何海燕， 付 躍， 覃擁靈

（1.河池學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西宜州546300；2.河池學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用研究中心，廣西宜州546300）

餅粕類(lèi)飼料原料中添加果膠酶對(duì)肉雞回腸氨基酸消化率和代謝能有促進(jìn)作用；高纖維飼糧中添加果膠酶對(duì)鵝生長(zhǎng)性能、屠宰性能及肉品質(zhì)也有良好影響；日糧中添加適量的果膠酶制劑能夠有效地提高鵝對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收率。研究表明，果膠酶可作為一種綠色飼料添加劑（毛倩倩等，2013；王寶維等，2011；荊麗珍等，2007；許毅，2004）?？壗z廢水是繅絲廠制絲過(guò)程中產(chǎn)生的主要排放物（王家德等，2002），隨著養(yǎng)蠶業(yè)和繅絲工業(yè)的快速發(fā)展， 繅絲廢水的排放量不斷增加，直接排放的廢水會(huì)因其含有豐富的有機(jī)物而對(duì)河道產(chǎn)生較大污染 （石華月等，2019； 杜元源等，2017）。已有的研究大多側(cè)重于絲膠蛋白質(zhì)的回收利用，對(duì)廢水回收利用的研究則較少，隨著我國(guó)水資源的缺失及政府對(duì)水資源保護(hù)的重視，繅絲廠用水成本逐漸增加，繅絲廢水的再利用已經(jīng)成為繅絲廠降低成本、提高經(jīng)濟(jì)收入的重要環(huán)節(jié)（黃繼偉等，2013；孔育國(guó)，2007）。 為充分利用繅絲廢水無(wú)毒、 富含絲膠等高分子蛋白有機(jī)物，氮和磷含量較高的特點(diǎn)（黃予奕，2018），本研究在前期菌種篩選誘變的基礎(chǔ)上，開(kāi)展了以繅絲廢水為主要發(fā)酵原料生產(chǎn)果膠酶的試驗(yàn)，初步優(yōu)化了發(fā)酵產(chǎn)酶工藝，以期為繅絲廢水的處理及循環(huán)利用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 沙福芽孢桿菌 （Bacillus safensis），編號(hào)G7-7，前期試驗(yàn)篩選誘變保藏。 發(fā)酵原料繅絲廢水由廣西嘉聯(lián)絲綢廠提供，放置于冰柜，4 ℃冷藏備用。

1.2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基：1.5%蛋白胨，0.5%酵母膏，1%氯化鈉，瓊脂2%。種子培養(yǎng)基：蔗糖1 g，酵母粉0.5 g， 氯化鈉0.1 g 溶于100 mL 繅絲廢水，pH 9.0。發(fā)酵培養(yǎng)基：桔皮粉5 g，蔗糖5 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鐵0.2 g，溶于1000 mL 繅絲廢水，pH 9.0。

1.3 主要儀器 ZWY-2102 型立式全溫度恒溫?fù)u床 （上海上海智城分析儀器制造有限公司），TDL-5-A 大容量離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），infinite M200PRO 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 （上海精密科學(xué)儀器有限公司），PHS-3B 型pH 儀（上海精密科學(xué)儀器有限公司），PXY-DHS-400BS 型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）。

1.4 粗酶液制備 保藏菌種斜面活化后取2 環(huán)轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基，30 ℃恒溫培養(yǎng)1 d，再按10%接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中， 搖床150 r/min、30 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，發(fā)酵結(jié)束后取發(fā)酵液離心，上清液即為提取的粗酶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 果膠酶酶活力測(cè)定 3，5-二硝基水楊酸（DNS）法，參考王小敏等（2007）的方法適當(dāng)改良，配制0.4%的果膠底物溶液，50 ℃水浴反應(yīng)30 min后，加3 mL DNS 終止反應(yīng)，沸水浴10 min，流水冷卻后定容至15 mL， 搖勻，540 nm 波長(zhǎng)測(cè)定吸光值。 在上述反應(yīng)條件下，每分鐘催化果膠底物產(chǎn)生1.0 μmol 半乳糖醛酸所需要的酶量定義為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.6 產(chǎn)酶條件優(yōu)化

1.6.1 單因素試驗(yàn) 選取接種量、 發(fā)酵培養(yǎng)基蔗糖添加量、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和不同誘導(dǎo)物6 個(gè)因素， 研究其對(duì)果膠酶產(chǎn)量的影響。

1.6.2 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果， 選取各因素中酶產(chǎn)量較顯著的水平設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)， 研究產(chǎn)酶條件的最佳組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響 接種量的大小會(huì)影響發(fā)酵培養(yǎng)基中菌體數(shù)量的多少， 進(jìn)而影響菌體的生理狀況及代謝產(chǎn)物的合成（劉冬，2015），因此也是發(fā)酵工藝重點(diǎn)考察的因素。 本研究按不同接種量把種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)液考察接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖1，當(dāng)接種量為14%時(shí)，單位體積的酶活力最高，后繼試驗(yàn)接種量為14%。

2.1.2 發(fā)酵培養(yǎng)基蔗糖添加量對(duì)產(chǎn)酶的影響 考慮到繅絲廢水中含有豐富的氮源而缺乏微生物生長(zhǎng)必需的碳源， 本試驗(yàn)研究在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加了一定量的蔗糖以促進(jìn)微生物菌體的增殖從而促進(jìn)酶的合成。 結(jié)果如圖2， 當(dāng)蔗糖添加量為9 g/1000 mL 繅絲廢水時(shí)，單位體積的酶活力最高。

圖1 接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響

圖2 發(fā)酵培養(yǎng)基蔗糖添加量對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.1.3 發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH 對(duì)產(chǎn)酶的影響 不同菌株對(duì)pH 的耐受能力也不同， 本試驗(yàn)所用菌株為前期試驗(yàn)從pH 較高的繅絲廢水中篩選誘變所得，試驗(yàn)結(jié)果顯示該菌株能耐受較高的pH， 在試驗(yàn)取值范圍內(nèi)，當(dāng)pH 為9.0 ～9.5 時(shí)，酶活力較高（圖3）。

圖3 發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH 對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.1.4 溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響 溫度不僅影響菌體生長(zhǎng)， 同時(shí)也極大影響產(chǎn)物合成及發(fā)酵液的理化性質(zhì)， 是發(fā)酵中重點(diǎn)控制的因素， 本試驗(yàn)結(jié)果顯示（圖4），溫度為30 ～39 ℃時(shí)，單位體積發(fā)酵液的酶活力變化不大，說(shuō)明溫度對(duì)產(chǎn)酶影響不顯著，該菌株能適應(yīng)較寬的溫度變化。

2.1.5 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響 如圖5 所示，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活力逐漸增強(qiáng)，培養(yǎng)到84 h 時(shí)酶活最高，隨后培養(yǎng)液中養(yǎng)料被耗盡，菌體生長(zhǎng)緩慢，細(xì)胞發(fā)生自溶，酶活力又呈下降趨勢(shì)。

圖4 溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

圖5 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.1.6 不同誘導(dǎo)物對(duì)產(chǎn)酶的影響 添加誘導(dǎo)物是提高酶產(chǎn)量的主要措施之一， 試驗(yàn)參考文獻(xiàn)及結(jié)合地方豐富農(nóng)業(yè)廢棄物資源選取了富含果膠質(zhì)的蠶沙、菠蘿皮、橘皮粉、麩皮、米糠作為產(chǎn)酶誘導(dǎo)物添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中， 比較不同誘導(dǎo)物對(duì)產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖6 所示，在添加量都為5%的試驗(yàn)條件下，蠶沙的產(chǎn)酶效果優(yōu)于其他誘導(dǎo)物。

圖6 不同誘導(dǎo)物對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇接種量、發(fā)酵液蔗糖添加量、發(fā)酵液初始pH、發(fā)酵時(shí)間四個(gè)因素， 利用正交設(shè)計(jì)助手Ⅱv3.1 設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，研究最優(yōu)發(fā)酵條件組合，試驗(yàn)因素水平表和結(jié)果見(jiàn)表1 ～3。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表L16（45）

表2 L16（45）正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析

表3 試驗(yàn)結(jié)果方差分析

由表1 和表2 分析得知，R值（極差）的大小排序依次為B＞D＞C＞A， 即對(duì)產(chǎn)酶影響最大的是蔗糖添加量，其次為發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵液初始pH和接種量，接種量影響最不顯著。 從表2 中K 值可知，最優(yōu)發(fā)酵組合為A4B4C4D2，即接種量16%，發(fā)酵液蔗糖添加量1.1%， 發(fā)酵液初始pH 9.5，發(fā)酵時(shí)間84 h。 由于正交設(shè)計(jì)表中沒(méi)有與此相同的發(fā)酵組合， 因此根據(jù)此發(fā)酵條件做三平行三重復(fù)追加試驗(yàn)，得到酶活均值為21.84 U/mL，是沒(méi)優(yōu)化之前果膠酶活力12.39 U/mL 的1.76 倍。 試驗(yàn)最后對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（表3）比較各因素的顯著性，結(jié)果顯示在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的4 個(gè)因素中，只有發(fā)酵液蔗糖添加量對(duì)產(chǎn)酶影響達(dá)到顯著水平。

3 結(jié)論

繅絲廢水可作為微生物發(fā)酵的良好材料。 本試驗(yàn)結(jié)果表明，沙福芽孢桿菌的最佳產(chǎn)酶條件為：以5%蠶沙為產(chǎn)酶誘導(dǎo)物， 發(fā)酵液蔗糖添加量1.1%，接種量16%，發(fā)酵液初始pH 9.5，36 ℃發(fā)酵84 h。在此優(yōu)化的發(fā)酵條件下，沙福芽孢桿菌果膠酶酶活達(dá)到21.84 U/mL。