尋找一種療效好,不良反應(yīng)輕的口服藥物。五位苦參腸溶膠囊(FSEC)是仝戰(zhàn)旗【3-5】主任研制的國家新藥,現(xiàn)有的研究表明,傳統(tǒng)的中醫(yī)方法【6】治療UC的效果不亞于UC的常規(guī)臨床治療,且不良反應(yīng)相較糖皮質(zhì)激素等藥物小。本實驗通過檢驗FSEC對DSS誘導(dǎo)UC小鼠模型中miR-124/STAT3通路的影響,驗證FSEC的療效,為FSEC應(yīng)用到臨床治療UC提供科學(xué)依據(jù)。
1材料及方法
1.1藥物、試劑與儀器:葡聚糖硫酸鈉(DSS)(美國MP公司),Hotstart HiTaq兩步法逆轉(zhuǎn)錄試劑、miRNA 第一鏈 cDNA 合成、miRNA熒光定量PCR試劑盒、TRIzol(生工生物上海),Gel-Green染料(碧云天),DNAmaker(莊盟),6*loading Buffer(takara)熒光定量PCR管(賽默飛)光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯),PCR儀(美國應(yīng)用生物)。
1.2實驗動物:健康成年雄性C57BL/6小鼠(30只,體重25-27克)購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司
1.3實驗方法:取健康雄性C57BL/6小鼠30只,隨機(jī)分為空白組、模型組、FSEC組,每組10只。各組小鼠實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,模型組、FSEC組飲用濃度為3%DSS飲用水7d,空白組正常飲水7d。造模完成后,F(xiàn)SEC組給予3.84/kg/天濃度的五味苦參腸溶膠囊溶液灌腸7d,空白組及模型組則給與等量的生理鹽水灌腸7d。
1.4小鼠疾病活動指數(shù)(DAI評分):通多對小鼠有無黏液樣便、肉眼血便、重量減輕、活動度減少、毛色變差等情況進(jìn)行疾病活動指數(shù)(disease activity index DAI)評分,評分標(biāo)準(zhǔn)見表1【7】,
1.5實時熒光定量PCR檢測(RT-PCR):
①(1)取各組小鼠的結(jié)腸組織50mg,將取好的組織在液氮中用加入了1ml TRIzol的勻漿器中勻漿等RNA提取步驟獲得總RNA ,
(2)使用miRNA 第一鏈 cDNA 合成試劑盒進(jìn)行合成cDNA
(3)根據(jù)試劑說明進(jìn)行熒光定量的反應(yīng)體系配置
(4)設(shè)定反應(yīng)程序
引物序列:miR-124上游 5′- GGACTTTCTTCA TTCACACCG-3′。
miR-124下游5′- GACCACTGAGGTTAGAGCCA-3′。
用2-ΔΔCt法計算相對表達(dá)量
②取各組小鼠的結(jié)腸組織50mg,將取好的組織在液氮中用加入了1ml TRIzol的勻漿器中勻漿,后續(xù)通過Hotstart HiTaq兩步法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得最終cDNA,并根據(jù)試劑說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增體系配比。引物序列如下:
STAT3 ?上游 5′-GAAGGACA TCAGCGGTAAGA-3′。
STAT3 ?下游5′-AGA TAGACCAGTGGAGACAC-3′。
反應(yīng)條件95℃,10min 用2-ΔΔCt法計算相對表達(dá)量
1.6統(tǒng)計學(xué)方法
采用SPSS25.0和Graphpad Prism8據(jù)分析軟件進(jìn)行分析,采用獨立樣本t檢驗方法,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2結(jié)果
2.1各組小鼠的一般情況變化及臨床表現(xiàn)
空白組:小鼠一般情況良好,體重隨時間逐漸增加,無明顯稀便、黏液樣便、肉眼血便等,活動自如,毛色亮澤。
模型組:小鼠一般情況差,飲食減少,可見黏液便及肉眼血便,體重明顯減輕,活動度差,精神不佳,毛色變差,無光澤。
FSEC組:模型小鼠給予FSEC灌腸治療后,較于模型組有顯著改善,體重減輕受到控制,活動度有所恢復(fù),雖可見稀便及偶有黏液便,但無肉眼血便。
2.2各組小鼠結(jié)腸組織中miR-124及STAT3的相對表達(dá)量
根據(jù)miR-124的相對表達(dá)量可見,模型組及FSEC組均與空白組有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01),F(xiàn)SEC組與模型組具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。STAT3的相對表達(dá)量,模型組及FSEC組均與空白組有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)、FSEC組與模型組具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。而且miR-124及STAT3的相對表達(dá)情況呈負(fù)相關(guān)。
空白組(n=3) 模型組(n=3) FSEC組(n=3)
miR-124 1.00±0.08 0.68±0.15 0.81±0.16
STAT3 1.00±0.11 5.22±1.25 3.83±0.95
* P<0.05,**P<0.01
3討論
潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種慢性炎癥性腸道疾病(IBD)。這些疾病在嚴(yán)重程度、頻率以及腸粘膜、先天和獲得性免疫系統(tǒng)以及微生物群之間的相互作用都很復(fù)雜,到目前為止還沒有確定疾病的病因。雖然治療UC的藥物有很多,包括氨基水楊酸、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑和生物制劑,這些藥物通常對大多數(shù)患者有效,但不是所有患者都有效。而且,由于療程較長,它們的使用通常受到不良反應(yīng)的限制,停用它們往往會導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā),就需要新的、更有效的療法。
MicroRNA是一種小的非編碼RNA寡核苷酸,它在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)蛋白表達(dá),誘導(dǎo)信使RNA(Mrna)降解和/或抑制與30個非翻譯區(qū)結(jié)合的靶基因的翻譯,可以調(diào)節(jié)大量基因的表達(dá),并參與不同的人類疾病。其中MIR-124可以抑制細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激,許多炎癥性疾病及腫瘤疾病的研究中都能看到miR-124/STAT3通路的影子:比如在食道癌中MiR-124過表達(dá)顯著下調(diào)STAT3的mRNA和蛋白水平抑制疾病發(fā)展、STAT3信號通路參與了miR-124介導(dǎo)的對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的抑瘤作用。而對于UC而言,以往的研究表明IL6-STAT3信號通路在UC中的重要性,STAT3 缺乏顯著降低了干擾素 (IFN)-γ、IL-6 和 IL-17A 的產(chǎn)生,而 IL-10 分泌增加,表明 STAT3 可能成為潰瘍性結(jié)腸炎的治療靶點,以往的實驗驗證了miR-124對STAT3磷酸化的抑制作用最大,可以直接調(diào)節(jié)人類結(jié)腸細(xì)胞中STAT3的表達(dá)且UC活動期兒童患者miR-124表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致STAT3表達(dá)上調(diào),其相關(guān)下游靶基因VEGF、BCL2、BCLXL和MMP9表達(dá)上調(diào)。UC活動期患兒組織中miR-124的抑制歸因于STAT3啟動子區(qū)域的高甲基化。因此,靶向miR-124和STAT3可能為UC的治療提供了一種新的途徑。
本實驗結(jié)果顯示與模型組相比FSEC治療組可使miR-124表達(dá)水平上升,STAT3表達(dá)水平下降,證明FSEC可以通過影響miR-124/STAT3通路來達(dá)到治療效果,證明FSEC對UC有一定治療效果。
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通訊作者:鮑秀琦(1963-),女,主任醫(yī)師,碩士,碩士生導(dǎo)師,
第一作者:張瑞洲(1995-),男,碩士生在讀
基金項目:黑龍江省衛(wèi)生計生委科研課題(2019-KYYWF-1346)