(青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，山東 青島 266071)

截至2020年7月12日，新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)已造成216個(gè)國(guó)家和地區(qū)1 275萬(wàn)人感染，死亡人數(shù)達(dá)到近57萬(wàn)人[1]。嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)與SARS-CoV和中東呼吸綜合征相關(guān)冠狀病毒(MERS-CoV)同屬于尼多病毒目冠狀病毒科[2]，病毒顆粒的大小為60～220 nm，呈球形或多形性，有包膜，表面有棒狀凸起。

世界各國(guó)正積極研發(fā)新冠病毒疫苗，目前已經(jīng)有100多種疫苗進(jìn)入臨床前評(píng)估，23種候選疫苗正在進(jìn)行臨床評(píng)估[3]，但是目前對(duì)于新型冠狀病毒的Th細(xì)胞表位的疫苗研究較少。SARS-CoV-2基因組全長(zhǎng)30 000 bp[4-5]，與SARS-CoV和MERS-CoV的同源性分別為79%和50%[6]，SARS-CoV-2的5′端前2/3序列編碼RNA復(fù)制酶蛋白，后1/3序列編碼結(jié)構(gòu)蛋白，該結(jié)構(gòu)蛋白包括刺突蛋白(S蛋白)、包膜蛋白(E蛋白)、膜蛋白(M蛋白)和核衣殼蛋白(N蛋白)。其中S蛋白是Ⅰ型膜糖蛋白，是由兩個(gè)亞基構(gòu)成，前端合成S1亞基(氨基酸殘基位置16～686)，是激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要蛋白[7]，蛋白氨基酸后1/2部分為S2亞基；E蛋白是冠狀病毒中最小的結(jié)構(gòu)蛋白，主要參與病毒包膜的形成以及核衣殼的裝配；M蛋白是Ⅲ型糖蛋白，在包膜形成中發(fā)揮重要作用；N蛋白是一種磷酸化蛋白，位于病毒粒子的核心部分，主要參與病毒的復(fù)制和翻譯過(guò)程。體液免疫和細(xì)胞免疫具有抗SARS-CoV-2感染的作用，其中Th細(xì)胞在體液和細(xì)胞免疫激發(fā)過(guò)程中均發(fā)揮重要作用。有研究表明，嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)患者恢復(fù)期外周血單個(gè)核細(xì)胞對(duì)結(jié)構(gòu)蛋白的T細(xì)胞反應(yīng)是最強(qiáng)的，同時(shí)T細(xì)胞應(yīng)答的強(qiáng)弱與產(chǎn)生中和抗體的多少密切相關(guān)[8]。本研究的目的是采用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)比較SARS-CoV以及SARS-CoV-2的結(jié)構(gòu)蛋白可能包含的輔助性T細(xì)胞(Th細(xì)胞)抗原表位，為尋找SARS-CoV-2疫苗設(shè)計(jì)的潛在靶點(diǎn)提供幫助。

1 材料和方法

在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索2種具有代表性的SARS-CoV(GenBank_NC_004718.3)和SARA-CoV-2(GenBank_NC_045512.2)的參考序列，得到這2種病毒的4種結(jié)構(gòu)蛋白S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白及其對(duì)應(yīng)的氨基酸參考序列。

采用MEGA7軟件中Clustal W序列對(duì)比的方法分析以上4種結(jié)構(gòu)蛋白氨基酸序列的相似度，以GeneDoc軟件呈現(xiàn)對(duì)比的結(jié)果。使用SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm)、IEDB(http://www.iedb.org/)、NetMHCIIpan(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetMHCIIpan-3.2)3個(gè)在線工具，預(yù)測(cè)2種病毒各自可能的Th細(xì)胞表位。各工具篩選標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為：SYFPEITHI評(píng)分>20，IEDB rank<1.00，NetMHCIIpan rank<10，每個(gè)工具的表位肽的長(zhǎng)度設(shè)定為15個(gè)氨基酸，其余設(shè)置均為默認(rèn)值。選取3個(gè)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果的交集獲得2種病毒各自潛在的Th細(xì)胞表位，并將所得到的所有潛在Th細(xì)胞表位進(jìn)行對(duì)比，得到蛋白高度同源(MHC-Ⅱ類分子限制性相同但氨基酸有1～3個(gè)突變)或完全同源(包括MHC-Ⅱ類分子限制性和氨基酸序列均完全一致)的抗原表位。采用ProtScale(https:// web.expasy.org/protscale/)在線分析軟件和Origin繪圖軟件將含有完全及高度同源序列的蛋白質(zhì)進(jìn)行疏水性曲線對(duì)比分析，確定2種病毒相對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)極性有無(wú)差異。

2 結(jié) 果

2.1 2種病毒4種結(jié)構(gòu)蛋白氨基酸序列同源性比較

MEGA7和GeneDoc軟件分析S、E、M、N 4種結(jié)構(gòu)蛋白氨基酸序列的結(jié)果顯示，在SARS-CoV-2中，與宿主細(xì)胞受體結(jié)合的S蛋白氨基酸序列最長(zhǎng)，為1 273個(gè)氨基酸；SARS-CoV-2、SARS-CoV的S蛋白氨基酸序列相似性一般，一致度為75%，變異多位于前1/2的S1亞基部分；SARS-CoV-2中E蛋白氨基酸序列最短，為75個(gè)氨基酸，但保守程度最高，2種病毒的一致度為94%；SARS-CoV-2的M蛋白與N蛋白長(zhǎng)度分別為222以及419個(gè)氨基酸，與SARS-CoV的一致度均為90%。

2.2 SARS-CoV-2與SARS-CoV結(jié)構(gòu)蛋白Th細(xì)胞表位預(yù)測(cè)結(jié)果

通過(guò)SYFPEITHI、IEDB、NetMHCIIpan 3種在線工具篩選得到SARS-CoV-2可能的Th細(xì)胞表位22個(gè)，其中12、3、4、3個(gè)表位分別位于S、E、M、N蛋白中。見表1。SARS-CoV可能的Th細(xì)胞表位25個(gè)，16、3、5、1個(gè)表位分別位于S、E、M和N蛋白中。見表2。對(duì)所得Th細(xì)胞表位的氨基酸位置進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，2種病毒的S蛋白中預(yù)測(cè)到的Th細(xì)胞表位序列多數(shù)位于S1亞基結(jié)構(gòu)上(SARS-CoV-2有7個(gè)，SARS-CoV有11個(gè))；對(duì)其MHC-Ⅱ類分子限制性進(jìn)行分析，2種病毒集中的MHC-Ⅱ類分子等位基因有所不同，SARS-CoV-2多位于HLA-DRB1*01:01等位基因上(7個(gè))，而SARS-CoV多分布于HLA-DRB1*01:01和HLA-DRB1*04:01等位基因上(每個(gè)均有8個(gè)表位)。

2.3 SARS-CoV-2與SARS-CoV的結(jié)構(gòu)蛋白Th細(xì)胞表位及疏水性對(duì)比

對(duì)2種病毒預(yù)測(cè)的Th細(xì)胞表位氨基酸序列進(jìn)一步分析，得到SARS-CoV-2與SARS-CoV完全同源或高度同源的Th細(xì)胞表位(表3)，其中完全同源的表位有2個(gè)，全部位于E蛋白上，氨基酸位置是28～42、25～39，高度同源的表位有6個(gè)，其中4個(gè)位于M蛋白上，E蛋白和N蛋白上各1個(gè)。在高度同源表位序列中，從位置分析，突變的位點(diǎn)多發(fā)生在14和15位氨基酸上，只有1個(gè)突變位于多肽序列的核心位置上，且表位核心序列中“錨點(diǎn)”(即1、4、6、7、9位)的氨基酸沒有發(fā)生突變。從突變類型分析，突變的氨基酸多發(fā)生在纈氨酸(變?yōu)楫惲涟彼?和甘氨酸(變?yōu)楸彼?上，突變數(shù)量分別為4、3個(gè)。利用ProtScale軟件對(duì)蛋白進(jìn)行疏水性曲線對(duì)比分析顯示，突變前后氨基酸類型均為非極性的疏水性氨基酸，如圖1所示，多肽鏈的極性基本沒有發(fā)生改變。

表2 SARS-CoV 潛在的Th細(xì)胞表位

表3 SARS-CoV-2與SARS-CoV一致或高度一致Th細(xì)胞表位

A～C分別為E、M和N蛋白

3 討 論

SARS-CoV是目前冠狀病毒中研究最為深入的一種病毒，也因此提升了對(duì)整個(gè)冠狀病毒的流行病學(xué)、免疫學(xué)以及分子生物學(xué)等的認(rèn)識(shí)，新發(fā)現(xiàn)的SARS-CoV-2與之具有高度的同源性，因此既往關(guān)于SARS-CoV的研究成果為SARS-CoV-2研究提供了一定的幫助和借鑒。SARS-CoV-2是繼2003年SARS-CoV出現(xiàn)后第三個(gè)在世界上造成區(qū)域內(nèi)大范圍流行的冠狀病毒，與之前SARS-CoV相比，SARS-CoV-2傳染性更強(qiáng)，在全球蔓延的范圍更廣，持續(xù)的時(shí)間更長(zhǎng)，造成的經(jīng)濟(jì)損失更大[9-10]。目前仍沒有針對(duì)SARS-CoV-2預(yù)防和治療的特效藥，相關(guān)病毒疫苗的研制是各國(guó)研究的重點(diǎn)，疫苗種類包括但不限于滅活疫苗、減毒活疫苗、病毒載體疫苗、核酸疫苗、蛋白質(zhì)疫苗等[11]。有研究表明，保守性抗原表位是疫苗設(shè)計(jì)的有效靶標(biāo)[12]，隨著免疫信息學(xué)的發(fā)展，與傳統(tǒng)疫苗設(shè)計(jì)相比，表位疫苗可以大大減少研究的成本和時(shí)間，具有更突出的優(yōu)勢(shì)，逐漸成為疫苗研究的熱點(diǎn)[13]。

Th細(xì)胞表位是在免疫應(yīng)答過(guò)程中能夠被Th細(xì)胞表面受體(TCR)特異性識(shí)別的一類外源性抗原肽，在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。被抗原激活的Th細(xì)胞一方面分泌細(xì)胞因子增強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)的抗感染免疫，另一方面輔助B細(xì)胞活化，促進(jìn)B細(xì)胞的增殖、分化和抗體生成[14]。LI等[8]在2008年的研究表明，在SARS-CoV中，與非結(jié)構(gòu)蛋白相比，棘突、膜和包膜等結(jié)構(gòu)蛋白對(duì)T細(xì)胞的免疫原性最強(qiáng)。Th細(xì)胞表位的產(chǎn)生有3個(gè)關(guān)鍵過(guò)程：抗原提呈細(xì)胞(APC)識(shí)別、胞內(nèi)加工處理、MHC-Ⅱ類分子復(fù)合物提呈。由于外源性抗原肽的處理及遞呈機(jī)制研究尚不明確，Th細(xì)胞表位的生物信息學(xué)研究主要是關(guān)于MHC-Ⅱ類分子親和肽的預(yù)測(cè)，但目前疫苗研究的重點(diǎn)蛋白主要在S蛋白，且多數(shù)研究關(guān)注在B細(xì)胞表位，對(duì)Th細(xì)胞表位的研究較少。

S蛋白是SARS-CoV-2結(jié)構(gòu)蛋白中最大的蛋白，其中S1亞基較易突變，而S2亞基的保守性較高。S蛋白的主要作用是與宿主細(xì)胞膜融合，介導(dǎo)病毒吸附。同時(shí)S蛋白也在誘導(dǎo)中和抗體和T細(xì)胞反應(yīng)以及保護(hù)性免疫中起關(guān)鍵作用[15]，是目前病毒疫苗研究最受關(guān)注的蛋白。然而本研究表明，SARS-CoV-2與SARS-CoV的S蛋白Th細(xì)胞表位差異較大，分析其原因，一方面是由于生物信息學(xué)研究方法及技術(shù)本身存在不足，另一方面可能是由于S蛋白氨基酸突變位點(diǎn)較多或MHC-Ⅱ類分子限制性方面存在差異。

E蛋白是病毒結(jié)構(gòu)蛋白中分子量最小的蛋白，同時(shí)是結(jié)構(gòu)蛋白中保守性最強(qiáng)的蛋白質(zhì)，屬五聚體跨膜整合蛋白，主要作用是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體膜上形成離子通道，參與子代病毒的組裝與釋放[16-17]。最近的研究表明，E蛋白有促進(jìn)機(jī)體炎癥反應(yīng)的作用，可作為抗病毒藥物設(shè)計(jì)靶點(diǎn)，同時(shí)SARS-CoV的E蛋白突變的減毒株有望成為候選疫苗[18-19]。本研究中，完全相同表位均位于E蛋白上，推測(cè)其成為候選疫苗表位的潛力較大。

截至2020年9月，NCBI中GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)僅確認(rèn)1條參考SARS-CoV-2序列，大部分研究以此序列為標(biāo)準(zhǔn)。本研究即以此參考序列作為參照選取了2種病毒的4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白的氨基酸序列，利用序列對(duì)比軟件Clustal W比較同源性。使用SYFPEITHI、IEDB、NetMHCIIpan 3個(gè)基于不同算法的MHC-Ⅱ類分子親和肽的預(yù)測(cè)在線預(yù)測(cè)工具，取3個(gè)工具預(yù)測(cè)結(jié)果的交集以提高預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性。這3種在線預(yù)測(cè)工具均包含6個(gè)MHC-Ⅱ類分子等位基因[20]，分別為HLA-DRB1*01:01、HLA-DRB1*03:01、HLA-DRB1*04:01、HLA-DRB1*07:01、HLA-DRB1*11:01、HLA-DRB1*15:01，覆蓋了約35.15%的中國(guó)群體。分析結(jié)果顯示N、M和E蛋白同源性較高，而S蛋白同源性一般。利用在線預(yù)測(cè)軟件對(duì)2種病毒結(jié)構(gòu)蛋白可能的Th細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測(cè)并對(duì)比分析，獲得了8對(duì)完全同源或高度同源表位。氨基酸的疏水性可反映蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，提示潛在的跨膜區(qū)域，并且在保持蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)上起重要作用[21]，對(duì)具有完全同源或高度同源表位的3對(duì)蛋白進(jìn)行疏水性分析發(fā)現(xiàn)，突變的氨基酸位點(diǎn)親疏水性有變化，但對(duì)整體蛋白質(zhì)的疏水性趨勢(shì)影響不大。

綜上所述，本研究采用生物信息學(xué)方法分析比較SARS-CoV和SARS-CoV-2結(jié)構(gòu)蛋白的潛在Th細(xì)胞表位，綜合分析得到8對(duì)完全同源或高度同源表位，為開發(fā)新型冠狀病毒疫苗及其相關(guān)研究提供了基礎(chǔ)，但是否可以誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生特異性的細(xì)胞和體液免疫，還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。