王昱芃，趙 洋，李茉涵，史素青，宮永寬

（西北大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院,合成與天然功能分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西安710102）

生物材料相關(guān)的細(xì)菌感染是臨床上亟待解決的難題之一［1，2］.研究發(fā)現(xiàn)，造成這類感染的根源是致病菌在材料表面吸附、增殖并形成細(xì)菌生物被膜，導(dǎo)致致病菌對(duì)抗生素不敏感，產(chǎn)生耐藥性，給病人帶來(lái)二次手術(shù)和巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［3～5］.因此，對(duì)材料表面進(jìn)行化學(xué)修飾，引入具有抗細(xì)菌黏附和/或殺菌功能的物質(zhì)（如聚乙二醇、兩性離子、季銨鹽、殼聚糖和納米銀等），已經(jīng)成為抑制細(xì)菌生物膜形成，預(yù)防生物材料相關(guān)感染的重要途徑之一.

根據(jù)引入的抗菌基團(tuán)類型，生物材料可分為抗細(xì)菌黏附型［6～13］、殺菌型［6～8，14～17］及抗細(xì)菌黏附-殺菌雙重功能表面［6～8，18～25］，其中抗細(xì)菌黏附-殺菌雙重功能表面因兼具主動(dòng)和被動(dòng)雙重抗菌功能而在抗菌表面制備領(lǐng)域備受關(guān)注.多巴胺（DA）仿生黏附是一種便捷高效的普適性表面修飾策略，可通過(guò)構(gòu)筑聚多巴胺（PDA）介導(dǎo)層［23～25］及合成含DA基團(tuán)的功能性聚合物［26～29］等方式在材料表面同時(shí)引入抗生物污染和殺菌功能的物質(zhì)，賦予材料表面抗生物污染和殺菌雙重功能，有效抑制生物被膜形成.Xin等［25］利用DA的萬(wàn)能黏附特性，在聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯（PET）表面預(yù)沉積一層PDA涂層，然后依次通過(guò)點(diǎn)擊反應(yīng)和氧化還原反應(yīng)，在涂層表面引入兩性離子基團(tuán)和納米銀，賦予涂層表面抗生物污染和殺菌雙重功能.Yang等［28］設(shè)計(jì)合成了一種側(cè)鏈含鄰苯二酚、季銨鹽和聚乙二醇的聚碳酸酯類共聚物，采用一步沉積法獲得兼具抗生物污染和殺菌功能的聚合物涂層.上述方法大多存在功能性聚合物制備過(guò)程復(fù)雜及涂層制備工藝工序相對(duì)繁瑣等問(wèn)題，因此，開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)單、高效且適于大規(guī)模生產(chǎn)的雙重抗菌涂層的制備方法逐漸成為抗菌領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一.

受DA氧化-聚合機(jī)理［30，31］啟發(fā)，本文結(jié)合兩性離子的抗生物污染特性和羧甲基殼聚糖（CMC）的殺菌活性，以DA為多重相互作用模型分子，將側(cè)基含伯氨基的磷酰膽堿基聚合物（PMA）和CMC與DA一步共沉積，制備了抗生物污染-殺菌雙重抗菌涂層（CMC-PMA-PDA@PP），研究了CMC和PMA在調(diào)控DA氧化-聚合及抗菌涂層均一性和穩(wěn)定性方面的貢獻(xiàn).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

CMC購(gòu)于西安優(yōu)博生物科技有限公司；DA和2-氨基乙基甲基丙烯酸酯鹽酸鹽（AEMA）購(gòu)于北京百靈威科技有限公司；2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿（MPC）購(gòu)于南京樂(lè)天然科技開(kāi)發(fā)研究所；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）和Syto 9綠色熒光核酸染料購(gòu)于美國(guó)Thermo Scientific公司；聚丙烯（PP）購(gòu)于浙江宏泰塑料廠，裁成20 mm×20 mm大小，依次用清潔劑、丙酮和乙醇超聲清洗30 min，氮?dú)獯蹈珊髠溆?；金黃色葡萄球菌（S.aureus）由西京醫(yī)院提供；碘化丙啶（純度≥95%）購(gòu)于上海翊圣生物科技有限公司.

K-Alpha型X射線光電子能譜儀（XPS），美國(guó)Thermo Electron公司；Multi Mode 8型原子力顯微鏡（AFM），美國(guó)Bruker公司；DSA25型靜態(tài)接觸角測(cè)試儀，德國(guó)Kruss公司；M-2000V型變角度光譜橢偏儀，美國(guó)J.A.Woollam公司；Ti-U型倒置熒光顯微鏡，日本Nikon公司.

1.2 CMC-PMA-PDA雙功能仿生涂層的構(gòu)筑

參考文獻(xiàn)［13］方法合成PMA（圖S1，見(jiàn)本文支持信息），以過(guò)硫酸鉀為引發(fā)劑、AEMA和MPC（摩爾比為2∶8）為單體、去離子水為溶劑，經(jīng)透析純化、冷凍干燥后備用，Mw為1.6×104，Mw/Mn=2.2.

以PDA-PMA共沉積涂層表面潤(rùn)濕性、元素組成和表面形貌為考察指標(biāo)，對(duì)DA和PMA質(zhì)量比進(jìn)行優(yōu)化（圖S2，見(jiàn)本文支持信息）.在DA和PMA質(zhì)量比優(yōu)化的基礎(chǔ)上，將0.025 g CMC，0.05 g EDC和0.03 g NHS依次溶解在50 mL磷酸鹽（PBS，pH=5.0）緩沖溶液中，然后加入0.10 g DA和0.10 g PMA，室溫反應(yīng)9 h，反應(yīng)過(guò)程中用0.1 mol/L HCl溶液維持pH值在5.0左右；反應(yīng)結(jié)束后用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值至8.5；將PP片基浸入其中，在攪拌條件下于室溫反應(yīng)24 h，然后用大量超純水淋洗，經(jīng)N2氣吹干后即得仿生涂層CMA-PMA-PDA@PP（見(jiàn)Scheme 1）.

Scheme 1 Illustration of the fabrication of dual functional coating based on multiple interaction

采用相同方法，將CMC或PMA與DA以質(zhì)量比1∶1制備對(duì)照涂層，分別標(biāo)記為CMC-PDA@PP和PDA-PMA@PP；同時(shí)，將CMC與PMA以質(zhì)量比1∶1制備對(duì)照涂層CMC-PMA@PP，考察CMC和PMA之間的相互作用.

1.3 熒光蛋白吸附

參照文獻(xiàn)［32］方法，將表面改性前后的PP片基于紫外燈下滅菌30 min，在PBS緩沖液中平衡浸潤(rùn)2 h后，浸入25 mL 0.1 mg/mL熒光蛋白（FITC-BSA）中，于37℃，5% CO2及飽和濕度條件下分別孵育5和48 h，用PBS溶液淋洗數(shù)次后，采用倒置熒光顯微鏡測(cè)試其表面熒光強(qiáng)度，根據(jù)FITC-BSA濃度與熒光強(qiáng)度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算FITC-BSA在片基表面的吸附量.

1.4 CMC-PMA-PDA細(xì)菌黏附和殺菌測(cè)試

采用活-死細(xì)菌標(biāo)記法［26］，用S.aureus對(duì)改性前后PP表面的細(xì)菌黏附和殺菌情況進(jìn)行評(píng)價(jià).將不同PP片基置于24孔板中，在紫外燈下滅菌30 min，在滅菌過(guò)的PBS溶液中平衡浸潤(rùn)2 h后，置于新配制的細(xì)菌懸液中，于37°C、5% CO2及飽和濕度條件下分別培養(yǎng)1，3和7 d，每天更換新鮮細(xì)菌懸液；培養(yǎng)結(jié)束后，用PBS淋洗去除表面黏附不牢固的細(xì)菌，轉(zhuǎn)入新的24孔板中，在每孔樣品中心滴加20μL Syto9-PI雙染色劑，避光染色20 min后，通過(guò)倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)菌在PP表面的黏附情況，用ImageJ中閾值分析法對(duì)黏附細(xì)菌進(jìn)行定量分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 CMC和PMA對(duì)DA沉積過(guò)程的影響

2.1.1 表面化學(xué)組成 利用XPS研究CMC和PMA對(duì)沉積涂層表面化學(xué)組成的影響，結(jié)果見(jiàn)表1、表2和圖1.由表1可以看出，與空白PP相比，PDA@PP表面新增N元素，該N1s主要以398.6 eV處C=N—、399.9 eV處—NH2/—NH—和401.6 eV處—NH3+氮結(jié)構(gòu)形式存在（表2和圖1），而且C1s譜中新增C=O（288.2 eV）和C—O/C—N（286.4 eV）碳結(jié)構(gòu)形式，表明在pH=8.5和氧氣存在條件下，DA分子之間通過(guò)氧化、偶聯(lián)、邁克爾加成和/或席夫堿反應(yīng)及氫鍵等多重相互作用發(fā)生了自聚合反應(yīng)，在PP表面形成PDA涂層［30］.當(dāng)在DA沉積液中引入CMC時(shí)，表面C1s含量略有增加，N1s略有下降（表1），這與共沉積涂層中引入CMC聚合物鏈有關(guān)；此外，398.6 eV處C=N—和401.6 eV處—NH3+氮結(jié)構(gòu)含量均增加，說(shuō)明CMC中—NH2可通過(guò)氫鍵和席夫堿或邁克爾加成反應(yīng)等方式調(diào)控DA的沉積過(guò)程.PMA-PDA共沉積涂層表面N元素與CMC-PDA涂層相近（原子分?jǐn)?shù)4.9%），不同之處在于表面新增P元素，原子分?jǐn)?shù)高達(dá)1.8%，402.4 eV處N元素［—N（CH3）3+］與P元素的峰面積之比（N402.4/P）為1.02，表明共沉積過(guò)程中成功向涂層表面引入磷酰膽堿基團(tuán)；與此同時(shí)，398.6 eV處C=N—峰面積增加，401.6 eV處—NH3+含量明顯降低，這可能是由于PMA聚合物鏈上的—NH2可有效驅(qū)動(dòng)醌類結(jié)構(gòu)發(fā)生席夫堿或邁克爾加成反應(yīng)，減少分子間氫鍵作用的緣故［30，31］.當(dāng)PMA-DA共沉積中引入CMC時(shí)，CMC-PMA，CMCDA和PMA-DA之間的相互作用會(huì)形成競(jìng)爭(zhēng)態(tài)勢(shì)，協(xié)同調(diào)控DA的沉積過(guò)程，使涂層表面兼具磷酰膽堿兩性離子基團(tuán)和CMC抗菌聚合物鏈.

Table 1 XPS results of different PP surfaces

Table 2 Composition of different N1s species

Fig.1 High resolution spectra of C1s(A),N1s(B)and P2p(C)on different PP surfaces

Fig.2 Effect of deposition process on the surface morphology of modified PP

2.1.2 表面形貌 通過(guò)AFM研究CMC和PMA對(duì)沉積涂層表面形貌的影響（圖2）.由圖2可以看出，空白PP表面較為平整［圖2（A）］，表面粗糙度（Rq，nm）為1.12 nm；當(dāng)在其表面沉積PDA涂層后，有大量聚集體出現(xiàn)［圖2（B）］，聚集體在Z維方向上尺寸為16～60 nm，Rq增加至3.16 nm，涂層厚度高達(dá)41.5 nm，這可能是由于在弱堿性條件下，DA分子通過(guò)共價(jià)鍵和非共價(jià)鍵協(xié)同作用形成PDA納米顆粒的緣故.當(dāng)CMC（或PMA）與DA以質(zhì)量比1∶1在PP表面共沉積后，涂層表面基本上保持顆粒狀形貌，均一性較PDA@PP明顯改善，大尺寸PDA聚集體數(shù)量顯著降低［圖2（C）和（D）］，該結(jié)果表明CMC或PMA聚合物鏈上的—NH2通過(guò)與醌類結(jié)構(gòu)發(fā)生邁克爾加成和/或席夫堿反應(yīng)，抑制了DA分子間的自聚集和/或自聚合行為［30］，降低較大PDA顆粒形成的幾率，在一定程度上改善了共沉積涂層的均一性.然而，該過(guò)程會(huì)影響共沉積涂層與溶液中分子或粒子的界面相互作用（如PDA間的偶聯(lián)或氫鍵等），進(jìn)而影響涂層厚度，使共沉積涂層厚度與PDA涂層相比大幅下降，為8.2～8.5 nm.當(dāng)CMC和PMA同時(shí)引入DA沉積液時(shí)，所得涂層表面均一、致密，幾乎觀測(cè)不到較大聚集體［圖2（E）］，且涂層厚度增加至17.9 nm.這可能與DA，CMC和PMA之間的共價(jià)鍵-非共價(jià)鍵多重相互作用有關(guān).為了更好地闡明三者之間的協(xié)同作用，用XPS和AFM對(duì)CMC-PMA共沉積涂層進(jìn)行了表征（圖3）.從圖3可以看出，共沉積涂層形貌不均一且表面N和P元素含量較低，原子分?jǐn)?shù)分別為2.0%和0.2%，說(shuō)明CMC和PMA可通過(guò)鏈間微弱的相互作用（如氫鍵和靜電）在基材表面形成疏松的、不均一的聚合物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，該網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可為DA及其衍生物的進(jìn)一步沉積提供相互作用位點(diǎn)，有利于增加涂層厚度；而DA及其衍生物則趨向于通過(guò)共價(jià)鍵和非共價(jià)鍵等途徑與基材界面、溶液中PMA和CMC鏈發(fā)生相互作用，驅(qū)動(dòng)PMA和CMC在PP表面發(fā)生共沉積，增強(qiáng)共沉積涂層與基材界面及涂層各組分之間的結(jié)合力.

Fig.3 Core-level XPS spectra(A,B)and AFM images(C,D)of CMC-PMA coating

2.1.3 涂層表面潤(rùn)濕穩(wěn)定性 水接觸角是表征材料表面潤(rùn)濕性的重要手段，涂層表面潤(rùn)濕性變化可為表面化學(xué)組成和形貌變化提供佐證.圖4為不同PP片基在體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇水溶液中超聲（2 h）前后表面水接觸角的變化情況.從圖4可以看出，空白PP表面呈現(xiàn)固有疏水性，水接觸角為108°.與空白PP相比，PDA@PP表面水接觸角值下降至60°，說(shuō)明DA分子通過(guò)氧化-聚合和邁克爾加成/席夫堿反應(yīng)在PP表面形成了PDA涂層，大量極性基團(tuán)的存在有利于改善PP表面的親水性，這與文獻(xiàn)［25］報(bào)道的結(jié)果一致.在體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇水溶液中超聲2 h后，PDA@PP表面接觸角與空白PP接近，這可能與機(jī)械作用力下PDA涂層發(fā)生大面積脫落有關(guān)（圖S3，見(jiàn)本文支持信息），表明僅通過(guò)DA氧化-自聚所得涂層各組分間及其與基材之間的結(jié)合力較弱.對(duì)于共沉積涂層，CMC-PDA@PP的接觸角數(shù)值較PMA-PDA@PP和CMC-PMA-PDA@PP略高，這可能與后者涂層表面含有與水結(jié)合能力很強(qiáng)的磷酰膽堿兩性離子基團(tuán)有關(guān).將所有共沉積涂層在體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇水溶液中超聲2 h后，接觸角幾乎不發(fā)生變化，耐介質(zhì)性和耐機(jī)械力作用明顯提升，說(shuō)明共沉積過(guò)程中CMC和/或PMA與DA之間發(fā)生了氫鍵、席夫堿和/或邁克爾加成等多重相互作用，有助于提高涂層的穩(wěn)定性.

Fig.4 Wetting stability of the deposited PP surfaces

2.2 仿生涂層抗蛋白質(zhì)吸附性能

用熒光蛋白BSA-FITC的吸附量評(píng)價(jià)不同PP表面的抗生物污染性能（圖5），由圖5可以看出，空白PP、PDA@PP和CMC-PDA@PP表面均出現(xiàn)嚴(yán)重的蛋白質(zhì)吸附現(xiàn)象，說(shuō)明親/疏水性和靜電作用均對(duì)蛋白質(zhì)吸附過(guò)程有較大影響，當(dāng)涂層表面帶電荷時(shí)，涂層表面與蛋白質(zhì)之間的靜電相互作用占主導(dǎo)地位.雖然PDA@PP和CMC-PDA@PP表面親水性有所改善（接觸角值為54°～60°），但其表面均富含—NH3+正電荷，極易與帶負(fù)電的BSAFITC蛋白發(fā)生靜電相互作用，因此，PDA@PP和CMC-PDA@PP表面的BSA-FITC吸附量均較為嚴(yán)重.在共沉積涂層中引入富含磷酰膽堿兩性離子的PMA后，所得涂層（PMA-PDA@PP和CMC-PMA-PDA@PP）表面蛋白質(zhì)吸附量減少了87%～90%，抗生物污染性能良好，這可能與磷酰膽堿兩性離子結(jié)構(gòu)（呈電中性）極易在表面形成水合層，能夠維持與其接觸的生物分子構(gòu)象有關(guān).

Fig.5 Adsorption of BSA-FITC on different PP surfaces for 5 h and 48 h(**p＜0.05)

2.3 仿生涂層抗細(xì)菌黏附-殺菌性能

Fig.6 Fluorescence microscopic images of live and dead S.aureus adhered on bare PP(A1—A3),CMC-PDA(B1—B3),PMA-PDA(C1—C3)and CMC-PDA-PMA(D1—D3)surfaces after 1 d(A1—D1),3 d(A2—D2)and 7 d(A3—D3)of contact

通過(guò)Syto 9-PI熒光核酸染料對(duì)不同PP表面黏附的細(xì)菌進(jìn)行染色，用倒置熒光顯微鏡可將細(xì)胞膜完整的活細(xì)菌（綠色熒光）和細(xì)胞膜受損的死細(xì)菌（紅色熒光）快速區(qū)分開(kāi)來(lái)［26］，并根據(jù)片基表面熒光顏色和強(qiáng)度評(píng)價(jià)其抗細(xì)菌黏附及殺菌性能.圖6和圖7分別為不同PP表面經(jīng)S.Aureus黏附1，3和7 d后倒置熒光顯微鏡照片和用ImageJ軟件對(duì)細(xì)菌黏附量定量分析的結(jié)果.從圖6（A1）～（A3）可以看出，空白PP表面呈綠色熒光，而且在S.Aureus懸液中黏附7 d后，綠色熒光覆蓋整個(gè)PP表面，說(shuō)明空白PP表面極易發(fā)生細(xì)菌黏附且以活菌形式存在.與空白PP不同，紅色熒光覆蓋整個(gè)CMC-PDA@PP表面［圖6（B1）～（B3）］，說(shuō)明CMC能夠直接殺滅與其接觸的細(xì)菌，賦予表面殺菌功能，殺菌率＞99%（圖7）；PMA-PDA@PP表面僅有零星綠色熒光出現(xiàn)［圖6（C1）～（C3）］，細(xì)菌黏附量比空白PP降低了96%～98%，這與磷酰膽堿兩性離子材料優(yōu)異的抗生物污染性能有關(guān).當(dāng)涂層中同時(shí)引入CMC和PMA以后，表面細(xì)菌黏附量比空白PP降低了66%～75%，而且黏附的細(xì)菌均以死細(xì)菌形式存在，殺菌率＞99%［圖6（D1）～（D3），圖7］，表明CMC-PMA-PDA@PP表面兼具抗細(xì)菌黏附-殺菌雙重功能，能夠較好地抑制細(xì)菌生物被膜形成.

Fig.7 Quantitative results of S.aureus attachment(**p≤0.05)

3 結(jié) 論

本文報(bào)道了一種一步共沉積制備抗生物污染-殺菌雙重抗菌涂層的方法，此方法利用CMC和PMA聚合物鏈中的—NH2與多巴胺衍生物發(fā)生氫鍵、邁克爾加成和/或席夫堿反應(yīng)等多重相互作用，調(diào)控DA的沉積過(guò)程，獲得均一、穩(wěn)定、兼具抗污-殺菌雙重抗菌功能的聚合物涂層，有望用于抗菌涂層的大規(guī)模制備領(lǐng)域.

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