王 媛， 王雁萍， 趙珊珊， 楊逢源， 郝湘妹， 范小苗*

（1.鄭州大學(xué)物理學(xué)院，河南省離子束生物工程省重點(diǎn)試驗(yàn)室，河南鄭州450000；2.鄭州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南省離子束生物工程省重點(diǎn)試驗(yàn)室，河南鄭州450000）

苜蓿（Medicago sativa）是世界上種植面積最大的栽培植物性蛋白粗飼料（馬召穩(wěn)，2019），葉片中含有較高含量的粗蛋白質(zhì)以及各種必需氨基酸和多種維生素，有“牧草之王”的美譽(yù)（王星凌等，2015）。 苜蓿干草是苜蓿生產(chǎn)的主要產(chǎn)品，但在我國(guó)淮河及一些南方地區(qū)， 苜蓿收獲時(shí)正值雨熱同期， 晾曬過(guò)程中由于雨淋等因素會(huì)造成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的流失，難以曬至優(yōu)質(zhì)干草（楊玉璽等，2017）。 青貯苜蓿的制作受不利環(huán)境的影響較小， 且易于機(jī)械化操作，可有效降低田間損失（劉輝，2015），此外青貯苜蓿柔軟多汁、氣味芳香、適口性較好，各類家畜均喜食（侯健健等，2016）。但苜蓿原料可溶性碳水化合物含量及附著乳酸菌含量不足， 青貯過(guò)程中無(wú)法有效抑制不良微生物的活動(dòng)， 易導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)成分流失，降低發(fā)酵品質(zhì)（史卉玲等，2013）。乳酸菌作為青貯添加劑可有效增加青貯飼料初期發(fā)酵時(shí)的乳酸菌數(shù)量， 保證青貯飼料盡快進(jìn)入乳酸發(fā)酵階段（李旭嬌等，2014）。 因此，可以通過(guò)添加乳酸菌青貯來(lái)提高青貯苜蓿的發(fā)酵品質(zhì)。

微生物在青貯過(guò)程中的作用十分重要， 同時(shí)還受到添加劑的種類、 青貯條件以及附生微生物等因素的影響（Guan 等，2018；Kasmaei 等，2017）。目前， 隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷完善以及測(cè)試費(fèi)用的降低， 高通量測(cè)序技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用到檢測(cè)包括青貯環(huán)境在內(nèi)的各種環(huán)境下的微生物組成（Adams 等，2017）。本文的目的是通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)， 探究乳酸菌作為青貯添加劑對(duì)苜蓿青貯細(xì)菌菌群和發(fā)酵品質(zhì)的影響， 并對(duì)細(xì)菌菌群與發(fā)酵品質(zhì)間的相關(guān)性進(jìn)行初步探究。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及菌株 紫花苜蓿：河南省鄭州市（34.76 °N，113.65 °E；海拔110.4 m）刈割的初花期紫花苜蓿。萎焉至合適含水量后用鍘刀切為1 ～2 cm 的碎飼料。乳酸菌：乳酸菌YX（臺(tái)灣亞新生物科技股份有限公司）或ZZU A341（山西苜蓿附生菌株）在MRS 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，8000 r/min離心10 min， 調(diào)整細(xì)菌懸液OD600值為0.80 待用（菌落數(shù)約為1×106cfu/mL）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)共分為3 個(gè)處理組：無(wú)添加劑對(duì)照組（CK 組）和分別添加1×106cfu/g 乳酸菌YX （LPI 組）、乳 酸菌ZZU A341 （LPA 組）。 約500 g 碎飼料與5 mL 細(xì)菌懸液（CK 組中需添加5 mL 無(wú)菌水）混合均勻，抽真空后在室溫（25 °C）下保存，各處理組設(shè)置三個(gè)重復(fù)樣本，青貯60 d 后測(cè)定其發(fā)酵指標(biāo)、 化學(xué)成分以及細(xì)菌菌群的組成和相對(duì)豐度。

1.3 青貯苜蓿樣品處理 苜蓿青貯60 d 后在超凈工作臺(tái)中拆袋處理， 各樣本充分混勻后共分為三份樣品。 第一份樣品將10 g 青貯苜蓿與90 mL無(wú)菌水混合均勻， 液體經(jīng)濾紙與4 層紗布過(guò)濾后收集于50 mL 白色密封瓶中， 保存在-20 °C 冰箱，用于測(cè)定有機(jī)酸、氨態(tài)氮等發(fā)酵指標(biāo)。 第二份樣品在60 °C 烘箱中烘干至恒重， 用打粉機(jī)粉碎后使用40 目篩子過(guò)濾，保存于干燥通風(fēng)處，用于測(cè)定樣品的干物質(zhì) （DM）、 可溶性碳水化合物（WSC）及游離糖成分等。 第三份樣品放入干凈的自封袋中保存在-20 °C 冰箱，用于提取樣品中細(xì)菌菌群DNA。

1.4 指標(biāo)測(cè)定及方法

1.4.1 發(fā)酵指標(biāo) 使用pH 計(jì)測(cè)量各樣本的pH，并對(duì)測(cè)量結(jié)果進(jìn)行記錄； 使用高效液相色譜法測(cè)定有機(jī)酸的含量和種類 （Schwartz 等，1977）；苯酚-次氯酸鈉比色法測(cè)定各樣本中氨態(tài)氮 （NH3-N）含量（Bolsem 等，1992）。

1.4.2 化學(xué)成分 使用AOAC 法測(cè)各樣品的干物質(zhì)（DM）含量；蒽酮-硫酸法（Murphy 等，1958）測(cè)定各樣品中可溶性碳水化合物（WSC）的含量；樣本中游離糖的測(cè)定采用離子交換色譜法（HPIC）。

1.4.3 細(xì)菌菌群 使用DNA 試劑盒D3350-02（Omega Biotek，Norcross，GA，USA）提取苜蓿青貯60 d 的細(xì)菌菌群DNA，質(zhì)量檢查合格后，利用高通量測(cè)序技術(shù)分析樣品中的細(xì)菌菌群。

表1 苜蓿原料特性

1.5 數(shù)據(jù)處理 用Excel 2013 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，IBM SPSS（23.0）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。運(yùn)用單因素ANOVA 方差分析法進(jìn)行差異顯著性分析。 用Mothur 方法與SILVA13（http://www.arb-silva.de/）的SSUrRNA 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行微生物物種注釋分析。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 苜蓿原料特性 青貯前苜蓿樣品的pH、DM、WSC、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、果糖、蔗糖、麥芽糖含量如表1 所示。 青貯前苜蓿樣品中未檢測(cè)到氨態(tài)氮和有機(jī)酸。

2.2 發(fā)酵指標(biāo) 由表2 可知， 青貯60 d，CK 組的pH、NH3-N 和乙酸含量顯著高于LPI 或LPA 組（P＜0.05），乳酸含量顯著（P＜0.05）低于LPI 或LPA 組。

表2 青貯60 d 苜蓿的發(fā)酵特性

2.3 化學(xué)成分 由表3 可知， 青貯60 d，CK 組的WSC、果糖含量顯著低于LPI 或LPA 組（P＜0.05）；鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖含量均低于LPI 組，顯著低于LPA 組（P＜0.05）；半乳糖、蔗糖含量顯著高于LPI 或LPA 組（P＜0.05）； 木糖含量高于LPI 組，LPA 組中未檢測(cè)到木糖。

2.4 細(xì)菌菌群 根據(jù)細(xì)菌注釋結(jié)果，選取門水平和屬水平上相對(duì)豐度大于1%的細(xì)菌菌群， 用于分析各處理組間細(xì)菌菌群組成。 結(jié)果表明，苜蓿原料中相對(duì)豐度較高的細(xì)菌菌群有Cyanobacteria/Choroplast 門（36.46%）、Proteobacteria門（31.27%）、Actinobacteria門（18.88%）以及Firmicutes門（11.56%）；青貯60 d 后，各處理組中Firmicutes門相對(duì)豐度均增加，成為優(yōu)勢(shì)菌門。 屬水平上細(xì)菌菌群組成，苜蓿原料中相對(duì)豐度較高的細(xì)菌菌群有Streptophyta屬（36.37%）、Massilia屬（13.68%）； 青貯后，CK 組或LPI 組的優(yōu)勢(shì)菌屬為Pediococcus屬 （56.40%、98.63%），LPA 組為L(zhǎng)actobacillus屬（98.88%）。

表3 青貯60 d 苜蓿的化學(xué)成分

3 討論

青貯原料的DM 含量是影響青貯過(guò)程和品質(zhì)的重要因素之一，DM 含量高于30%可有效降低梭菌發(fā)酵的風(fēng)險(xiǎn)（劉輝，2015）；郭玉琴等（2005）研究表明， 含水量在60%左右植物細(xì)胞質(zhì)的滲透壓較高，對(duì)腐生菌、酪酸菌等會(huì)造成一定的生理干燥狀態(tài)，可有效抑制異常發(fā)酵，與本文青貯60 d 各處理組均未檢測(cè)到丁酸的結(jié)果相符。 氨態(tài)氮是青貯過(guò)程中蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)物， 含量越高表明青貯過(guò)程中蛋白質(zhì)降解越多，發(fā)酵品質(zhì)越差，而且會(huì)影響動(dòng)物的采食量和飼料利用率（李艷芬等，2020）。 乳酸菌作為發(fā)酵促進(jìn)型添加劑可提高青貯飼料的乳酸含量，降低pH 和氨態(tài)氮含量（劉輝等，2015）；張金霞等（2014）報(bào)道，添加乳酸菌有利于青貯環(huán)境中pH 的降低。本試驗(yàn)中LPI 或LPA 組乳酸積累量顯著高于CK 組，pH 和氨態(tài)氮含量顯著低于CK 組，且pH 均降至5.00 以下， 表明乳酸菌作為青貯添加劑可有效提高青貯苜蓿的發(fā)酵品質(zhì)。

細(xì)菌菌群的組成對(duì)苜蓿發(fā)酵品質(zhì)有顯著影響。McElhiney 等（2001）稱Cyanobacteria能夠產(chǎn)生導(dǎo)致細(xì)胞死亡的微囊藻毒素， 青貯60 d 后，Cyanobacteria/Choroplast門的相對(duì)豐度降低，可有效降低其產(chǎn)生的不利影響。 青貯后Firmicutes門成為各處理組中的優(yōu)勢(shì)菌門， 與Eikmeyer（2013）、Keshri 等（2018）研究結(jié)果一致。本試驗(yàn)中，CK 組或LPI 組的優(yōu)勢(shì)菌屬為Pediococcus屬，Lactobacillus屬是LPA 組的優(yōu)勢(shì)菌屬，Li 等（2019）研究報(bào)道稱Pediococcus屬對(duì)低pH 的耐受性低于Lactobacillu屬，與本試驗(yàn)LPA 組具有較低的pH 相符。WSC 是青貯過(guò)程中微生物發(fā)酵的主要底物， 充足的WSC含量是保證發(fā)酵過(guò)程中有益微生物正常繁殖代謝的關(guān)鍵因素之一（Daniel 等，2013）。 添加蔗糖青貯可加速乳酸發(fā)酵，快速降低青貯環(huán)境的pH，改善發(fā)酵品質(zhì)（王亞楠，2017 ）。 本試驗(yàn)中，青貯后各處理組中蔗糖含量與青貯前相比均呈下降趨勢(shì)，CK 組顯著高于LPI 組或LPA 組，可能是乳酸發(fā)酵不足，底物殘留量較多， 與其具有較低的乳酸積累量相符。乳酸菌添加劑具有分解纖維素或半纖維素的潛力， 能夠改善青貯過(guò)程中的WSC 及單糖含量不足的問(wèn)題，本研究青貯60 d 后，LPA 組的葡萄糖含量顯著高于CK 組或LPI 組，可能與其具有一定的纖維分解能力有關(guān)（王媛等，2020；Guo 等，2019）。 綜上所述，乳酸菌作為青貯添加劑能夠通過(guò)調(diào)控青貯過(guò)程中細(xì)菌菌群的組成或相對(duì)豐度，進(jìn)而達(dá)到改善其發(fā)酵品質(zhì)的目的。