錢蕾,劉延峰,李江華,劉龍,堵國成

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

唾液酸(sialic acids，SA)是9碳氨基糖家族，目前發(fā)現(xiàn)大于40種形式源自神經(jīng)氨酸[1]。在結(jié)構(gòu)上，其2、4、5、7、8和9位上的各種類型的組合有助于SA的多樣性[2]。最常見的SA分子是N-乙酰神經(jīng)氨酸(N-acetylneuraminic acid，NeuAc)，一種羧化的9碳單糖，5位上帶有N-乙?；鵞3]。NeuAc在細(xì)菌和動物中無處不在，是人類SA的主要形式。此外，NeuAc在調(diào)節(jié)生物識別、細(xì)菌免疫和疾病方面具有重要作用[4]，并且是唾液酸化人乳寡糖重要單體之一，對改善嬰兒發(fā)育至關(guān)重要[5]。因此，NeuAc是一種具有較大市場需求的新型生物發(fā)酵產(chǎn)品。

提高NeuAc的發(fā)酵產(chǎn)量以及降低其生產(chǎn)成本一直是推動NeuAc在生物發(fā)酵領(lǐng)域被應(yīng)用的重要前提。在過去的研究中，對NeuAc代謝途徑中的關(guān)鍵酶做理性改造以提高轉(zhuǎn)化效率[6]，但全細(xì)胞催化所需的底物昂貴增加了生產(chǎn)成本[7]。而且在微生物代謝改造中，通常利用較強的轉(zhuǎn)錄翻譯元件以加強產(chǎn)物途徑[8]，弱化[9]甚至敲除競爭途徑[10]，代謝流量大量用于產(chǎn)物合成從而導(dǎo)致細(xì)胞生長受損[11]。生物傳感器與適應(yīng)性進化的組合策略能夠緩解這種平衡失調(diào)[12]，在應(yīng)用選擇壓力時富集高產(chǎn)菌株[13]。進一步地，適應(yīng)性進化對于穩(wěn)定微生物表型以及分析進化過程中特定基因的變化情況是一種有效的辦法[14]。同時，基于質(zhì)粒的基因表達系統(tǒng)是微生物代謝途徑改造的常用工具，然而質(zhì)粒的不穩(wěn)定往往降低了菌株產(chǎn)物合成效率[15]。

為了提升重組枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)合成NeuAc的產(chǎn)量以及解決發(fā)酵過程中重組枯草芽孢桿菌質(zhì)粒丟失的問題，本文在前期研究的基礎(chǔ)上，利用已成功構(gòu)建的NeuAc-Biosensor調(diào)控spc和erm抗性基因表達，實現(xiàn)細(xì)胞生長與產(chǎn)物產(chǎn)量偶聯(lián)，進而通過適應(yīng)性進化提升NeuAc合成效率。同時通過將必需基因folB插入攜帶NeuAc合成途徑關(guān)鍵酶編碼基因重組質(zhì)粒并且敲除基因組中的folB基因，有效降低了發(fā)酵過程中的質(zhì)粒丟失率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本實驗所使用的菌株及質(zhì)粒如表1所示。目的基因擴增引物及敲除引物如表2所示。

表1 本研究中使用的質(zhì)粒和菌株Table 1 Plasmids and strains used in this study

表2 本研究中使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.1.2 酶與試劑

質(zhì)粒提取試劑盒、DNA片段純化試劑盒、感受態(tài)制備試劑盒，生工生物工程(上海)有限股份公司；PrimeStar max聚合酶、限制性內(nèi)切酶，TaKaRa。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 5，pH 7.0;發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉 12，胰蛋白胨 6，(NH4)2SO46，K2HPO4·3H2O 12，KH2PO42.5，MgSO4·7H2O 3，葡萄糖 60，尿素 6；枯草芽孢桿菌感受態(tài)培養(yǎng)基(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))：SPI-A:0.4% (NH4)2SO4，2.8% K2HPO4·3H2O，1.2% KH2PO4，0.2% C6H5Na3O7·2H2O，SPI-B：0.04% MgSO4·7H2O。100×CAYE：2% 酪蛋白水解物，10% 酵母粉，100×EGTA∶10 mmol/L EGTA；SPI:980 μL SPI-A,980 μL SPI-B,20 μL 100×CAYE,20 μL 50%的葡萄糖溶液；SPII:2 mL SPI，20 μL 50 mmol/L CaCl2，20 μL 250 mmol/L MgCl2。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組抗性質(zhì)粒構(gòu)建方法

以質(zhì)粒p136為模板，分別以引物136-spc-F/R和136-erm-F/R進行擴增得到大小為8 744 bp的線性化質(zhì)粒載體；以質(zhì)粒p7s6為模板，引物spc-F1/R1和spc-F2/R2進行擴增得到大小為783 bp的spc基因；以質(zhì)粒p7e6為模板，引物erm-F1/R1和erm-F2/R2進行擴增得到大小為738 bp的erm基因。將擴增得到的線性DNA片段回收純化后進行Gibson組裝[17]，并轉(zhuǎn)化至E.coliJM109進行質(zhì)粒擴增,得到正確重組質(zhì)粒p136-spc、p136-erm和p136-spc-erm。

1.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建與基因敲除方法

以p43 NMK-AN為模板，引物p43-F/R進行擴增得到大小為9 094 bp的線性化質(zhì)粒載體，以B.subtilis168基因組為模板，引物folB-F/R進行擴增得到大小為363 bp的folB基因。將擴增得到的線性DNA片段回收純化后進行Gibson組裝，并轉(zhuǎn)化至E.coliJM109進行質(zhì)粒擴增。菌落PCR和測序驗證后，得到正確重組質(zhì)粒p43-folB，進一步將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌株BS3C。然后對基因組上folB進行敲除[18]，以p7Z6質(zhì)粒為模板，引物zeo-F/R為引物擴增得到大小為656 bp的zeo基因，以B.subtilis168基因組為模板，分別使用引物folB-L-F/R和folB-R-F/R擴增得到大小為944和1 022 bp左右同源臂，將擴增得到的線性DNA片段回收純化后以引物RH-folB-F/R進行PCR融合，將得到融合產(chǎn)物轉(zhuǎn)化上述菌株BS3C，選擇zeo轉(zhuǎn)化子后將pTSC引入，組成型表達的Cre重組酶介導(dǎo)lox71和lox66之間的重組，涂布于無抗性平板并在51 ℃下培養(yǎng)，消除了pTSC，從而獲得了目標(biāo)菌株BS3B。

1.2.3 培養(yǎng)方法

24孔深孔板發(fā)酵：挑取單菌落接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，每孔培養(yǎng)基為1.5 mL，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)50 h左右。上述培養(yǎng)基中加入相應(yīng)篩選濃度的壯觀霉素和紅霉素。

1.2.4 感受態(tài)細(xì)胞制備

大腸桿菌感受態(tài)制備和轉(zhuǎn)化：參照上海生工大腸桿菌超級感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒說明書。

枯草感受態(tài)制備和轉(zhuǎn)化：挑取宿主菌接種于1支2 mL SPI 培養(yǎng)基中,于14 mL搖菌管中，37 ℃搖床培養(yǎng)過夜；取40 μL過夜培養(yǎng)的菌液，接種至用2 mL SPI 培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)5～6 h后，取200 μL接種到2 mL SPII 培養(yǎng)基中，37 ℃ 220 r/min培養(yǎng)1.5～2 h；加入20 μL 100×EGTA溶液，37 ℃ 220 r/min 搖床培養(yǎng)10 min，用1.5 mL離心管分裝成500 μL每管；加入適量的質(zhì)粒0.5～1 μg，輕輕混勻，37 ℃ 220 r/min 培養(yǎng)1.5～2 h；以4 000 r/min 離心2 min收集菌體，棄部分上清液，留100 μL重懸菌體，涂布于相應(yīng)的抗性平板，37 ℃過夜培養(yǎng)。

1.2.5 分析方法

假陽性率測定：將傳代結(jié)束之后的發(fā)酵液系列稀釋后涂布于抗性平板上，挑取平板上全部單菌落進行發(fā)酵驗證NeuAc產(chǎn)量，產(chǎn)量較出發(fā)菌株并未提高的計為假陽性細(xì)胞，計算得到假陽性率。

NeuAc濃度測定：通過HPLC測定分析產(chǎn)物濃度，色譜柱為Aminex HPX-87H柱(300 nm×7.8 nm)；流動相為10 mmol/L H2SO4溶液，流速為0.5 mL/min，NeuAc的保留時間為9.5 min。將發(fā)酵液8 000×g離心10 min后取上清液，用30 mmol/L H2SO4溶液處理混勻后過濾以測定濃度[19]。

質(zhì)粒丟失率測定：將單菌落接種至100 mL液體LB培養(yǎng)基中，12 h后以10% 接種量接種至LB培養(yǎng)基中，連續(xù)培養(yǎng)3代，每12 h轉(zhuǎn)接1次。選擇3個培養(yǎng)時間，隨機挑取100個單菌落點板轉(zhuǎn)接至LB和卡納抗性平板，比較2種平板上菌落數(shù)，計算質(zhì)粒丟失率。

上述實驗均設(shè)置了3組平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 NeuAc-Biosensor調(diào)控spc和erm基因表達效果驗證

利用前期成功構(gòu)建的NeuAc-Biosensor質(zhì)粒p136來構(gòu)建的重組質(zhì)粒，調(diào)控抗性基因spc和erm表達。這里使用的NeuAc-Biosensor是基于自FadR/GntR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子NanR所構(gòu)建[8]。NeuAc-Biosensor由2個反向連接的啟動子組成，分別調(diào)控NanR基因和GFP基因，為了將熒光蛋白的表達與細(xì)胞內(nèi)NeuAc聯(lián)系起來，在調(diào)控表達GFP基因的不同啟動子中插入NanR結(jié)合位點，從而形成動態(tài)開關(guān)，即當(dāng)細(xì)胞內(nèi)NeuAc濃度低時，NanR與啟動子中的結(jié)合位點結(jié)合，阻止RNA聚合酶與啟動子結(jié)合并抑制下游GFP基因轉(zhuǎn)錄；當(dāng)細(xì)胞內(nèi)NeuAc濃度高時，NanR的活性被NeuAc的變構(gòu)調(diào)節(jié)所消除，使得啟動子與NanR結(jié)合得到釋放，啟動子與RNA聚合酶結(jié)合并正常開啟下游基因的轉(zhuǎn)錄[16]?？紤]到產(chǎn)NeuAc宿主菌株中質(zhì)粒帶有卡納霉素抗性基因，因此選取枯草芽孢桿菌中另外2種常用抗性基因作為調(diào)控靶基因，即壯觀霉素抗性基因spc和紅霉素抗性基因erm，利用NeuAc-Biosensor調(diào)控spc和erm表達，將胞內(nèi)NeuAc濃度與壯觀霉素或紅霉素抗性相關(guān)聯(lián)。將PCR擴增后的spc基因和erm以及載體質(zhì)粒通過Gibson組裝構(gòu)建重組質(zhì)粒，如圖2所示。然后將質(zhì)粒p136-spc，p136-erm轉(zhuǎn)化入NeuAc產(chǎn)量不同的枯草芽孢桿菌中，分別為BS1(0.8 g/L)、BS2(1.5 g/L)、BS3(2.4 g/L)，將成功轉(zhuǎn)化的上述菌株挑取單菌落后進行24孔深孔板發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)時培養(yǎng)基內(nèi)添加相應(yīng)抗生素，以半抑制濃度來表征調(diào)控效果，結(jié)果如表3所示。

a-p136-spc重組質(zhì)粒；b-p136-erm重組質(zhì)粒；c-p136-spc-erm重組質(zhì)粒圖1 重組抗性質(zhì)粒圖Fig.1 Map of recombinant resistance plasmid

表3 不同NeuAc產(chǎn)量重組枯草芽孢桿菌生長的抗生素半抑制濃度 單位：mg/L

從表3可知，高產(chǎn)菌株能夠在較高抗生素濃度條件下生長，說明biosensor對于抗性基因有較好的調(diào)控效果。

2.2 基于適應(yīng)性化的BS3菌株發(fā)酵產(chǎn)NeuAc

適應(yīng)性進化對于提高微生物在相關(guān)培養(yǎng)基上的生長和抗應(yīng)變能力很重要。通常，實驗室中常用的定向進化方法為分批培養(yǎng)-連續(xù)傳代，這種方法成本比較低并且可以通過深孔板等更小培養(yǎng)體積的設(shè)備進行大規(guī)模培養(yǎng)，物理化學(xué)因素也比較可控。因此在這里我們選擇分批培養(yǎng)-連續(xù)傳代培養(yǎng)方法。在之前的研究中，通過對2個關(guān)鍵前體N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和磷酸烯醇式丙酮酸的供應(yīng)途徑進行模塊途徑工程以及平衡NeuAc的生物合成和細(xì)胞生長，NeuAc產(chǎn)量達到2.18 g/L[10]。為了進一步提高NeuAc產(chǎn)量且平衡細(xì)胞生長，我們將生物傳感器與適應(yīng)性進化結(jié)合，在進化過程中不斷提高抗生素濃度，使得高產(chǎn)細(xì)胞形成生長優(yōu)勢，從而富集得到高產(chǎn)菌株。由2.1小節(jié)可知，NeuAc-biosensor對抗性基因的調(diào)控效果在菌株BS3中效果較顯著，因此以帶有單抗性和雙抗性的BS3菌株為出發(fā)菌株，抗生素的篩選濃度梯度如表4所示，對其進行適應(yīng)性進化，孔板發(fā)酵每隔24 h以10%的接種量進行取樣及傳代，5次傳代之后結(jié)束發(fā)酵。前期研究發(fā)現(xiàn)，在進化過程中，小部分細(xì)胞在沒有指定代謝物產(chǎn)生的情況下也能存活[19]，這種“逃逸”是由于永久選擇敏感性的突變引起的[20-21]，因此我們使用了雙抗性標(biāo)記篩選來減少這種假陽性者的存活。經(jīng)過5輪進化篩選之后，我們對3種抗性篩選平板均選取了15個單菌落進行了發(fā)酵驗證，通過HPLC方法測定NeuAc濃度后發(fā)現(xiàn)壯觀霉素和紅霉素篩選分別有4個和5個菌落較出發(fā)菌株產(chǎn)量有提高，而雙抗性篩選則有8個菌落較出發(fā)菌株產(chǎn)量有所提高，不同菌株的產(chǎn)量如圖2所示。按照上述假陽性率測定方法得到單抗性篩選的假陽性率為73.3%(壯觀霉素)、66.7%(紅霉素)，而雙抗性篩選的假陽性率則為46.7%。通過單抗性標(biāo)記與雙抗性標(biāo)記篩選的對比實驗發(fā)現(xiàn)，雙重選擇能夠有效減少假陽性菌株，再次體現(xiàn)了雙抗性篩選策略的優(yōu)勢，同時得到1株產(chǎn)量為(3.16±0.19)g/L的菌株BS3C，較出發(fā)菌株產(chǎn)量提高了31.7%。

表4 適應(yīng)性進化抗生素篩選濃度表Table 4 Concentration of antibiotic for adaptive evolution screening

a-壯觀霉素篩選產(chǎn)量驗證；b-紅霉素篩選產(chǎn)量驗證；c-壯觀霉素和紅霉素篩選產(chǎn)量驗證圖2 適應(yīng)性進化后NeuAc產(chǎn)量驗證Fig.2 NeuAc production verification after adaptive evolution

2.3 基于對必需基因folB的改造提高質(zhì)粒穩(wěn)定性

抗生素抗性是重組質(zhì)粒常用的篩選標(biāo)記，添加抗生素可以提供選擇壓力，抑制質(zhì)粒丟失的細(xì)胞生長。然而，抗生素在培養(yǎng)過程的降解會造成選擇壓力失效。另外，抗生素的添加還增加了成本，可能在工業(yè)環(huán)境中污染最終產(chǎn)品。雖然染色體整合表達具有更高的穩(wěn)定性，但在許多情況下，基因整合效率低和表達強度不足阻礙了染色體整合表達的應(yīng)用[22]。為了在不使用抗生素的情況下實現(xiàn)對質(zhì)粒的選擇和維持，我們敲除了枯草芽孢桿菌基因組中的必需基因folB(編碼二氫喋呤醛縮酶),同時在表達NeuAc合成途徑關(guān)鍵基因的質(zhì)粒中插入必需基因folB，獲得BS3C菌株，使細(xì)胞中必需基因folB的表達依賴于質(zhì)粒的存在和質(zhì)粒中folB表達(圖3)。通過上述改造，質(zhì)粒的丟失率由34.1%下降至11.8%，BS3C菌株NeuAc產(chǎn)量為(3.34±0.22)g/L，維持在穩(wěn)定水平。上述結(jié)果說明，利用必需基因改造的方法可以有效的保證產(chǎn)NeuAc枯草芽孢桿菌中質(zhì)粒的穩(wěn)定性。

a-質(zhì)粒穩(wěn)定性改造策略；b-質(zhì)粒穩(wěn)定性改造后產(chǎn)量與質(zhì)粒丟失率圖3 質(zhì)粒穩(wěn)定性改造Fig.3 Modification of plasmid stability

3 結(jié)論

NeuAc在食品和生物醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用，代謝改造是提高重組枯草芽孢桿菌中NeuAc產(chǎn)量和降低生產(chǎn)成本的重要手段。本研究利用NeuAc-Biosensor調(diào)控抗生素抗性基因表達，進而通過增加抗生素濃度進行適應(yīng)性進化，NeuAc合成效率提升了33.8%。進一步通過將必需基因folB插入攜帶NeuAc合成途徑關(guān)鍵基因重組質(zhì)粒，并且敲除基因組中的folB基因，有效降低了發(fā)酵過程中的質(zhì)粒丟失率。本研究提升了重組枯草芽孢桿菌合成NeuAc的產(chǎn)量和穩(wěn)定性，為重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵法生產(chǎn)NeuAc奠定了基礎(chǔ)。