匡文玲，李佳，韓林,，蔣永波,3，邱玲嵐，汪開拓,3*，王敏*

1(重慶三峽學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，重慶，404100)2(西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌，712100)3(重慶匯達(dá)生物科技股份有限公司，重慶，402660)

檸檬是蕓香科(Rutaceae)柑橘屬(Citrus)常綠小喬木，廣泛種植于我國四川、重慶、廣東、廣西和福建等省市，種植面積達(dá)88.7 億m2，主要栽培品種為尤力克[1-2]。檸檬果實(shí)富含精油、有機(jī)酸、黃酮、維生素等多種活性營養(yǎng)成分，具有抗氧化、抗炎癥、抑菌和降壓降脂等功效，特別是檸檬皮中的檸檬苦素，在殺菌、殺蟲以及抗癌等方面效果良好[3-6]。研究發(fā)現(xiàn)，檸檬果皮和果肉中均含有豐富的多酚，其中在果皮中含量較高。同時(shí)，不同品種檸檬中酚酸和類黃酮含量差異較大，尤力克檸檬中總酚含量顯著高于小青檸、青檸檬和香水檸檬3個(gè)品種[1,7]。BARRECA等[8]利用高效液相色譜-二級(jí)管陣列-電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜法在檸檬果汁中發(fā)現(xiàn)了多種黃酮類成分，如橙皮苷(4.29 mg/L)和圣草枸櫞苷(2.10 mg/L)等，體外抗氧化活性試驗(yàn)表明，檸檬果汁可有效清除ABTS陽離子自由基和DPPH自由基，顯示了良好的抗氧化活性。然而，檸檬果汁的成分組成尚未完全明確，并且有關(guān)檸檬果汁成分的研究報(bào)道極少。

本研究采用HPLC-MS/MS技術(shù)，分析了檸檬(品種為尤力克)果汁中的主要成分，并在高脂誘導(dǎo)的L-02肝細(xì)胞氧化損傷模型中，研究了檸檬果汁的抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

檸檬果汁(品種為尤力克)，重慶市潼南區(qū)匯達(dá)檸檬科技集團(tuán)有限公司飲料加工廠；L-02(HL-7702)人肝正常細(xì)胞，美國ATCC；DMEM高糖培養(yǎng)基，Gibco公司；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)，BI公司；胰蛋白酶、硫酸鏈霉素，南京生興生物技術(shù)有限公司；注射用青霉素鈉，蘇州二葉制藥有限公司；MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(C0009)、活性氧檢測(cè)試劑盒(S0033S)、CuZn/Mn-SOD活性檢測(cè)試劑盒(S0103)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(P0012S)，碧云天生物技術(shù)；SOD2抗體、Cell Signaling Technology；GAPDH抗體、Bioworld Technology。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-30A+TripleTOF5600+高分辨離子淌度液質(zhì)聯(lián)用儀，AB SCIEX公司；DMi8型倒置熒光顯微鏡，Leica公司；ChemiDocXRS+型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，美國伯樂公司；LGJ-25C型真空冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)儀器廠；QuantStudio 6 Flex熒光定量PCR儀，Lifte Technologies。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 檸檬果汁的制備和冷凍干燥

檸檬果實(shí)按如下工藝流程制備得到檸檬原汁：洗果→磨油→全果壓榨→過濾→均質(zhì)→脫氣→UHT滅菌→灌裝，檸檬果汁用0.22 μm水相微孔濾膜過濾后進(jìn)行冷凍干燥，得到檸檬果汁凍干粉，-20 ℃保存，備用。

1.3.2 HPLC-MS/MS分析

采用HPLC-MS/MS對(duì)檸檬果汁中的主要成分進(jìn)行分析[9-10]。HPLC條件：色譜柱為島津Shim-packXR-ODS(100 mm×2.0 mm,2.2 μm)；流動(dòng)相A為超純水(加入體積分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸)，流動(dòng)相B為乙腈；流速0.4 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量為10 μL；梯度洗脫條件為0～9 min，5%～95% B；9～10 min，95% B；10～11 min，95%～5% B；11～14 min，5% B。

質(zhì)譜條件：IDA采集模式；掃描范圍100～2 000(MS)，50～2 000(MS/MS)；離子源：ESI(negative)；霧化氣：50 psi；輔助氣：50 psi(1 psi=6 894.757 Pa)；離子源溫度550 ℃；噴霧電壓-4 500 V。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)

L-02細(xì)胞采用高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，并添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清，100 μg/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素，培養(yǎng)條件為5% CO2、37 ℃。當(dāng)細(xì)胞生長至85%左右融合度時(shí)，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代處理，本試驗(yàn)所用細(xì)胞均為3～15代[11]。

1.3.4 細(xì)胞活性試驗(yàn)

將L-02細(xì)胞接種于96孔板中，待細(xì)胞生長至75%左右，加入不同質(zhì)量濃度(0.1、1.0、2.0和3.0 mg/mL)的檸檬果汁共孵育24 h，吸除各孔中的培養(yǎng)基，用PBS清洗2～3次后，再加入0.5 mg/mL的MTT染色液10 μL，避光孵育4 h，再加入100 μL的Formanzan溶解液，靜置繼續(xù)孵育，待孔板內(nèi)紫色的結(jié)晶完全溶解后，在570 nm下測(cè)定吸光度。以空白對(duì)照組的吸光度為100%，計(jì)算不同濃度檸檬果汁對(duì)L-02細(xì)胞增殖的影響(以百分比表示)。

1.3.5 細(xì)胞中活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平檢測(cè)

將細(xì)胞接種于6孔板中，待生長至85%左右，用PBS清洗細(xì)胞3次，再加無血清培養(yǎng)基饑餓處理3 h，然后按如下實(shí)驗(yàn)分組處理24 h后，棄去培養(yǎng)基，加入ROS檢測(cè)探針DCFH-DA(10 μmol/mL)，置于37 ℃，避光孵育30 min，再用PBS洗掉未與細(xì)胞結(jié)合的探針染料，利用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。

實(shí)驗(yàn)分組如下：

(A)空白組：高糖無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；

(B)高脂組：高糖無血清DMEM培養(yǎng)基孵育+100 μmol/mL的棕桐酸培養(yǎng)；

(C)檸檬果汁組：加入1.0 mg/mL的檸檬果汁預(yù)保護(hù)30 min后，再與100 μmol/mL的棕桐酸共孵育。

1.3.6 抗氧化酶活性檢測(cè)

將細(xì)胞接種于6孔板中，待生長至融合度為85%左右，用無血清培養(yǎng)基饑餓處理3 h，再按1.3.5分組處理24 h后，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS清洗3次，加入80 μL細(xì)胞裂解液，用刮刀收集細(xì)胞，充分振蕩后，于4 ℃下10 000 r/min離心5 min，取上清液按照SOD酶活性檢測(cè)試劑盒說明進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)行BCA蛋白定量。

1.3.7 線粒體數(shù)量的檢測(cè)

根據(jù)線粒體DNA(mtDNA)表達(dá)量的多少判斷細(xì)胞中線粒體的數(shù)量。L-02細(xì)胞經(jīng)過18 h處理后，利用TIANamp Genomic DNA提取試劑盒提取細(xì)胞中的DNA，分別選用ND1和nuclear18S基因作為標(biāo)記表示mtDNA和總的DNA(tDNA)含量，然后采用qRT-PCR進(jìn)行定量檢測(cè)。ND1和nuclear18S基因的上游引物為ATGGCCAACCTCCTACTCCT和ACGGACCAGAGCGAAAGCA，下游引物為GCGGTGATGTAGA-GGGTGAT和GACATCTAAGGGCATCACAGAC，結(jié)果以mtDNA/tDNA表示[11]。

1.3.8 Western blot試驗(yàn)

L-02細(xì)胞按1.3.5分組，處理12 h后，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS清洗3次，加入含1 mmol/L 苯甲基磺酰氟(PMSF)的radio-immunoprecipitation assay(RIPA)細(xì)胞裂解液，收集細(xì)胞，進(jìn)行BCA蛋白定量，然后加入1×的上樣緩沖液，沸水煮10 min使蛋白變性，-20 ℃保存，備用。樣品中的蛋白質(zhì)經(jīng)過電泳分離，濕轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，然后置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂牛乳中封閉2 h，用Tris-HCl Tween 20(TBST)清洗3次，置于一抗中4 ℃孵育過夜，加入TBST緩沖液清洗3次后，再孵育二抗(37 ℃，2 h)，二抗回收后，再次用緩沖液TBST清洗，然后進(jìn)行顯影和拍照。利用ImageJ軟件對(duì)膜上的目標(biāo)蛋白條帶進(jìn)行定量分析和比較。

1.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用GraphPad prism7對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，結(jié)果以平均值±SD表示。P<0.05表示差異顯著，用*表示，P<0.01表示差異極顯著，用**表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 檸檬果汁中的成分分析

采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)檸檬果汁中的主要成分進(jìn)行分析，結(jié)果如表1所示。由表1可知，從檸檬果汁中共鑒定出31個(gè)化合物，包括根皮苷、牡荊苷、柚皮苷和虎杖苷等黃酮類化合物，奎寧酸、蘋果酸和檸檬酸等有機(jī)酸，天冬氨酸和絲氨酸等氨基酸以及維生素B2等等。研究表明，檸檬果汁中含量豐富的黃酮類化合物，如柚皮苷和根皮苷[12-13]，以及有機(jī)酸，如奎寧酸[14]、蘋果酸[15]和檸檬酸[16]等，均可有效清除自由基，這預(yù)示著檸檬果汁也具有良好的抗氧化活性，因此，本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平進(jìn)一步研究了檸檬果汁對(duì)高脂誘導(dǎo)L-02肝細(xì)胞氧化損傷的改善作用。

表1 檸檬果汁經(jīng)HPLC-MS/MS鑒定的主要成分Table 1 Main components of lemon juice analyzed by HPLC-MS/MS

2.2 檸檬果汁對(duì)L-02細(xì)胞活性的影響

不同質(zhì)量濃度(0.1、1.0、2.0和3.0 mg/mL)的檸檬果汁對(duì)L-02細(xì)胞的活性影響如圖1所示。由圖1可知，當(dāng)ρ(檸檬果汁)<2.0 mg/mL時(shí)，對(duì)細(xì)胞的活力沒有顯著的影響，ρ(檸檬果汁)>3.0 mg/mL時(shí)，細(xì)胞活力顯著降低。因此，后續(xù)試驗(yàn)均采用質(zhì)量濃度1.0 mg/mL開展。

圖1 檸檬果汁對(duì)L-02細(xì)胞活性的影響Fig.1 Effect of lemon juice on the cellular activity of L-02

2.3 檸檬果汁對(duì)高脂誘導(dǎo)L-02細(xì)胞中ROS水平的影響

由圖2可知，高脂處理24 h可顯著增加L-02細(xì)胞中ROS的水平，表現(xiàn)為熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，與1 mg/mL的檸檬果汁共孵育，L-02細(xì)胞中ROS的水平明顯降低，與空白組幾乎沒有顯著性差異，表明檸檬果汁可顯著減少細(xì)胞中ROS的積累，緩解高脂誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷，發(fā)揮有效的抗氧化活性。

圖2 檸檬果汁對(duì)L-02細(xì)胞中ROS水平的影響Fig.2 Effect of lemon juice on the ROS level in L-02

2.4 檸檬果汁對(duì)L-02細(xì)胞中SOD活性的影響

由圖3可知，與空白組相比，高脂處理組L-02細(xì)胞中SOD酶的活力下降了47.9%，僅為43.84 U/mg protein，而與檸檬果汁共孵育后，SOD酶的活性大大提升，恢復(fù)至76.71 U/mg protein。說明檸檬果汁可顯著提高L-02細(xì)胞中SOD酶的活性，從而加快對(duì)ROS的清除作用。

圖3 檸檬果汁對(duì)L-02細(xì)胞中SOD酶活力的影響Fig.3 Effect of lemon juice on the activity of SOD in L-02

2.5 檸檬果汁對(duì)L-02細(xì)胞中線粒體數(shù)量的影響

分別選用ND1和nuclear18S基因作為標(biāo)記表示細(xì)胞中mtDNA和總DNA(tDNA)的含量，然后采用qRT-PCR進(jìn)行定量檢測(cè)。由圖4可知，與空白組相比，高脂處理可顯著減少L-02細(xì)胞中線粒體的數(shù)量，而檸檬果汁處理對(duì)細(xì)胞中線粒體的數(shù)量具有明顯的提升。維持線粒體的正常功能可顯著減少細(xì)胞中ROS的積累，新生成的線粒體可高效完成ROS的清除[17]。因此，檸檬果汁處理促進(jìn)L-02細(xì)胞中線粒體的合成，可有效降低ROS的生成和積累。

圖4 檸檬汁處理對(duì)L-02細(xì)胞中線粒體數(shù)量的影響Fig.4 Effect of lemon juice on the number of mitochondrion in L-02

2.6 檸檬果汁對(duì)L-02細(xì)胞中SOD2表達(dá)量和活性的影響

圖5 檸檬果汁對(duì)L-02細(xì)胞中SOD2酶表達(dá)量的影響Fig.5 Effect of lemon juice on the expression of SOD2 in L-02

3 結(jié)論

本研究采用HPLC-MS/MS對(duì)檸檬果汁中的主要成分進(jìn)行了分析，鑒定出了31個(gè)化合物，包括根皮苷、牡荊苷、柚皮苷和虎杖苷等黃酮類化合物，奎寧酸、蘋果酸和檸檬酸等有機(jī)酸，天冬氨酸、絲氨酸等氨基酸和維生素B2等。同時(shí)，檸檬果汁處理可通過促進(jìn)細(xì)胞中的線粒體合成和恢復(fù)SOD2蛋白的表達(dá)量，提高SOD酶的活性，從而減少細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生與積累，發(fā)揮抗氧化活性，有效改善高脂誘導(dǎo)的L-02肝細(xì)胞氧化損傷。本研究結(jié)果表明，檸檬果汁中含有豐富的抗氧化活性成分，在細(xì)胞中可通過激活抗氧化酶活性，發(fā)揮自由基清除能力，為提升檸檬果汁的功能價(jià)值提供了有效的參考。