王楠，田晗，張文曉，白筱翠，肖純凌

(環(huán)境與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院)，遼寧 沈陽(yáng)，110034)

呼吸道感染仍然是全球關(guān)注的健康問(wèn)題，具有多發(fā)性且易反復(fù)，臨床多采用抗生素治療。但是抗生素的使用可能會(huì)導(dǎo)致呼吸道菌群豐度和多樣性的下降，從而增加致病菌定植的危險(xiǎn)[1]，同時(shí)致使各種耐藥菌不斷出現(xiàn)，為臨床感染治療帶來(lái)極大的挑戰(zhàn)。而“細(xì)菌療法”可以為預(yù)防或治療細(xì)菌感染提供一種有效的替代抗生素的方法。“細(xì)菌療法”是指通過(guò)使用益生菌干擾病原體的一種新的治療手段[2]。益生菌是一類攝入適當(dāng)劑量后對(duì)宿主健康有益的“活的微生物”的總稱，被廣泛應(yīng)用于食品、畜牧等領(lǐng)域[3-4]。益生菌通?？煞?大類：乳桿菌類、雙歧桿菌類、革蘭氏陽(yáng)性球菌類。益生菌的作用機(jī)制主要是通過(guò)分泌抗菌物質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、形成益生菌膜等干擾或抑制病原菌的生長(zhǎng)[5]。益生菌作為抗生素的有效替代品，有助于重建菌群平衡，同時(shí)防止或減少致病菌的黏附和定植機(jī)會(huì)[6]。大量研究結(jié)果表明，益生菌在調(diào)節(jié)人體微生態(tài)平衡、治療腸道疾病[7]、預(yù)防過(guò)敏性疾病[8]等多個(gè)方面發(fā)揮重要作用。目前,對(duì)腸道益生菌產(chǎn)品的研究最廣泛[9]，對(duì)呼吸道益生菌的開(kāi)發(fā)和利用尚不足。因此，有學(xué)者提出篩選健康人群口咽部正常菌群中的優(yōu)勢(shì)菌作為研究呼吸道益生菌的候選菌株[10]。甲型鏈球菌如唾液鏈球菌、緩征鏈球菌、口腔鏈球菌等是定植在人體上呼吸道的正常菌群，在健康兒童口咽部菌群中占主導(dǎo)地位[11-12]。研究表明，甲型鏈球菌在體內(nèi)外對(duì)致病菌具有明顯的拮抗作用[13]。BIDOSSI等[14]發(fā)現(xiàn)唾液鏈球菌 24SMB和口腔鏈球菌 89A具有抑制所選病原體的生物膜形成的能力。王沖等[15]通過(guò)小鼠模型證實(shí)甲型鏈球菌能抑制病原菌在黏膜上皮細(xì)胞定植,保護(hù)小鼠呼吸道的菌群平衡。ROOS等[16]用甲型鏈球菌協(xié)同抗生素治療咽炎和中耳炎，可以有效的降低復(fù)發(fā)率。這些研究都表明甲型鏈球菌作為呼吸道的優(yōu)勢(shì)菌群，在維護(hù)上呼吸道菌群平衡，防治呼吸道感染等方面具有重要作用。

甲型鏈球菌作為良好呼吸道益生菌的候選菌株，其安全性也是關(guān)注的熱點(diǎn)。但是目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于鏈球菌的安全性評(píng)價(jià)沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)和方法，目前相關(guān)性研究都是從耐藥性、毒力基因和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等方面進(jìn)行評(píng)價(jià)的。本課題組在健康兒童口咽部通過(guò)分離篩選得到了2株對(duì)金黃色葡萄球菌等多種致病菌具有拮抗作用的甲型鏈球菌，通過(guò)急性毒性實(shí)驗(yàn)，細(xì)菌移位能力評(píng)價(jià)及抗生素敏感性檢測(cè)，對(duì)2株益生菌進(jìn)行體內(nèi)外安全性初步評(píng)價(jià)，以期為人源性呼吸道益生菌制劑的開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株與動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)菌株1-4和4-2均為通過(guò)健康兒童口咽部菌群分離篩選后得到的具有廣譜拮抗作用的菌株。

動(dòng)物為SPF級(jí)昆明種小鼠(雌雄各半)，由遼寧省長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司提供。生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(遼)2 015-0001。本研究嚴(yán)格遵守沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物護(hù)理與實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審查和批準(zhǔn)的要求進(jìn)行,動(dòng)物倫理實(shí)驗(yàn)編號(hào)為2015052902。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株處理

將菌株接種于含有5%脫纖維羊血的BHI營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h對(duì)其進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。無(wú)菌條件下，刮取菌落溶于無(wú)菌生理鹽水中，配制菌體濃度為1×108、1×109、1×1010CFU/mL，制備為低、中、高劑量的口服菌懸液，用于急性毒性實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 動(dòng)物分組與飼養(yǎng)

SPF級(jí)昆明種小鼠，體重為(20±2) g，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，按照隨機(jī)分組原則分為7組，每組雌雄各5只，分別為生理鹽水對(duì)照組，菌株1-4高劑量組，菌株1-4中劑量組，菌株1-4低劑量組，菌株4-2高劑量組，菌株4-2中劑量組，菌株4-2低劑量組。實(shí)驗(yàn)期間小鼠同室分籠喂養(yǎng)，自由采光和飲水。

1.2.3 急性毒性實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)參照GB 15193.3—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)》和《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范2003版》的要求進(jìn)行操作。適應(yīng)飼養(yǎng)結(jié)束后，實(shí)驗(yàn)組小鼠給予口服相應(yīng)濃度的菌懸液處理，對(duì)照組小鼠給予生理鹽水口服處理，劑量為2 mL，口服1次。7 d內(nèi)連續(xù)觀察小鼠的活動(dòng)狀態(tài)，毒性跡象以及死亡情況，每天對(duì)小鼠的體重和采食量進(jìn)行稱重記錄。結(jié)束后稱重并用頸椎脫臼法處死小鼠，進(jìn)行解剖檢查，計(jì)算心、肝、脾、肺、腎的臟器指數(shù)。

1.2.4 細(xì)菌移位實(shí)驗(yàn)

無(wú)菌操作取小鼠心、肝、脾、肺、腎臟器的組織各1 g勻漿，用無(wú)菌L棒涂布于含有5%脫纖維羊血的BHI瓊脂平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h后，觀察是否出現(xiàn)特征菌落。

1.2.5 耐藥性檢測(cè)

選取10種常見(jiàn)的抗生素藥敏紙片包括萬(wàn)古霉素、利奈唑胺、氨芐西林、紅霉素、青霉素、氯霉素、克林霉素、頭孢噻肟、頭孢曲松。采用藥敏紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)。配制0.5麥?zhǔn)系木鷳乙?，?00 μL的菌懸液涂布于MH固體培養(yǎng)基待完全吸收后，將藥敏紙片放在培養(yǎng)基上，靜置15 min后，放入細(xì)菌培養(yǎng)箱37 ℃倒置培養(yǎng)24 h后，測(cè)量并記錄抑菌圈直徑。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性實(shí)驗(yàn)

2.1.1 小鼠體重和采食量

不同菌株口服急性毒性實(shí)驗(yàn)期間，未出現(xiàn)小鼠死亡情況，小鼠皮毛、飲水、軀體活動(dòng)和行為模式均表現(xiàn)正常，未發(fā)現(xiàn)急性中毒體征和相關(guān)的毒性反應(yīng)。體重和采食量急性毒性實(shí)驗(yàn)中重要的判斷指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，菌株1-4和4-2不同劑量組小鼠的體重增長(zhǎng)趨勢(shì)正常(圖1和圖2)，與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

圖1 菌株1-4小鼠體重增長(zhǎng)趨勢(shì)Fig.1 Changes in body weight of strains 1-4 in mice

圖2 菌株4-2小鼠體重增長(zhǎng)趨勢(shì)Fig.2 Changes in body weight of strains 4-2 in mice

對(duì)給予口服菌株1-4和4-2處理后7 d內(nèi)小鼠的平均采食量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表1所示。菌株1-4和4-2口服對(duì)雄性小鼠的采食量無(wú)影響(F=0.903，P=0.454；F=0.283,P=0.599)，口服菌株1-4和4-2的雌性小鼠7 d內(nèi)的平均采食量較對(duì)照組相比有不同程度的降低，但與對(duì)照組相比無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=0.56,P=0.457,F=0.781,P=0.068)。實(shí)驗(yàn)表明口服菌株1-4和4-2對(duì)小鼠的體重和進(jìn)食量沒(méi)有影響。

表1 給藥后各組小鼠采食量Table 1 Feed intake of each group after administration

2.1.2 臟器指數(shù)變化

7 d實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)小鼠進(jìn)行解剖，肉眼觀察并未發(fā)現(xiàn)心、肝、脾、肺、腎等臟器異常，用生理鹽水清洗稱重后，計(jì)算臟器指數(shù)，結(jié)果如表2所示。經(jīng)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)口服不同菌株的小鼠臟器指數(shù)與生理鹽水對(duì)照組均無(wú)顯著性差異。(P>0.05)。說(shuō)明菌株1-4和4-2對(duì)小鼠主要內(nèi)臟器官無(wú)有害影響。

表2 臟器指數(shù)Table 2 Viscera index

2.2 細(xì)菌移位實(shí)驗(yàn)

取小鼠心、肝、脾、肺、腎臟器組織勻漿，涂布于含有5%脫纖維羊血的BHI瓊脂平板上，經(jīng)37 ℃倒置培養(yǎng)24 h后未觀察到與菌株1-4和菌株4-2相似的灰白色，針尖樣大小的α溶血性鏈球菌菌落。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明小鼠口服菌株1-4和4-2后，沒(méi)有發(fā)生細(xì)菌移位生長(zhǎng)的現(xiàn)象。

2.3 耐藥性檢測(cè)

本試驗(yàn)檢測(cè)了菌株1-4和4-2對(duì)常見(jiàn)10種抗生素的敏感性，參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)M100 S27標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示兩株菌對(duì)大部分抗生素具有較高的敏感性，菌株1-4對(duì)頭孢曲松表現(xiàn)為抗性，4-2菌株對(duì)紅霉素具有抗性，具體結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 菌株耐藥性結(jié)果Table 3 Results of bacterial strain resistance

有研究表明大多數(shù)甲型鏈球菌可以合成核糖體甲基化酶，使23S rRNA的特定腺嘌呤甲基化從而阻斷大環(huán)內(nèi)酯類藥物與核糖體的結(jié)合，鏈球菌屬多個(gè)菌株對(duì)紅霉素等大環(huán)內(nèi)酯類藥物具有普遍耐受性。

3 結(jié)論與討論

目前人們對(duì)腸道益生菌產(chǎn)品研究最廣泛，對(duì)呼吸道益生菌的開(kāi)發(fā)和利用尚不足。甲型鏈球菌作為口咽部菌株的主要定植者，可以分泌細(xì)菌素或抗菌肽等抑菌產(chǎn)物來(lái)抑制有害菌的生長(zhǎng)且具有較好的黏附力，是人類口服益生菌的良好候選菌[17]。本研究在健康兒童口咽部經(jīng)過(guò)分離篩選后得到2株對(duì)金黃色葡萄球菌等多個(gè)致病菌具有抑菌作用的甲型鏈球菌，但其安全性還需要進(jìn)行初步的評(píng)價(jià)。

動(dòng)物模型是評(píng)價(jià)益生菌安全性的常用手段，為期7 d的急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，口服不同劑量的益生菌實(shí)驗(yàn)期間，小鼠生理狀態(tài)正常，未發(fā)現(xiàn)死亡和急性中毒體征。各組小鼠的體重均有增加，體重增長(zhǎng)趨勢(shì)與采食量的變化相吻合。小鼠體重和采食量的變化，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果表明口服2株菌對(duì)小鼠的健康指標(biāo)無(wú)負(fù)面影響。解剖后，心、肝、脾、肺、腎主要內(nèi)臟器官均無(wú)異常，各實(shí)驗(yàn)組臟器指數(shù)與生理鹽水對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。益生菌移位可能引發(fā)感染，包括菌血癥、敗血癥或心內(nèi)膜炎等[18]，因此細(xì)菌移位生長(zhǎng)能力也是評(píng)級(jí)益生菌安全性的重要指標(biāo)，小鼠的臟器組織勻漿在BHI營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板經(jīng)培養(yǎng)后，未發(fā)現(xiàn)與菌株1-4和4-2相同的灰白色，針尖樣大小的菌落，證實(shí)2株菌在小鼠體內(nèi)不會(huì)發(fā)生細(xì)菌移位生長(zhǎng)現(xiàn)象，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，口服2株益生菌對(duì)小鼠無(wú)毒性作用。益生菌安全性另一個(gè)非常重要的方面是其耐藥性，肉湯稀釋法和紙片擴(kuò)散法常用來(lái)檢測(cè)菌株的藥物敏感性，肉湯稀釋法能夠準(zhǔn)確的檢測(cè)最低殺菌濃度和最低抑菌濃度,但操作繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。K-B紙片擴(kuò)散法操作起來(lái)相對(duì)簡(jiǎn)便且成本小，因此成為目前評(píng)價(jià)抗生素敏感性應(yīng)用最多的藥敏方法[19]。本研究通過(guò)紙片擴(kuò)散法評(píng)價(jià)2株菌對(duì)常見(jiàn)抗生素的敏感性，參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)M100 S27標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。結(jié)果顯示2菌株對(duì)大多數(shù)抗生素具有高度敏感性，菌株4-2和1-4分別對(duì)紅霉素和頭孢曲松表現(xiàn)為低敏感性，但沒(méi)有提取耐藥質(zhì)粒。本研究選取的是呼吸道疾病常用的抗生素，對(duì)其他的抗生素是否具有抗性在后續(xù)研究應(yīng)當(dāng)補(bǔ)充。

綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，甲型鏈球菌1-4和4-2被證實(shí)對(duì)小鼠無(wú)急性毒性作用，表現(xiàn)為較高的移位安全性，對(duì)多數(shù)常見(jiàn)抗生素普遍敏感，初步表明具有良好的安全性，為其日后的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。但是為了提供更加全面的安全性評(píng)價(jià)，在接下來(lái)的研究中，我們應(yīng)該繼續(xù)研究其毒力基因，異常代謝以及慢性毒性實(shí)驗(yàn)等，進(jìn)一步驗(yàn)證其作為呼吸道益生菌的安全性。